Quantification basée sur la fluorescence du potentiel de membrane mitochondriale et des niveaux de superoxyde à l’aide de l’imagerie en direct dans les cellules HeLa

Summary

Cette technique décrit un flux de travail efficace pour visualiser et mesurer quantitativement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde dans les cellules HeLa à l’aide de l’imagerie en direct basée sur la fluorescence.

Abstract

Les mitochondries sont des organites dynamiques essentiels à l’homéostasie métabolique en contrôlant la production d’énergie via la synthèse de l’ATP. Pour soutenir le métabolisme cellulaire, divers mécanismes de contrôle de la qualité mitochondriale coopèrent pour maintenir un réseau mitochondrial sain. L’une de ces voies est la mitophagie, où la kinase 1 induite par PTEN (PINK1) et la phospho-ubiquitination Parkin des mitochondries endommagées facilitent la séquestration des autophagosomes et leur élimination ultérieure de la cellule par fusion des lysosomes. La mitophagie est importante pour l’homéostasie cellulaire, et les mutations de Parkin sont liées à la maladie de Parkinson (MP). En raison de ces résultats, l’accent a été mis sur l’étude des dommages mitochondriaux et du renouvellement pour comprendre les mécanismes moléculaires et la dynamique du contrôle de la qualité mitochondriale. Ici, l’imagerie de cellules vivantes a été utilisée pour visualiser le réseau mitochondrial des cellules HeLa, pour quantifier le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde après un traitement au cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone (CCCP), un agent de découplage mitochondrial. De plus, une mutation liée à la MP de Parkin (Parkin^T240R) qui inhibe la mitophagie parkine-dépendante a été exprimée pour déterminer comment l’expression mutante affecte le réseau mitochondrial par rapport aux cellules exprimant la parkine de type sauvage. Le protocole décrit ici décrit un flux de travail simple utilisant des approches basées sur la fluorescence pour quantifier efficacement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde.

Introduction

Le réseau mitochondrial est une série d’organites interconnectés qui jouent un rôle crucial dans la production d’énergie¹, l’immunité innée ^2,3 et la signalisation cellulaire ^4,5. La dysrégulation mitochondriale a été associée à des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (MP)^6,7. La MP est une maladie neurodégénérative progressive affectant les neurones dopaminergiques de la substance noire qui touche près de 10 millions de personnes dans....

Protocol

1. Préparation des échantillons biologiques

REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes en utilisant une technique stérile dans une enceinte de biosécurité. Pulvérisez la surface de l’armoire et tous les matériaux avec de l’éthanol à 70%.

1. Culture et transfection de cellules HeLa
   1. Culture de 30 000 cellules HeLa dans le milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 4,5 g/L de glucose additionné de 10 % de sérum fœtal bovin et de 1 % de solution de L-glutamine (milieu HeLa; voir le tableau des matières). Plaquer les cellules sur des antennes paraboliques d’imagerie à fond de verre de 35 mm (v....

Results

Dans ce protocole, une quantification basée sur la fluorescence a été utilisée pour mesurer le potentiel membranaire et les niveaux de superoxyde du réseau mitochondrial après le traitement CCCP (Figure 1). Ce flux de travail utilisait des cellules HeLa, une lignée cellulaire immortalisée dérivée du cancer du col de l’utérus. Les cellules HeLa sont couramment utilisées pour étudier la biologie mitochondriale et sont relativement plates, ce qui facilite la visualisation du réseau mitochondria.......

Discussion

Le flux de travail décrit ici peut être utilisé pour quantifier le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde de manière robuste et reproductible à l’aide de l’imagerie basée sur la fluorescence³⁰. Il y a d’importantes limites techniques à prendre en compte lors de la conception de ces expériences. Les cellules HeLa ont été transfectées avec un vecteur YFP vide, YFP-Parkin^WT ou YFP-Parkin^T240R. Le vecteur YFP vide a été utilisé comme témoin pour conf.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
>
CCCP (cyanure de carbone m-chlorophénylhydrazone)	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM (1x) avec 4,5 g/L de glucose	Gibco	11-965-084
DMSO, anhydre	ThermoFisher Scientific	D12345
Sérum de bovin fœtal	Hyclone	SH3007103
FuGENE 6 (réactif de tranfection)	Promega	E2691
GlutaMAX 100x (solution de L-glutamine)  ;	Gibco  ;	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX  ; Rouge  ;	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Deep Red	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM (milieu sérique réduit)	ThermoFisher scientific	31985070
Tétraméthylrhodamine, ester éthylique, perchlorate (TMRE)  ;	ThermoFisher Scientific	T669
Modèles expérimentaux : organismes/souches
HeLa-M (Homo sapiens)	A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)	N/A
Recombinant DNA
EYFP Vecteur vide	N/A	N/A
YFP-Parkin T240R	Cet article	a été généré par mutagenèse dirigée par site à partir de YFP-Parkin
YFP-Parkin WT	Addgene ; PMID :19029340	RRID :Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel (Tableur)	Microsoft Office  ;
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (statistiques Logiciel d’analyse)	Logiciel GraphPad	https://www.graphpad.com
Autre
Antenne parabolique de 35 mm, lamelle n° 1,5, diamètre du verre de 20 mm,	à cage MatTek	P35G-1.5-20-C
(chambre environnementale)	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Microscope inversé	Leica	N/A
LIGHTNING Logiciel de déconvolution	Leica	N/A
STELLARIS 8 microscope confocal	Leica	N/A