La contractilité de l’actomyosine joue un rôle important dans la morphogenèse des cellules et des tissus. Cependant, il est difficile de manipuler la contractilité de l’actomyosine in vivo de manière aiguë. Ce protocole décrit un système optogénétique qui inhibe rapidement la contractilité de l’actomyosine médiée par Rho1 dans les embryons de drosophile , révélant la perte immédiate de la tension épithéliale après l’inactivation de l’actomyosine in vivo.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Inhibition optogénétique de la contractilité de l’actomyosine médiée par Rho1 couplée à la mesure de la tension épithéliale chez les embryons de drosophile
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les forces contractiles générées par l’actine et la myosine II non musculaire (« contractilité de l’actomyosine ») sont essentielles pour les changements morphologiques des cellules et des tissus à plusieurs échelles de longueur, telles que la division cellulaire, la migration cellulaire, le repliement épithélial et la morphogenèse ramifiée. Une compréhension approfondie du rôle de la contractilité de l’actomyosine dans la morphogenèse nécessite des approches qui permettent l’inactivation rapide de l’actomyosine, ce qui est difficile à réaliser avec les approches génétiques ou pharmacologiques conventionnelles. Le protocole présenté démontre l’utilisation d’un système de dimérisation optogénétique basé sur CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, pour inhiber la contractilité de l’actomyosine dans les embryons de drosophile avec des contrôles temporels et spatiaux précis. Dans ce système, CRY2 est fusionné à la forme négative dominante de Rho1 (Rho1DN), tandis que CIBN est ancré à la membrane plasmique. La dimérisation médiée par la lumière bleue de CRY2 et de CIBN entraîne une translocation rapide de Rho1DN du cytoplasme à la membrane plasmique, où il inactive l’actomyosine en inhibant Rho1 endogène. De plus, cet article présente un protocole détaillé pour le couplage de l’inactivation de l’actomyosine médiée par l’Opto-Rho1DN avec l’ablation au laser afin d’étudier le rôle de l’actomyosine dans la génération de tension épithéliale lors de la formation du sillon ventral chez la drosophile . Ce protocole peut être appliqué à de nombreux autres processus morphologiques qui impliquent la contractilité de l’actomyosine chez les embryons de drosophile avec des modifications minimales. Dans l’ensemble, cet outil optogénétique est une approche puissante pour disséquer la fonction de contractilité de l’actomyosine dans le contrôle de la mécanique tissulaire lors du remodelage tissulaire dynamique.
Introduction
La contractilité de l’actomyosine, la force contractile exercée par la myosine II non musculaire (ci-après « myosine ») sur le réseau F-actine, est l’une des forces les plus importantes dans la modification de la forme cellulaire et la morphogenèse au niveau tissulaire 1,2. Par exemple, l’activation de la contractilité de l’actomyosine au niveau du domaine apical des cellules épithéliales entraîne une constriction apicale, ce qui facilite divers processus morphogénétiques, notamment le repliement épithélial, l’extrusion cellulaire, la délamination et la cicatrisation des plaies 3,4,5,6,....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Mise en place du croisement génétique et préparation du gobelet de collecte des ovules
- Sélectionner les mouches femelles (vierges) de la lignée optogénétique UASp-CIBNpm (I) ; UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) sur un tampon de CO2 sous un stéréomicroscope et mise en place d’un croisement avec des mouches mâles de la lignée maternelle GAL4 67 Sqh-mCherry ; 15 E-cadhérine-GFP.
NOTE : Les 67 et 15 représentent la tubuline maternelle-GAL4 insérée dans les deuxième (II) et troisième (III) chromosomes, respectivement52. La lignée GAL4 utilisée dans ce protocole exprime également la chaîne légère régulatrice de....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Chez les embryons non stimulés subissant une constriction apicale, Sqh-mCherry s’est enrichi au niveau de la région médioapicale des cellules mésodermiques ventrales, tandis que CRY2-Rho1DN-mCherry était cytosolique (Figure 1A). L’ablation au laser dans le domaine de constriction a conduit à un recul rapide des tissus le long de l’axe A-P (Figure 1B,C). Dans les embryons stimulés, le signal CRY2-Rho1DN-mCherry est devenu localisé dans la membran.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Ce protocole décrivait l’utilisation combinée de l’optogénétique et de l’ablation au laser pour sonder les changements de tension tissulaire immédiatement après l’inactivation de la contractilité de l’actomyosine. L’outil optogénétique décrit ici tire parti de la forme négative dominante de Rho1 (Rho1DN) pour inhiber de manière aiguë la contractilité endogène de l’actomyosine dépendante de Rho1 et de Rho1. La caractérisation antérieure d’Opto-Rho1DN dans le contexte de la formation du sillon ventral de la drosophile<.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.
Remerciements
Les auteurs remercient Ann Lavanway pour son soutien en matière d’imagerie. Les auteurs remercient le laboratoire Wieschaus et le laboratoire De Renzis pour le partage des réactifs et le Bloomington Drosophila Stock Center pour les stocks de mouches. Cette étude est soutenue par le NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 et la subvention de recherche institutionnelle #IRG-82-003-33 de l’American Cancer Society à BH.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plat à fond en verre de 35 mm | MatTek | P35G-1.5-10-C | Utilisé pour la préparation d’échantillons |
| Boîte de Pétri de 60 mm × ; 15 mm avec couvercle | Falcon | 351007 | Utilisée pour la préparation d’échantillons |
| Tissu noir pour couvrir le microscope | En ligne | NA | Utilisé pour éviter une stimulation lumineuse indésirable |
| Clorox Ultra Germicadal Bleach (8,25 % d’hypochlorite de sodium) | VWR | 10028-048 | Utilisé pour la décorrination d’embryons |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | Utilisé pour la configuration croisée |
| ddH2O | NA | NA | Utilisé pour la préparation d’échantillons |
| Pince à épiler Dumont Style 5 | VWR | 102091-654 | Utilisé pour la préparation d’échantillons |
| Outil pour cils (fabriqué à partir d’une brosse ronde en zibeline rouge pur #2) | VWR | 22940-834 | Utilisé pour la préparation d’échantillons |
| FluoView (Logiciel) | Olympus | NA | Utilisé pour l’acquisition d’images et la stimulation optogénétique |
| Huile d’halocarbure 27 | Sigma Aldrich | H8773-100ML | Utilisé pour la visualisation du stade embryonnaire |
| ImageJ/FIJI | NIH | NA | Utilisé pour l’analyse d’images |
| MATLAB | MathWorks | NA | Utilisé pour l’analyse d’images |
| Stéréoscope Nikon SMZ-745 | Nikon | NA | Utilisé pour la préparation d’échantillons |
| Microscope multiphotonique Olympus FVMPE-RS avec lasers ultrarapides à double ligne InSight DS pour l’imagerie multiphotonique simultanée à double longueur d’onde, un objectif à immersion dans l’eau (XLPLN25XWMP2) 25x/NA1.05 et une unité de stimulation IR/VIS pour la photoactivation/stimulation. Ce système est également équipé d’un filtre TRITC (39005-BX3 ; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), et une unité d’éclairage à fluorescence qui émet une lumière blanche. | Olympus | NA | Utilisé pour l’acquisition d’images et la stimulation optogénétique |
| SP Bel-Art Boîte de congélation en polypropylène 100 places (boîte noire à l’épreuve de la lumière pour le transfert d’échantillons) | VWR | 30621-392 | Utilisé pour éviter la stimulation lumineuse indésirable |
| Écran de filtre UV pour FM1403 Fluores (écran en plastique orange-rouge) | Bolioptics | FM14036151 | Utilisé pour éviter la stimulation |
| lumineuse indésirableLampe frontale VITCHELO V800 avec lumières LED blanches et rouges | Amazon | NA | Utilisée pour éviter la stimulation lumineuse indésirable |
Références
- Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
- Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
