Article de méthode

Un flux de travail intégré pour étudier l’architecture spatio-temporelle du génome centrée sur le promoteur dans des populations cellulaires rares

DOI :

10.3791/65316

⸱

21 avril 2023

 ,  ,  ,  , 
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’expression des gènes est régulée par les interactions des promoteurs de gènes avec les éléments régulateurs distaux. Ici, nous décrivons comment la capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C) permet l’identification de ces interactions dans des types de cellules rares, qui étaient auparavant non mesurables.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La transcription des gènes spatio-temporels est étroitement régulée par des éléments régulateurs distaux, tels que les amplificateurs et les silencieux, qui s’appuient sur la proximité physique avec leurs promoteurs de gènes cibles pour contrôler la transcription. Bien que ces éléments régulateurs soient faciles à identifier, leurs gènes cibles sont difficiles à prédire, car la plupart d’entre eux sont spécifiques au type cellulaire et peuvent être séparés par des centaines de kilobases dans la séquence linéaire du génome, ignorant d’autres gènes non cibles. Depuis plusieurs années, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) est l’étalon-or pour l’association d’éléments régulateurs distaux à leurs gènes cibles. Cependant, PCHi-C repose sur la disponibilité de millions de cellules, interdisant l’étude de populations de cellules rares telles que celles couramment obtenues à partir de tissus primaires. Pour surmonter cette limitation, une méthode de capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C), une méthode rentable et personnalisable pour identifier le répertoire d’éléments régulateurs distaux contrôlant chaque gène du génome, a été développée. liCHi-C s’appuie sur un cadre expérimental et informatique similaire à celui de PCHi-C, mais en utilisant des changements de tube minimes, en modifiant la concentration et les volumes de réactifs, et en échangeant ou en éliminant les étapes, il tient compte des pertes de matériaux minimales lors de la construction de la bibliothèque. Collectivement, liCHi-C permet l’étude de la régulation des gènes et de l’organisation spatio-temporelle du génome dans le contexte de la biologie du développement et de la fonction cellulaire.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’expression génique temporelle entraîne la différenciation cellulaire et, en fin de compte, le développement de l’organisme, et son altération est étroitement liée à une large pléthore de maladies 1,2,3,4,5. La transcription des gènes est finement régulée par l’action d’éléments régulateurs, qui peuvent être classés comme proximaux (promoteurs de gènes) et distaux (par exemple, amplificateurs ou silencieux), ces derniers étant fréquemment situés loin de leurs gènes cibles et interagissent physiquement avec eux par boucle de chromatine pour moduler l’expression des gènes 6,7,8.

L’identification des régions régulatrices distales dans le génome est une question qui fait l’objet d’un large consensus, puisque ces régions abritent des modifications spécifiques des histones 9,10,11 et contiennent des motifs spécifiques de reconnaissance des facteurs de transcription, agissant comme des plates-formes de recrutement pour eux12,13,14. En outre, dans le cas des amplificateurs et des super-amplificateurs 15,16, ils ont également une faible occupation des nucléosomes 17,18 et sont transcrits en ARNe non codants 19,20.

Néanmoins, les gènes cibles de chaque élément régulateur distal sont plus difficiles à prédire. Le plus souvent, les interactions entre les éléments régulateurs distaux et leurs cibles sont de type cellulaire et spécifiques au stimulus 21,22, couvrent des centaines de kilobases, reliant d’autres gènes dans n’importe quelle direction 23,24,25, et peuvent même être situées à l’intérieur des régions introniques de leur gène cible ou d’autres gènes non intermédiaires 26,27. De plus, les éléments régulateurs distaux peuvent également contrôler plus d’un gène à la fois, et vice versa28,29. Cette complexité positionnelle empêche de déterminer les associations régulatrices entre eux et, par conséquent, la plupart des cibles de chaque élément régulateur dans chaque type de cellule restent inconnues.

Au cours des dernières années, il y a eu un essor significatif dans le développement des techniques de capture de conformation chromosomique (3C) pour étudier les interactions de la chromatine. Le plus utilisé d’entre eux, Hi-C, permet de générer une carte de toutes les interactions entre chaque fragment du génome d’une cellule30. Cependant, pour détecter des interactions significatives au niveau des fragments de restriction, Hi-C s’appuie sur le séquençage ultra-profond, interdisant son utilisation pour étudier systématiquement le paysage régulateur des gènes individuels. Pour surmonter cette limitation économique, plusieurs techniques 3C basées sur l’enrichissement ont émergé, telles que-PET31, HiChIP 32 et son homologue à faible intrant HiCuT33. Ces techniques dépendent de l’utilisation d’anticorps pour enrichir les interactions à l’échelle du génome médiées par une protéine spécifique. Néanmoins, la caractéristique unique de ces techniques 3C est également le fléau de leur application; Les utilisateurs comptent sur la disponibilité d’anticorps de haute qualité pour la protéine d’intérêt et ne peuvent pas comparer les conditions dans lesquelles la liaison de la protéine est dynamique.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) est une autre technique 3C basée sur l’enrichissement qui contourne ces limitations34,35. En utilisant un système d’enrichissement de sonde à ARN biotinylé, PCHi-C est capable de générer des bibliothèques à haute résolution à l’échelle du génome de régions génomiques interagissant avec 28 650 promoteurs de gènes annotés par des humains ou 27 595 souris, également connus sous le nom d’interactome promoteur. Cette approche permet de détecter des interactions significatives à longue distance à la résolution au niveau des fragments de restriction des promoteurs actifs et inactifs, et de comparer de manière robuste les interactomes promoteurs entre n’importe quelle condition, indépendamment de la dynamique des modifications des histones ou de la liaison aux protéines. Le PCHi-C a été largement utilisé ces dernières années pour identifier les réorganisations d’interactomes promoteurs au cours de la différenciation cellulaire 36,37, identifier le mécanisme d’action des facteurs de transcription38,39 et découvrir de nouveaux gènes et voies potentiels dérégulés dans la maladie par des variantes non codantes 40,41,42,43,44,45,46,47,48, aux côtés de nouvelles mutations non codantes49,50. En outre, en modifiant simplement le système de capture, cette technique peut être personnalisée en fonction de la question biologique pour interroger n’importe quel interactome (par exemple, l’interactome amplificateur 51 ou l’interactome d’une collection d’altérations non codantes41,52).

Cependant, PCHi-C s’appuie sur un minimum de 20 millions de cellules pour effectuer la technique, ce qui empêche l’étude de populations cellulaires rares telles que celles souvent utilisées en biologie du développement et dans les applications cliniques. Pour cette raison, nous avons développé le Capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C), une nouvelle méthode rentable et personnalisable basée sur le cadre expérimental de PCHi-C pour générer des interactomes promoteurs à haute résolution avec une entrée cellulaire faible. En effectuant l’expérience avec un minimum de changements de tube, en échangeant ou en éliminant des étapes du protocole PCHi-C original, en réduisant considérablement les volumes de réaction et en modifiant les concentrations de réactifs, la complexité de la bibliothèque est maximisée et il est possible de générer des bibliothèques de haute qualité avec aussi peu que 50 000 cellules53.

Le Hi-C à capture à faible entrée (liCHi-C) a été comparé au PCHi-C et utilisé pour élucider le recâblage de l’interactome promoteur au cours de la différenciation des cellules hématopoïétiques humaines, découvrir de nouveaux gènes et voies potentiellement associés à la maladie dérégulés par des altérations non codantes et détecter des anomalies chromosomiques53. Le protocole étape par étape et les différents contrôles de qualité à travers la technique sont détaillés ici jusqu’à la génération finale des bibliothèques et leur analyse informatique.

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Protocole

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Pour assurer une perte matérielle minimale, (1) travailler avec des tubes et des embouts à faible liaison d’ADN (voir le tableau des matériaux), (2) placer des réactifs sur la paroi du tube au lieu d’introduire l’embout à l’intérieur de l’échantillon et, (3) si possible, mélanger l’échantillon par inversion au lieu de pipeter l’échantillon de haut en bas, et tourner vers le bas par la suite pour récupérer l’échantillon.

1. Fixation cellulaire

  1. Cellules se développant en suspension
    1. Récoltez de 50 000 à un million de cellules et placez-les dans un tube de 1,5 ml à faible liaison.
      REMARQUE : Les types de cellules utilisés pour la présente étude sont détaillés dans la section des résultats représentatifs.
    2. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 600 x g (à 4 °C) à l’aide d’une centrifugeuse à rotor à angle fixe et retirer le surnageant par pipetage.
    3. Resuspendre les cellules dans 1 mL de RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) à température ambiante.
    4. Ajouter 143 μL de formaldéhyde à 16 % sans méthanol pour atteindre une concentration de 2 % et mélanger.
    5. Incuber les cellules pendant 10 min tout en tournant à température ambiante pour fixer les cellules.
      REMARQUE: Essayez d’être aussi précis que possible avec l’incubation de 10 minutes. Une sur- ou une sous-fixation des cellules peut entraîner une diminution de la qualité de la bibliothèque.
    6. Éteindre la réaction en ajoutant 164 μL de glycine 1 M glacée et mélanger. Incuber les cellules pendant 5 min, en tournant à température ambiante.
    7. Incuber ensuite les cellules pendant 15 minutes sur de la glace, en mélangeant par inversion toutes les ~5 minutes.
    8. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 1 000 x g (à 4 °C) à l’aide d’une centrifugeuse à rotor à angle fixe et retirer le surnageant.
    9. Lavez les cellules en remettant la pastille en suspension dans 1 mL de solution saline glacée 1x tamponnée au phosphate (PBS).
    10. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 1 000 x g (à 4 °C) et retirer le surnageant.
      REMARQUE: Les cellules granulées peuvent être surgelées dans de l’azote liquide ou de la glace sèche et stockées à -80 ° C.
  2. Cellules adhérentes
    1. Lavez les cellules dans le plat de culture avec 1x PBS.
    2. Préparer suffisamment de RPMI 1640 complété par 10% de FBS et de formaldéhyde sans méthanol à 2% à température ambiante pour couvrir la boîte de culture.
    3. Ajouter le milieu supplémenté à la capsule de culture avec les cellules et incuber pendant 10 min, en berçant à température ambiante pour fixer les cellules.
      REMARQUE: Essayez d’être aussi précis que possible avec l’incubation de 10 minutes. Une sur- ou une sous-fixation des cellules peut entraîner une diminution de la qualité de la bibliothèque.
    4. Éteindre la réaction en ajoutant 1 M de glycine jusqu’à 0,125 M et mélanger par balancement.
    5. Incuber les cellules pendant 5 min, en les berçant à température ambiante.
    6. Incuber ensuite les cellules pendant 15 min à 4 °C, en mélangeant en berçant toutes les 3-4 minutes.
    7. Retirez le support et lavez les cellules avec du PBS 1x froid.
    8. Grattez les cellules et transférez-les dans un tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL. Essuyez le plat de culture avec 0,5-1 mL de 1x PBS froid.
    9. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 1 000 x g (à 4 °C) à l’aide d’une centrifugeuse à rotor à angle fixe et retirer le surnageant. Les cellules granulées peuvent être surgelées dans de l’azote liquide ou de la glace sèche et stockées à -80 °C.

2. Lyse et digestion

  1. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de tampon de lyse froide (tableau 1) pour perturber la membrane cellulaire. L’ajout du tampon seul devrait suffire à remettre les cellules en suspension, mais elles peuvent être remises en suspension si nécessaire par vortex lumineux.
  2. Incuber sur la glace pendant 30 min, en mélangeant par inversion toutes les ~5 min. Centrifuger les noyaux pendant 10 min à 1 000 x g (à 4 °C) et retirer le surnageant. Remettez les noyaux en suspension avec 500 μL de tampon de restriction froid 1,25x 2 (voir le tableau des matériaux).
  3. Centrifuger les noyaux pendant 10 min à 1 000 x g (à 4 °C) et retirer le surnageant. Resuspendre les noyaux dans 179 μL de tampon de restriction 1,25x 2.
  4. Ajouter 5,5 μL de dodécylsulfate de sodium à 10 % (FDS; voir le tableau des matières) et mélanger. Les cellules peuvent former des amas ; Ceci est normal et doit être désagrégé autant que possible par vortex. Incuber l’échantillon pendant 1 h à 37 °C dans un thermobloc, en agitant à 950 tr/min.
  5. Éteignez la FDS en ajoutant 37,5 μL de Triton X-100 à 10 % et mélangez. Incuber l’échantillon pendant 1 h à 37 °C dans un thermobloc, en agitant à 950 tr/min.
  6. Digérer la chromatine en ajoutant 7,5 μL de HindIII (100 U/μL; voir le tableau des matières) et mélanger. Incuber l’échantillon pendant une nuit à 37 °C dans un thermobloc, en agitant à 950 tr/min.
  7. Le lendemain matin, ajoutez 2,5 μL supplémentaires de HindIII (100 U/μL) et incuber l’échantillon pendant 1 h à 37 °C dans un thermobloc, en agitant à 950 tr/min pour assurer une bonne digestion de la chromatine.
    REMARQUE : Dans le cadre des contrôles de l’efficacité de la digestion (voir étape 5.1), transférer l’équivalent de 20 000 à 40 000 noyaux dans un autre tube pour représenter le témoin non digéré. Après la digestion, transférer à nouveau le même nombre de cellules dans un autre tube pour représenter le contrôle digéré. Il est recommandé de tester l’efficacité de la digestion dans le cadre d’une expérience distincte si la disponibilité de la matière première est rare.

3. Ligature et réticulation

  1. Refroidir l’échantillon sur de la glace. Préparer un mélange principal et ajouter les réactifs suivants pour remplir et biotinyler les surplombs de fragments de restriction : 3 μL de tampon de restriction 10x 2, 1 μL d’eau sans nucléase, 0,75 μL de 10 mM de dCTP, 0,75 μL de 10 mM dTTP, 0,75 μL de 10 mM dGTP, 18,75 μL de 0,4 mM de biotine-14-dATP et 5 μL de 5 U/μL de Klenow (voir le tableau des matériaux). Incuber l’échantillon pendant 75 min à 37 °C, en mélangeant par inversion toutes les ~15 min.
  2. Refroidir l’échantillon sur de la glace. Préparez un mélange principal et ajoutez les réactifs suivants pour ligaturer les extrémités d’ADN remplies : 50 μL de tampon de ligature 10x, 2,5 μL d’albumine sérique bovine (BSA) à 20 mg/mL, 12,5 μL d’ADN ligase T4 à 1 U/μL et 173 μL d’eau exempte de nucléases (voir le tableau des matériaux).
  3. Incuber l’échantillon pendant 4-6 h à 16 °C, en mélangeant par inversion toutes les ~1 h. De plus, incuber l’échantillon pendant 30 minutes à température ambiante. Dissocier la chromatine en ajoutant 30 μL de 10 mg/mL de protéinase K et mélanger. Incuber l’échantillon pendant une nuit à 65 °C.
  4. Le lendemain matin, ajouter 15 μL supplémentaires de 10 mg/mL de protéinase K et incuber davantage l’échantillon pendant 2 h à 65 °C pour assurer une réticulation adéquate de la chromatine.

4. Purification de l’ADN

  1. Refroidir l’échantillon à température ambiante et le transférer dans un tube approprié pour la purification phénol-chloroforme.
  2. Ajouter 1 volume (545 μL) de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1) pour purifier l’ADN et mélanger en agitant vigoureusement.
  3. Centrifuger l’échantillon pendant 5 min à 12 000 x g à température ambiante et transférer la phase aqueuse supérieure (545 μL) dans un tube à faible liaison d’ADN de 2 mL.
  4. Ajouter les réactifs suivants pour précipiter l’ADN : 1 362,5 μL d’éthanol à 100 % refroidi à -20 °C, 54,5 μL d’acétate de sodium 3 M (pH 5,2) et 2 μL de glycogène à 15 mg/mL comme coprécipitant.
  5. Incuber pendant 1 h à -80 °C ou une nuit à -20 °C.
  6. Centrifuger l’échantillon pendant 30 min à 16 000-21 000 x g à 4 °C et retirer le surnageant. La pastille d’ADN doit être visible.
  7. Lavez la pastille en ajoutant 1 mL d’éthanol à 70 %, en tourbillonnant et en centrifugeant pendant 10 minutes à 16 000-21 000 x g à température ambiante.
  8. Retirez le surnageant et laissez sécher le granulé à l’air. Remettez en suspension la pastille d’ADN dans 130 μL d’eau exempte de nucléase.
  9. Évaluer la concentration par quantification fluorométrique (voir le tableau des matériaux). Conservez le matériau 3C purifié à -20 °C pendant plusieurs mois avant de procéder au protocole.

5. Contrôles de qualité facultatifs

  1. Évaluer l’efficacité de la digestion. Effectuer la réticulation et la purification de l’ADN phénol:chloroforme, comme décrit précédemment, aux contrôles non digérés et digérés obtenus à l’étape 2.13. Remettez en suspension la pastille d’ADN dans 10 μL d’eau sans nucléase. Quantifier la concentration et diluer l’ADN obtenu, si nécessaire, à 4 ng/μL.
  2. Effectuer une PCR quantitative avec 4 ng d’ADN des témoins non digérés et digérés, avec des amorces couvrant un locus de chromatine ouvert avec et sans cible HindIII (voir le tableau 2 pour la conception de l’amorce). Calculer l’efficacité de la digestion à la suite d’un rapport précédemment publié35.
    NOTE: L’efficacité de la ligature est calculée en pourcentage à l’aide de la formule: digestion (%) = 100 -100/(2^[(Ct digéré avec HindIII - Ctdigested sans HindIII) - (Ct non digéré avec HindIII - Ct non digéré sans HindIII)]) (voir tableau 3), qui prend en compte la différence des différents Cts obtenus pour chaque paire d’amorces chez les témoins non digérés et digérés.
  3. Évaluer la sensibilité de la détection d’interaction en effectuant une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) conventionnelle (0,2 mM de dNTP, 0,4 μm d’amorces F + R, 0,1 et U/μL de polymérase à démarrage), avec des amorces couvrant les interactions cellulaires invariantes à longue et à courte portée (voir le tableau 2 pour la conception de l’amorce). Utiliser 50-100 ng de matériau 3C (pour les interactions à courte et longue portée, respectivement) et amplifier dans les conditions suivantes : 98 °C pendant 15 min, suivi de 37 cycles de 98 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min, et terminer à 72 °C pendant 10 min. Maintenir à 4 °C.
    REMARQUE: Si la quantité d’ADN obtenue est inférieure à 2 μg, ne vérifiez qu’une interaction à longue et à courte portée au lieu de l’ensemble du panel d’interaction.
  4. Exécutez le produit sur 1x tris-borate-EDTA (TBE) en utilisant du gel d’agarose à 1,6% et recherchez la présence de l’amplicon PCR54 correspondant.
    REMARQUE: En raison du « copier-coller » imprévisible du génome, des bandes non spécifiques peuvent apparaître. Tant que la taille de bande correcte est respectée, elle est comptée comme correcte.
  5. Évaluer l’efficacité du remplissage et de la ligature de la biotine en digérant différemment un produit de PCR à courte portée avec HindIII, NheI (voir le tableau des matériaux), les deux enzymes ou aucune (eau), et en faisant fonctionner le produit sur un gel d’agarose 1,6% de TBE 1x. Un remplissage et une ligature corrects éliminent la cible HindIII précédente et créent une nouvelle cible NheI, de sorte que l’amplicon ne doit être coupé qu’en présence de NheI.
    REMARQUE : Pour minimiser les pertes de matière, récupérez 2,5 μL d’un produit PCR à courte portée des contrôles d’interaction et réamplifiez-le cinq fois pour effectuer les contrôles de remplissage et de ligature.

6. Sonication

  1. Transférer les 130 μL de l’échantillon (compléter avec de l’eau sans nucléase si une partie a été utilisée pour les témoins) dans une cuvette adaptée à la sonication.
  2. Installez un sonicateur à bain-marie et sonicatez en utilisant les paramètres suivants (optimisés pour le modèle et les cuvettes décrits dans le tableau des matériaux) : facteur de service: 20%; puissance d’incidence de pointe: 50; cycles par rafale: 200; temps: 65 s; et plage de température: 6-10 °C (8 °C optimal).
  3. Transférer l’échantillon dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL.

7. Réparation finale

  1. Préparez un mastermix et ajoutez les réactifs suivants pour réparer les extrémités inégales des fragments d’ADN créées pendant la sonication : 18 μL de tampon de ligature 10x, 18 μL de mélange dNTP 2,5 mM chacun, 6,5 μL de 3 U/μL d’ADN polymérase T4, 6,5 μL de 10 U/μL T4 PNK et 1,3 μL de 5 U/μL de Klenow (voir le tableau des matériaux).
  2. Incuber l’échantillon pendant 30 minutes à 20 °C et compléter avec un tampon Tris-low EDTA (TLE) (voir tableau 1) jusqu’à 300 μL.

8. Extraction de biotine

  1. Transfèrent 150 μL de billes de streptavidine C1 (voir le tableau des matières) par échantillon dans un tube de 1,5 mL, placez-les sur un tube magnétique de 1,5 mL et attendez 2 à 3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les billes soient collées au mur. Retirez le surnageant, en laissant les perles derrière.
  2. Lavez les billes avec 400 μL de 1x tampon Tween (TB; voir le tableau 1). Pour laver les perles, ajoutez le tampon et remettez-les en suspension par vortex doux. Replacez le tube dans l’aimant et attendez 2-3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les perles soient collées au mur. Retirez le surnageant, en laissant les perles derrière.
  3. Lavez les billes avec 300 μL de tampon 1x sans préadolescent (NTB; voir le tableau 1). Remettez les billes en suspension dans 300 μL de 2x NTB (voir le tableau 1).
    REMARQUE: Les billes peuvent former une couche poussiéreuse autour de la paroi du tube lors du lavage avec des tampons sans détergent. Ceci est normal et n’affecte pas le résultat du protocole.
  4. Combinez ces 300 μL de billes dans 2x NTB avec les 300 μL de l’échantillon. Incuber pendant 15 min, en tournant à température ambiante pour abattre les fragments d’ADN informatifs avec de la biotine. La bibliothèque est maintenant collée aux perles de streptavidine C1.
  5. Laver les billes avec 400 μL de 1x NTB. Lavez les billes avec 100 μL de tampon TLE et remettez-les ensuite en suspension dans 35,7 μL de tampon TILE.

9. dATP-tailing, ligature de l’adaptateur et amplification PCR

  1. Préparer un mélange principal et ajouter les réactifs suivants à l’échantillon pour dATP-tail les extrémités des fragments d’ADN réparés: 5 μL de tampon de restriction 10x 2, 2,3 μL de 10 mM dATP et 7 μL de 5 U/μL Klenow exo-. Incuber l’échantillon pendant 30 min à 37 °C.
  2. Inactiver Klenow exo- en incubant davantage l’échantillon pendant 10 min à 65 °C. Refroidir l’échantillon sur de la glace. Lavez les billes avec 300 μL de 1x TB. Lavez les billes avec 300 μL de 1x NTB.
  3. Lavez les billes avec 100 μL de 1x tampon de ligature et remettez-les ensuite en suspension dans 50 μL de 1x tampon de ligature. Ajouter 4 μL de mélange d’adaptateurs précuits de 15 μM (voir le tableau 2) et 1 μL d’ADN ligase T4 de 2 000 U/μL (voir le tableau des matériaux) à l’échantillon.
  4. Incuber pendant 2 h à température ambiante. Lavez les billes avec 400 μL de 1x TB. Lavez les billes avec 200 μL de 1x NTB. Laver les billes avec 100 μl de 1x tampon de restriction 2.
  5. Laver les billes avec 50 μL de 1x tampon de restriction 2 et les remettre ensuite en suspension dans 50 μL de 1x tampon de restriction 2.
  6. Mélanger les réactifs suivants pour préparer la réaction de PCR afin d’amplifier la bibliothèque : 50 μL de billes avec la bibliothèque, 250 μL de 2x mélanges maîtres PCR avec enzyme, 12 μL d’amorces F + R (25 μM chacune; voir Tableau 2) et 188 μL d’eau sans nucléase.
  7. Effectuer la PCR dans les conditions suivantes (diviser le mélange de réactifs PCR en réactions de 50 μL) : 98 °C pendant 40 s, suivi de X cycles de 98 °C pendant 10 s, 65 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 30 s, et terminer à 72 °C pendant 10 min. Maintenir à 4 °C.
    REMARQUE: Utilisez le nombre de cycles suivant comme point de départ pour optimiser le protocole dans les cellules diploïdes visant une sortie de 500 à 1 000 ng avant la capture de la bibliothèque: un million de cellules pour huit cycles; 250 000 cellules pour 10 cycles; 50 000 cellules pour 12 cycles.
  8. Regroupez toutes les réactions de 50 μL du même échantillon dans un tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL, placez-le sur un tube magnétique de 1,5 mL et attendez 2-3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les billes soient collées au mur.
  9. Transférer le surnageant contenant la bibliothèque (500 μL) dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL. Complétez avec un tampon TLE à 500 μL si une partie du surnageant a été perdue. Les billes de streptavidine C1 ne sont plus nécessaires.
  10. Effectuer une sélection recto-verso55 en utilisant la purification paramagnétique des billes (volume 0,4-1). Cela permet l’élimination sélective des fragments trop gros (>1 000 pb) et trop petits ou des amorces PCR (<200 pb), en fonction de la concentration de polyéthylène glycol et du sel des billes paramagnétiques ajoutées.
  11. Ajouter 200 μL (0,4 volume) de billes de bouillon à la bibliothèque et mélanger par vortex. Incuber pendant 10 min, en tournant à température ambiante.
  12. Placer sur un aimant, attendre 2-3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les perles soient collées au mur, et transférer le surnageant contenant la bibliothèque (sans les plus gros fragments) dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL.
  13. Concentrez les billes en prenant 750 μL de billes de bouillon, placez-les dans un tube de 1,5 mL sur un aimant, attendez 2-3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les perles soient collées au mur, retirez le surnageant et remettez les perles en suspension en tourbillonnant dans 300 μL de nouvelles billes de stock.
  14. Ajouter ces 300 μL de billes concentrées à l’échantillon (1 volume) et mélanger par vortex. Incuber pendant 10 min, en tournant à température ambiante. Placer sur un aimant, attendre 2-3 min ou jusqu’à ce que toutes les perles soient collées au mur, et retirer le surnageant (contenant les plus petits fragments et les amorces PCR).
  15. Lavez les billes trois fois avec 1 mL d’éthanol à 70 %. Pour ce faire, ajoutez l’éthanol pendant que le tube avec les perles est encore sur l’aimant, en essayant de ne pas déranger les perles, et attendez 30-60 s. Ensuite, retirez le surnageant sans déranger les perles.
  16. Laisser sécher les billes à l’air libre et les remettre en suspension dans 21 μL de tampon TLE par vortex.
    REMARQUE: Un séchage excessif des billes peut réduire le rendement lors de l’élution de l’ADN. Essayez de les remettre en suspension dans un tampon TLE immédiatement après qu’ils ne soient plus « brillants » de l’éthanol.
  17. Incuber l’échantillon pendant 10 min à 37 °C dans un thermobloc pour éluer la bibliothèque des billes. Placez le tube dans un aimant et transférez le surnageant contenant la bibliothèque dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL.
  18. Quantifier la taille et la concentration par électrophorèse automatisée (voir le tableau des matériaux). Le matériau Hi-C purifié peut être conservé à -20 °C pendant plusieurs mois avant de procéder au protocole.

10. Capture de bibliothèque

  1. Travailler avec 500-1 000 ng de la bibliothèque. Concentrez la bibliothèque en séchant l’ADN à l’aide d’un concentrateur sous vide et en remettant le matériau en suspension dans 3,4 μL d’eau sans nucléase.
  2. Ajoutez les bloqueurs suivants du kit d’enrichissement cible (voir le tableau des matériaux) à l’échantillon : 2,5 μL de bloqueur 1, 2,5 μL de bloqueur 2 et 0,6 μL de bloqueur d’oligo personnalisé pour les adaptateurs.
  3. Bien remettre en suspension, transférer la solution sur une bandelette de PCR de 0,2 mL et incuber dans un thermocycleur pendant 5 min à 95 °C, puis 5 min à 65 °C avec un couvercle chauffant. Laisser le tube en incubation à 65 °C.
  4. Préparer la solution d’hybridation en combinant les réactifs suivants du kit d’enrichissement cible (voir Tableau des matériaux) par échantillon (13 μL). Conserver sur le banc à température ambiante : 6,63 μL de Hyb 1, 0,27 μL de Hyb 2, 2,65 μL de Hyb 3 et 3,45 μL de Hyb 4.
  5. Diluer 0,5 μL de bloc de RNase du kit d’enrichissement cible avec 1,5 μL d’eau exempte de nucléases par échantillon. Décongeler 5 μL de l’ARN biotinylé par échantillon sur glace et y ajouter les 2 μL du bloc RNase dilué. Conserver sur le banc à température ambiante.
  6. Ajouter les 13 μL de la solution d’hybridation aux 7 μL de l’ARN biotinylé avec la RNase et bien mélanger.
  7. Sur le thermocycleur à 65 °C, transférer la solution d’hybridation avec l’ARN biotinylé (20 μL) dans la bibliothèque bloquée. Fermez fermement le couvercle du tube et incuber dans le thermocycleur pendant une nuit à 65 °C.
    REMARQUE: Pour minimiser l’évaporation de l’échantillon (qui peut conduire à une hybridation ARN-ADN sous-optimale) lors de la réalisation de plusieurs échantillons en même temps, utilisez une pipette multicanal pour transférer l’ARN biotinylé à chaque bibliothèque en même temps.

11. Extraction de biotine et amplification PCR

  1. Transférez 50 μL de billes de streptavidine T1 par échantillon dans un tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL, placez-les sur un tube magnétique de 1,5 mL et attendez 2 à 3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les billes soient collées au mur. Retirez le surnageant, en laissant les perles derrière. Lavez les billes trois fois avec 200 μL du tampon de liaison du kit d’enrichissement cible.
  2. Remettez les billes en suspension dans 200 μL de tampon de liaison. Sur le thermocycleur à 65 °C, transférer l’échantillon dans les billes de streptavidine T1 en suspension et incuber pendant 30 minutes, en tournant à température ambiante.
  3. Lavez les billes avec 200 μL de tampon de lavage 1 du kit d’enrichissement cible. Incuber pendant 15 min, en tournant à température ambiante. Laver les billes trois fois avec 200 μL de tampon de lavage 2 du kit d’enrichissement cible chauffé à 65 °C. Incuber pendant 10 min à 65 °C dans un thermobloc, en agitant à 300 tr/min entre les lavages.
  4. Laver les billes avec 200 μL de 1x tampon de restriction 2 et les remettre ensuite en suspension dans 30 μL de 1x tampon de restriction 2.
  5. Mélanger les réactifs suivants pour préparer la réaction de PCR afin d’amplifier la bibliothèque : 30 μL de billes avec la bibliothèque, 150 μL de 2x mélanges maîtres PCR avec enzyme, 7,2 μL d’amorces F + R (25 μM chacune; voir le tableau 2) et 112,8 μL d’eau sans nucléase.
  6. Effectuer la PCR dans les conditions suivantes (diviser le mélange de réactifs PCR en réactions de 50 μL) : 98 °C pendant 40 s, suivi de quatre cycles de 98 °C pendant 10 s, 65 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 30 s, et terminer avec 72 °C pendant 10 min. Maintenir à 4 °C.
  7. Regroupez toutes les réactions de 50 μL du même échantillon dans un tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL, placez-le sur un tube magnétique de 1,5 mL et attendez 2-3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les billes soient collées au mur.
  8. Transférer le surnageant contenant la bibliothèque (300 μL) dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL. Complétez avec un tampon TLE à 300 μL si une partie du surnageant a été perdue. Les billes de streptavidine T1 ne sont plus nécessaires.
  9. Effectuer une purification de l’ADN à l’aide de billes paramagnétiques (0,9 volume; voir le tableau des matériaux). Ajouter 270 μL de billes de bouillon à l’échantillon et mélanger par vortex.
  10. Incuber pendant 10 min, en tournant à température ambiante.
  11. Placez sur un aimant, attendez 2-3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les perles soient collées au mur et retirez le surnageant.
  12. Lavez les billes trois fois avec 1 mL d’éthanol à 70 %. Pour ce faire, ajoutez l’éthanol pendant que le tube avec les perles est encore sur l’aimant, en essayant de ne pas déranger les perles, et attendez 30-60 s. Ensuite, retirez le surnageant sans déranger les perles.
  13. Laisser sécher les billes à l’air libre et les remettre en suspension dans 21 μL de tampon TLE par vortex.
    REMARQUE: Un séchage excessif des billes peut réduire le rendement lors de l’élution de l’ADN. Essayez de les remettre en suspension dans un tampon TLE immédiatement après qu’ils ne soient plus « brillants » de l’éthanol.
  14. Incuber l’échantillon pendant 10 min à 37 °C dans un thermobloc pour éluer la bibliothèque des billes.
  15. Placez le tube dans un aimant et transférez le surnageant contenant la bibliothèque dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL.
  16. Quantifier la taille et la concentration par électrophorèse automatisée.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

liCHi-C offre la possibilité de générer des bibliothèques d’interactomes promoteurs de haute qualité et à résolution à l’échelle du génome avec aussi peu que 50 000 cellules53. Ceci est accompli en supprimant les étapes inutiles du protocole d’origine des volumes de réaction et l’utilisation de produits en plastique à faible liaison de l’ADN tout au long du protocole. Il s’agit notamment de la purification du phénol après réticulation, de l’élimination de la biotine, de la purification ultérieure ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

liCHi-C offre la capacité de générer des bibliothèques d’interactomes promoteurs haute résolution en utilisant un cadre expérimental similaire à celui de PCHi-C, mais avec un nombre de cellules considérablement réduit. Ceci est grandement réalisé en éliminant les étapes inutiles, telles que la purification du phénol et l’élimination de la biotine. Dans le protocole57 classique de ligature dans le noyau et sa technique dérivée ultérieure PCHi-C, la biotine est retirée des fragments de restriction n...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions les autres membres du laboratoire Javierre pour leurs commentaires sur le manuscrit. Nous remercions le programme CERCA, la Generalitat de Catalunya et la Fondation Josep Carreras pour leur soutien institutionnel. Ce travail a été financé par FEDER/Ministère espagnol de la Science et de l’Innovation (RTI2018-094788-A-I00), l’Association européenne d’hématologie (4823998) et l’Association espagnole contre le cancer (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ est financé par le projet Junior Leader de la Caixa Banking Foundation (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR est financé par une bourse AGAUR FI (2019FI-B00017) et LT-D est financé par une bourse FPI (PRE2019-088005). Nous remercions le programme de doctorat en biochimie et biologie moléculaire de l’Universitat Autònoma de Barcelona pour son soutien. Aucun des bailleurs de fonds n’a été impliqué à aucun moment dans la conception expérimentale ou la rédaction du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,4 mM Biotine-14-dATPInvitrogen19524-016
0,5 M EDTA pH 8,0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8,0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002SRéférencé comme tampon de restriction 2 dans le manuscrit
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x tampon de réaction de ligase d’ADN T4New England BiolabsB0202S
Solution de formaldéhyde à 16 % (p/v), sans méthanolThermo Scientific28908
20 mg/mL Albumine sérique bovineNew England BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Tubes légersQiuantabio2302820Pour la purification au phénol-chloroforme en section 4 (purification de l’ADN). Les tubes en gel Phase Lock sont un type commercial de tubes spécialement conçus pour maximiser la récupération de l’ADN après des purifications de phénol-chloroforme tout en évitant le transfert de contaminants dans la phase organique en contenant une résine de densité intermédiaire qui se dépose entre la phase organique et la phase aqueuse et les isole. Les tubes PLG doivent être filés à 12 000 x g pendant 30 s avant d’être utilisés pour s’assurer que la résine est bien placée au fond du tube
Adaptateurs et amorces PCR pour l’amplification de la bibliothèqueTechnologies d’ADNintégrées-Achetés en tant qu’amorces individuelles avec purification PAGE pour NGS
Racleurs de cellulesNunc179693Ou toute autre marque
Centrifugeuse (rotor à angle fixe pour tubes de 1,5 ml)N’importe quelle marque
CHiCAGO R package1.14.0
Perles CleanNGSCleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123AOu toute autre marque
Tube DNA LoBind, 1,5 mLEppendorf30108051
Tube DNA LoBind, 2 mLEppendorf30108078
DNA polymérase I grand (Klenow) fragment 5000 unités/mLNew England BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 billesInvitrogen65002<strong>Pour le tirage de la biotine de la bibliothèque pré-capturée dans la section 8 (tirage de biotine)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 billesInvitrogen65602Pour le pull-down de biotine de la banque post-capturée dans la section 11 (pull-down de biotine et amplification PCR)
DynaMag-2Invitrogen12321DOu tout autre aimant adapté au tube de 1,5 ml
d’éthanol absoluVWR20821.321
FBS, qualifiéGibco10270-106Ou toute autre marque
GlycineFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue CoprecipitantInvitrogenAM9515Utilisé pour la coprécipitation de l’ADN dans la section 4 (purification de l’ADN)
HiCUP0.8.2
HindIII, 100 U/µ ; LNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 unités/mLNew England BiolabsM0212L
Embouts filtrants à faible rétention  ;( 10 et micro ; L, 20 et micro ; L, 200 et micro ; L et 1000 & micro ; L)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focalisé-ultrasoniseurCovaris500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-sente bouchon 6 flacons de 16 mmCovaris520045Pour sonication en section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µ ; LNew England BiolabsR3131M
Eau de biologie moléculaire sans nucléaseSigma-AldrichW4502
Amorces PCR pour les contrôles de qualitéd’ADNintégrées-Bandelettes
PCR  ; et bouchonsAgilent Technologies410022, 401425
Phénol : Chloroforme : Alcool isoamylique 25:24:1, Saturé avec 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTASigma-AldrichP3803
Phusion  ; Master Mix PCR haute fidélité avec tampon HFNew England BiolabsM0531LPour l’amplification de la bibliothèque dans les sections 9 (dATP-tailing, ligature de l’adaptateur et amplification PCR)
et 11 (pull-down de biotine et amplification PCR)
Cocktail d’inhibiteurs de protéase (sans EDTA)Roche11873580001
Proteinase K, recombinante, Qualité PCRRoche3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kitInvitrogenQ33230Pour la quantification de l’ADN après précipitation dans la section 4 (purification de l’ADN)
Tubes de dosageQubit InvitrogenQ32856
rCutsmart bufferNew England BiolabsB6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010Ou toute autre marque
FDS - Solution 10 % pour la biologie moléculairePanReac AppliChemA0676
Acétate de sodium pH 5,2Sigma-AldrichS7899-100ML
Bibliothèque SureSelect personnalisée 3-5,9 MoAgilent Technologies5190-4831Système de capture souris ou humain conçu sur mesure, utilisé pour la capture
SureSelect Target Enrichment Box 1Agilent Technologies5190-8645Utilisé pour la capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full AdapterAgilent Technologies931107Utilisé pour la capture
T4 DNA ligase 1 U/µ ; LInvitrogen15224025Pour ligature en section 3 (ligature et décrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mLNew England BiolabsM0202TPour ligature en section 9 (dATP-tailing, ligature de l’adaptateur et amplification PCR)
T4 DNA polymérase 3000 unités/mLNew England BiolabsM0203L
T4 PNK 10000 unités/mLNew England BiolabsM0201L
Tapestation 4200 instrumentAgilent TechnologiesPour l’électrophorèse automatisée dans la section 9 (dATP-tailing, ligature de l’adaptateur et amplification PCR) and
section 11 (tirage de la biotine et amplification PCR). Tout autre système d’électrophorèse automatisé est valide
réactifs TapestationAgilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,Pour l’électrophorèse automatisée dans la section 9 (dATP-tailing, ligature de l’adaptateur et amplification PCR) and
section 11 (tirage de la biotine et amplification PCR). Tout autre système d’électrophorèse automatisé est valide
Triton X-100 pour la biologie moléculairePanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML
Technologies

Références

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Promoter Capture Hi CCapture Hi C faible quantit d entr earchitecture g nomique spatiotemporelleorganisation de la chromatiner gulation g niqueorganisation tridimensionnelle du g nomel ments r gulateurs distauxinteraction de la chromatinepr paration de biblioth ques d ADN

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