Method Article

Évaluation de l’impact d’un nouveau système de processeur de cellules de refroidissement sur l’installation d’isolement des cellules d’îlots

DOI:

10.3791/65321

⸱

August 11th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit ici un système de processeur de cellule de refroidissement personnalisé compatible avec une salle blanche conforme aux bonnes pratiques de fabrication (BPF) pour améliorer la viabilité des cellules après le post-traitement.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’équipement de thérapie cellulaire standard, y compris le processeur de cellules de référence pour purifier les îlots humains en vue d’une transplantation clinique, est rarement réfrigéré, ce qui peut exposer les cellules à des températures élevées pendant l’étape de centrifugation. Les systèmes de refroidissement personnalisés ont un avantage direct sur la viabilité et le fonctionnement des îlots de Langerhans. La présente étude a été conçue pour tester l’efficacité d’un nouveau système de processeur de cellules réfrigérées facilement disponible nécessitant des modifications minimales et pour évaluer son impact sur la viabilité des cellules humaines et l’environnement de la salle blanche GMP. Le système de refroidissement, un échangeur de chaleur réfrigéré mécaniquement réglé à -30 °C, a été utilisé pour fournir de l’air sec refroidi de qualité médicale au bol du processeur de cellules par un trou percé dans le couvercle de la centrifugeuse. En raison de la disponibilité limitée de donneurs de pancréas au Qatar, la validation du système a été effectuée avec une purification continue par gradient de densité de la moelle osseuse humaine en pool. La stérilité, la turbulence et le nombre de particules ont été mesurés dans des environnements de salle blanche de classe C et de classe B. Aucune turbulence ne s’est développée autour du processeur de cellule refroidie, et aucune particule en suspension dans l’air de 0,5 μm et 5 μm n’a été générée conformément aux normes GMP des salles blanches. Au début et à la fin des étapes de collecte, la température est passée respectivement à 21,50 °C ± 0,34 °C et 21,93 °C ± 0,20 °C dans le processeur à cellules non refroidies et à seulement 10,9 °C ± 0,17 °C et 11,16 °C ± 0,35 °C dans le processeur à cellules refroidies (p <0,05). Le processeur de cellules refroidies a permis d’améliorer à la fois la récupération (98 %) de la fraction de cellules mononucléées et la viabilité (100 % ± 2 %) du post-traitement. Le nouveau système de refroidissement réduit efficacement la chaleur produite par le processeur de cellules tout en n’ayant aucun impact particulaire sur l’environnement de la salle blanche GMP. Le processeur de cellule refroidi décrit ici est une méthode peu coûteuse (16 000 $ sans compter les taxes, le dédouanement et le transport) et peu invasive pour fournir un refroidissement robuste. À l’heure actuelle, cette technologie dans l’installation de thérapie cellulaire GMP est appliquée à l’isolement et à la transplantation de cellules d’îlots pancréatiques humains dans le cadre du programme clinique.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La transplantation d’îlots de Langerhans pour le diabète de type 1 sévère peut restaurer la sécrétion endogène d’insuline et est devenue la norme de soins dans un certain nombre de pays1. L’isolement des îlots est une procédure en plusieurs étapes qui comprend une digestion enzymatique et mécanique chaude du pancréas, suivie de phases refroidies pour la récupération des tissus digérés et la purification des îlots avec des gradients de densité continus ou discontinus sur un processeur de cellules. Le refroidissement rapide ralentit la phase de digestion enzymatique et protège les îlots des enzymes digestives libérées par la contamination des cellules acineuses. Le processeur de cellules a été conçu à l’origine pour séparer les composants sanguins cellulaires à température ambiante2. Il a été réutilisé pour purifier les îlots pancréatiques humains de Langerhans en 19893. Depuis trois décennies, les îlots humains ont été purifiés pour des essais cliniques et, plus récemment, pour des soins standard, soit dans un processeur de cellules avec des gradients discontinus4, soit avec des gradients de densité continus1 fabriqués avec un gradient maker1 ou un mélangeur informatisé équivalent5,6,7. D’autres groupes ont signalé la purification d’îlots de Langerhans à partir de grands mammifères et d’humains à l’aide de grandes bouteilles cylindriques en plastique 8,7,9, ce qui a considérablement amélioré l’efficacité de la purification et la qualité des îlots.

En effet, compte tenu de l’étalon-or pour purifier les îlots humains pour la transplantation clinique10,11, le processeur de cellules fabriqué était sans réfrigération. Conséquence directe du manque de réfrigération, les îlots ont été exposés à des températures plus élevées pendant l’étape de purification. Lors de la centrifugation, une augmentation incontrôlée de la température se produit en raison du frottement mécanique du rotor12,13. Les processeurs de cellules ont été adaptés avec un système de refroidissement dans les centres d’isolement des îlots pancréatiques qui a statistiquement augmenté la sécrétion d’insuline induite par le glucose et la viabilité cellulaire, confirmant l’avantage de maintenir les îlots pancréatiques à basse température pendant la procédure de purification14,15.

Il convient de noter qu’à la fin des années 1980, 10 prototypes réfrigérés ont été construits pour réduire les dommages aux îlots lors de la purification du gradient de densité, mais n’ont pas reçu plus d’attention. Les prototypes de processeurs à cellules étaient basés sur le refroidissement de la broche et du bol avec du polyéthylène glycol réfrigéré. En particulier, les solutions de purification des îlots de Langerhans, y compris les solutions de préservation des organes et les gradients de densité des polysaccharides, peuvent être délétères pour la viabilité des îlots lorsqu’elles sont utilisées à température ambiante ou au-dessus16,17,18. Une comparaison des différentes stratégies de refroidissement du processeur de cellules pour la purification des cellules d’îlots par rapport au processeur de cellules non réfrigérées d’origine a été évaluée pour lutter contre l’augmentation incontrôlée de la température qui se produit en raison de la friction du rotor. Plusieurs tentatives ont été faites pour refroidir le processeur cellulaire lors de la purification des îlots de Langerhans humains. Le processeur de cellules peut être logé temporairement ou définitivement dans une chambre froide spécialement conçue pour maintenir une température de 0 à 8 °C19 pendant la centrifugation en gradient qui est actuellement utilisée dans les centres d’isolement des îlots de Langerhans de l’Université de l’Illinois à Chicago19, de l’Université de Miami14, des installations de l’Université d’Oxford15et l’Université de San Francisco (l’unité de refroidissement personnalisée enveloppe le processeur de cellules). Une autre modification comprend le refroidissement du cœur de l’axe du processeur de cellule avec un système de refroidissement utilisant un refroidissement à l’azote liquide contrôlé électroniquement à Genève, en Suède et en République tchèque15,19. Une autre alternative au milieu de l’année 2000 a été le refroidissement du cœur du processeur de cellules avec une unité de climatisation 12 ou par refroidissement liquide de l’arbre à l’Université de Lille.

Les modifications de refroidissement du processeur de cellule ne sont pas facilement disponibles et comportent des risques (humidité, accumulation de condensation) dans les environnements de salle blanche GMP, y compris la perte de garantie et le refus du constructeur d’entretenir la machine. Par conséquent, certains centres d’îlots, notamment Milan, en Italie, Oslo, en Norvège, et Édimbourg, en Écosse, n’utilisent pas de système de refroidissement pour les processeurs de cellules pendant le processus de purification des îlots15.

La présente étude a été conçue pour tester l’efficacité d’un refroidisseur facilement disponible nouvellement développé en conjonction avec un système de processeur de cellules minimalement modifié. En bref, le refroidisseur à air décrit ici est un échangeur de chaleur réfrigéré mécaniquement contrôlant la température de 1 pied cube standard par minute (SCFM) de gaz sec entre -40 °C et -100 °C. Ce système de refroidissement nécessite une alimentation en air médical sec. L’air circulera à travers la conduite et l’échangeur de chaleur et sortira par la buse (7,9 mm). Un élément chauffant situé à l’intérieur de la buse fournit de la chaleur pour contrôler la température du flux d’air. Un couvercle de centrifugeuse en plastique solide de rechange a été acheté et des modifications minimales ont été apportées. Un trou de 13,3 mm de diamètre a été percé dans le couvercle, et l’air refroidi a été acheminé de la buse de refroidissement au processeur de cellules via le trou dans le couvercle de la centrifugeuse. L’air médical refroidi a été injecté à l’intérieur du bol de centrifugation du processeur de cellule avec un contrôle constant de la température des liquides ou des gradients de densité.

Nous avons évalué les performances techniques du processeur de cellules refroidies et l’impact de l’élément de refroidissement sur l’environnement de la salle blanche GMP. L’objectif principal était d’atteindre une température très basse (<10 °C) lors de la purification des îlots de Langerhans afin de préserver la viabilité. En utilisant une séparation de densité de couche leucocytaire comme indicateur de l’isolement des îlots de Langerhans, nous avons déterminé l’efficacité de ce protocole de refroidissement sur la viabilité cellulaire.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole a utilisé du sang total mis au rebut qui ne convient pas selon les directives de l’établissement en matière de rejet. L’approbation de l’IRB et le consentement éclairé ne s’appliquent pas.

1. Configuration du processeur à cellules refroidies

REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans un environnement de salle blanche, et le personnel doit respecter les procédures de vêtements de salle blanche.

  1. Achat d’équipement
    1. Achetez un couvercle en plexiglas de rechange. Achetez le système d’équipement de refroidissement, le refroidisseur avec régulateur de température de flux de gaz réfrigéré mécaniquement, le sécheur d’air, le régulateur de pression et de débit, et la garantie (en option). Voir la table des matériaux pour les références.
      REMARQUE : Le coût total est de 16 133 $ sans les frais d’expédition ni les frais de douane.
    2. Commandez de l’air médical sec, un gaz médical comprimé conforme à la norme (référence de la pharmacopée européenne 1238) auprès du fournisseur local de gaz médicaux. Achat de 2 bouteilles de 6,8 m3 (47 L : 23 cm x 153 cm ; diamètre x longueur).
  2. Mise en place de l’équipement (Figure 1 et Figure 2)
    1. Entrez dans l’équipement dans la salle blanche GMP (désinfectez avant d’entrer dans la salle blanche selon les procédures GMP.
    2. Pour l’air comprimé de qualité médicale, installez une conduite de gaz au lieu de placer la bouteille de gaz directement dans la salle blanche.
  3. Modification du processeur de cellule pour le refroidissement
    1. Tout d’abord, retirez le couvercle en plexiglas. Conservez le couvercle en plexiglas d’origine au cas où il y aurait un problème avec la garantie. Percez un trou dans le couvercle de rechange du processeur de cellules d’un diamètre correspondant au diamètre extérieur de l’extrémité de la buse du dispositif de refroidissement pour éviter de fissurer le couvercle de la centrifugeuse (13,3 mm recommandés).
    2. Fixez les supports ensemble avec un morceau de mousse circulaire. Ceci est fait pour éviter la casse et/ou l’égratignure du couvercle, pour maintenir la buse de refroidissement en place au-dessus du processeur de cellules, pour protéger le couvercle contre la flexion excessive due à la haute pression de l’air injecté, pour supporter le poids de la buse, et enfin pour assurer la sécurité maximale de l’opérateur afin d’avoir un accès libre et sûr à toutes les fonctions requises du processeur de cellule pendant la procédure expérimentale.
    3. Connectez le système de refroidissement au processeur de cellules en fixant la buse de refroidissement au trou du plexiglas. Fixez-le avec des supports et des coussins en mousse.
    4. Placez le boîtier de réfrigération jusqu’à 8 pieds (2.44 m) de la buse. Rangez le régulateur de température dans une armoire séparée et placez-le à moins de 6 pieds (1,83 m) du boîtier de réfrigération.
    5. Réglez le point de consigne du refroidisseur à -40 °C pour refroidir le flux d’air sur le refroidisseur. La température de l’air de sortie est indiquée en permanence sur l’indicateur numérique jusqu’à une résolution de 0,1 °C. Réglez numériquement la température de sortie sur 0,1 °C à l’aide du régulateur de température.
    6. Contrôlez la pression et le débit de l’alimentation en air sur le module de régulation de pression et de débit (Figure 2) avant d’alimenter le refroidisseur. Réglez-les sur des débits de 55 psi et 4 SCFM, respectivement, pour atteindre les conditions optimales sur un flux d’air refroidi à -30 °C ± 2 °C.
    7. Vérifiez que l’alimentation en gaz médical est régulée à une pression de sortie de 5 bars et qu’elle peut durer au moins 90 min, car cela est nécessaire pour que l’air comprimé atteigne -30 °C.
      REMARQUE : L’air sec médical est un gaz médical comprimé et l’air sec entièrement pressurisé est conforme à la qualité standard.
    8. Lancez 5 bars à partir d’une buse de refroidissement connectée au couvercle du processeur de cellules à travers un trou percé dans le couvercle de la centrifugeuse. Injectez l’air médical refroidi à l’intérieur du bol de centrifugation du processeur de cellules (Figure 2). Sélectionnez la position de l’injection d’air de manière à ce que l’air refroidi soit dirigé perpendiculairement à la jante en aluminium du rotor de la centrifugeuse.
    9. Lors de la préparation du processeur de cellules, assurez-vous que le rotor est à température ambiante (18 °C). Réglez le thermorégulateur automatique du système de refroidissement sur -30 °C et dirigez les injections d’air froid vers le rotor.
      REMARQUE : Différentes conditions d’essai ont été testées pour atteindre un gradient de température optimal de +4 °C, ce qui est nécessaire pour surmonter la résistance thermique du système de séparation des cellules du processeur de cellules et l’échauffement du rotor pendant la centrifugation. Le thermorégulateur programmé maintiendra la température cible optimale à l’intérieur de la machine de traitement des cellules pendant le processus, en particulier pendant la centrifugation, à une température de salle blanche de +18 °C.
      1. Configurez le processeur de cellules avec la première phase de pré-refroidissement pour refroidir le processeur (sans le kit de processeur de cellules) à +3 °C pendant 30 à 45 min, et la deuxième phase de pré-refroidissement de l’exécution du processeur de cellules doit se faire avec le kit pré-refroidi à +4 °C à 134 x g, pendant 5 min.

2. Nombre de particules en suspension dans l’air

  1. Évaluer la conformité du dispositif de refroidissement avec l’environnement de salle blanche GMP conformément à la norme ISO 14644-1 afin d’évaluer l’impact des dispositifs de chauffage pendant la phase de fonctionnement.
  2. Utilisez la surveillance du comptage des particules pour prouver que le niveau de propreté requis est atteint aux points de contrôle critiques au repos et en fonctionnement.
    1. Le nombre minimum d’emplacements d’échantillonnage dépend de la zone mesurée. Calculez cela à l’aide de l’équation
      figure-protocol-13. Préparation de gradient et traitement de séparation cellulaire
      1. Avant l’expérimentation, prérefroidissez les gradients de densité légers et lourds et les kits de processeur de cellules pendant la nuit à +4 °C dans un réfrigérateur.
      2. Prérefroidissez le processeur de cellules pendant 45 minutes au repos (c’est-à-dire allumez le processeur de cellules avant de l’utiliser). Maintenez la température entre +2 °C et +5 °C. Insérez le kit de processeur de cellule pré-refroidi à +4 °C.
      3. Pour la machine à gradient à double enveloppe refroidie à l’éthanol standard (en option ; Figure 3) Connectez les 2 chambres en verre et placez-les sur un agitateur magnétique. Clamp le tube entre les 2 chambres. Refroidissez le générateur de gradient à l’aide d’un refroidisseur à circulation d’éthanol à 0 °C.
      4. Tout d’abord, préparez-vous à charger la couche épaisse au fond du sac en remplissant la chambre avec 130 ml de gradient de densité élevée (HD ; 1,087 g/mL). Charge à une vitesse de pompe de 150 mL/min.
      5. Une fois que le gradient élevé est dans le sac, ajoutez 130 mL de gradient haute densité (HD) dans le bécher avant et 140 mL de gradients de faible densité (LD ; 1,063 g/mL) à l’arrière (pince fermée).
      6. Décesser l’hémostat/pince entre les 2 chambres et créer une pente continue à une vitesse de pompe de 50 mL/min.
      7. Préparez à l’avance des cellules mononucléaires humaines de la couche leucocytaire pour la purification à partir de plusieurs couches leucocytaires anonymes recueillies à partir de déchets de sang total (40 ml à 60 ml de sang total ont été ajoutés à 10 sacs de couche leucocytaire) selon la disponibilité de la banque de sang.
        1. Séparation des multinationales
          1. Utilisez la centrifugation à gradient de densité pour l’isolement de cellules mononucléées humaines à faible densité. Pour ce faire, suivez les étapes décrites ci-dessous.
          2. Pour la préparation cellulaire, calculez le volume de sang (sang total anticoagulé ou couche leucocytaire en suspension). Diluer le sang avec une solution tampon 2x-4x par inversion de mélange. Plus le sang est dilué, meilleure est la pureté des cellules mononucléaires.
          3. Préparez le tampon en mélangeant le tampon phosphate avec un anticoagulant. Calculez le nombre de tubes nécessaires en divisant le volume de sang par 35 mL et versez 15 mL de solution à gradient de densité 1,073 dans chaque tube.
          4. Superposer graduellement 35 mL de suspension de sang dilué sur le gradient de densité en passant doucement sur la surface du gradient de densité à l’aide d’une seringue de 60 mL reliée à une aiguille ; pour les petits volumes, utiliser une pipette. Essayez de ne pas perturber l’interface, car cela entraînerait une couche mononucléaire médiocre.
          5. Centrifugeuse à 400 x g pendant 20 min à 20 °C sans aucune interruption (accélération 0, décélération 0). Après la centrifugation, prélever délicatement la couche d’interface des cellules mononucléées à l’aide d’une pipette de transfert stérile. Transférez les cellules dans un autre nouveau tube conique de 50 ml.
          6. Lavez les cellules 2x avec un tampon (PBS avec anticoagulant ajouté). Pour le premier lavage, remplissez le tube contenant les cellules avec un tampon jusqu’à 50 ml. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 20 °C sur les cellules de granulés (accélération 9, décélération 0). Retirez délicatement tous les surnageants avec soin.
          7. Effectuez le deuxième lavage pour l’élimination des plaquettes. Remettre la pastille en suspension à un volume de 50 mL avec tampon. Centrifugeuse à 200-300 x g pendant 10 min à 20 °C (accélération 9, décélération 0).
          8. Reconstituez les cellules jusqu’à un volume final de 5 ml, ces cellules doivent avoir une densité ressemblant à une MNC de faible densité <1,073. Mesurez la densité spécifique du gradient à l’aide d’un densimètre.
          9. Remettre la pastille en suspension jusqu’à un volume final de 100 mL avec 95 mL de milieu à gradient haute densité (1,083 g/mL) dans un sac de transfert. Utilisez ce produit pour la purification à l’aide d’un séparateur de cellules. Le volume final de 100 mL contient des cellules et 1.083 milieu à gradient haute densité.
            REMARQUE : La couche leucocytaire peut être conservée au réfrigérateur pendant la nuit dans du PBS contenant 0,5 % de BSA ou du plasma autologue. La couche leucocytaire peut également être lavée.
      8. Chargez les gradients préformés avec un maximum de 30 mL de MNC isolé de la couche leucocytaire en suspension dans 100 mL de milieu de conservation concentré à l’aide d’une pompe péristaltique à 25 mL/min. Maintenez le gradient à +4 °C.
      9. Mesurez en continu la température à l’intérieur du processeur de cellule à l’aide d’une sonde thermosonde pré-calibrée. À l’aide d’un thermocouple numérique connecté à une thermosonde stérile, surveillez la température des gradients et des cellules pendant le processus.

      4. Optimisation des différentes étapes de chargement de gradient

      1. Insérez le kit de processeur de cellules pré-refroidi à +4 °C. Chargez le gradient lourd (130 mL) à + 4,5 °C. À la fin du chargement par gradient, réglez la centrifugeuse à une vitesse relativement faible (537 x g) afin de minimiser la chaleur générée par le rotor.
      2. Éteignez le processeur de cellule pour permettre au système hydraulique de revenir aux niveaux d’avant la course et de libérer de l’air.
      3. Redémarrez le processeur de cellules à 537 x g et ajoutez les gradients de densité lourde (130 ml) et faible (140 ml) pour créer un gradient de densité continu à +4,3 °C et un débit de 50 ml/min.
      4. Chargez la couche leucalaire (30 ml) avec 100 ml de fluide de conservation au froid à +6 °C et un débit de 25 ml/min. Ajouter 50 ml (25 ml x 2) de solution de lavage.
      5. Après 5 min à +5 °C, collecter le gradient filé dans 12 bouteilles à un débit de 100 mL/min.
      6. Remplissez les tubes avec du produit de lavage (M199 + 20 % d’albumine humaine + 10 % de pénicilline streptomycine). Remplissez le tube 1 avec 100 ml de produit de lavage et 150 ml de cellules et les tubes 2 à 12 avec 225 ml de produit de lavage et 25 ml de cellules.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’impact du processeur de cellules refroidies sur la salle blanche GMP a d’abord été quantifié. Les méthodes standardisées ont utilisé un compteur de particules mesurant la contamination par les particules en suspension dans l’air dans un environnement de salle blanche de classe C et de classe B BPF à des points critiques à proximité du processeur de cellules et du système de refroidissement à air comprimé. Les résultats ont démontré qu’aucune turbulence ne s’est développée autour de l’équipement. Les données enregistrée...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les installations d’isolement des îlots pancréatiques du monde entier adoptent depuis des décennies la purification des îlots humains dans un processeur de cellules réutilisé. Bien que certaines installations de production d’îlots continuent de traiter les îlots dans un processeur de cellules non réfrigéré, la plupart des centres utilisent une version réfrigérée du processeur de cellules 10,11,15. Les centres placent soit le pro...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier l’Institut européen de génomique pour le diabète (ANR-10- LABEX-0046 à FP) et l’Institut métabolique du Qatar - Hamad medical corporation, Qatar. Les auteurs remercient également le Centre de recherche médicale de la Hamad Medical Corporation pour le soutien aux frais de traitement des articles.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Équipement
Compteur de particules d’airLasair III  ;
AirJet XR40° ;SP ScientificSystème FTS XR40
Armoire de biosécuritéThermo ScientificEQ-1301
Refroidisseur à circulationJulaboCF30
COBE 2991  ;Terumo BCT
Plateau de refroidissement coniqueBiorepCCT-01
Fabricant de dégradé à double enveloppe  ;personnalisé en interne
KJT-Thermocouple ThermomètreHanna Instruments HI93551NPour mesurer la température des liquides
Agitateur magnétique  ;Thermo Scientific88880014
Pompe péristaltique  ;MasterFlexMK-77921-79
  ;Extech InstrumentsRMS 430Pour Bain
Perles Sans Eaude température COBE Cole-Parmer10122-00
Matériaux et réactifs
BD Kit de dénombrement de cellules souchesBD Biosciences  ;
COBE 2911 kit de tubulureTerumo BCT90819
Tubes coniques 250mlCorning430776
Gradient densité 1.1Biochrom  ;L6155
Bouteilles jetables graduéesThermo fisher382019-1000
Albumine humaine 20 %  ;Kedrion Biopharma8091600
M199 solution de lavage  ;Corning  ;99-784-CM  ;
Tubes MasterflexMasterflex 96400-6
Medical Dry AirLinde HealthcareMedi On 22
Pencillin-streptomycin  ;Gibco  ;
ThermosondeBiorepTC-02Thermocapteur
Trypan bleu  ;Sigma Aldrich15250061
Université du Wisconsin Belzer (UW)  ;Pont de la Vie  ;RM/N 4055Milieu de conservation
Thermomètre de 34456315140122

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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