Un ensemble de techniques de dépistage pour un aperçu rapide de la fonction des neutrophiles

Résumé

Ce protocole comprend un ensemble de tests fonctionnels des neutrophiles à utiliser comme méthode de criblage pour couvrir les fonctions de différentes voies de signalisation. Le protocole comprend une évaluation initiale et simple de la viabilité cellulaire, de la pureté, de la production d’espèces réactives de l’oxygène, de la migration en temps réel, de la phagocytose et d’une suggestion préliminaire de pièges extracellulaires à neutrophiles.

Résumé

Les neutrophiles sont connus comme l’une des premières lignes de défense de la réponse immunitaire innée et peuvent remplir de nombreuses fonctions cellulaires particulières, telles que la chimiotaxie, la migration inverse, la phagocytose, la dégranulation des enzymes et des métabolites cytotoxiques et la libération d’ADN sous forme de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE). Les neutrophiles ont non seulement une signalisation étroitement régulée, mais participent également à la régulation d’autres composants du système immunitaire. Comme les neutrophiles frais sont différenciés en phase terminale, de courte durée de vie et très variables d’un individu à l’autre, il est important de tirer le meilleur parti des échantillons collectés. Les chercheurs doivent souvent effectuer des tests de dépistage pour avoir une vue d’ensemble des nombreuses fonctions des neutrophiles qui peuvent être affectées par des conditions spécifiques en cours d’évaluation. Une série de tests suivant un seul processus d’isolement de neutrophiles de densité normale a été développée pour répondre à ce besoin, en recherchant un équilibre entre la rapidité, l’exhaustivité, le coût et la précision. Les résultats peuvent être utilisés pour raisonner et guider des études de suivi approfondies. Cette procédure peut être réalisée dans un temps moyen de 4 h et comprend l’évaluation de la viabilité cellulaire, de la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), de la migration en temps réel et de la phagocytose de la levure sur des lames de verre, laissant suffisamment de cellules pour des approches plus détaillées telles que les études omiques. De plus, la procédure comprend un moyen d’observer facilement une suggestion préliminaire de TNE après une coloration panoptique rapide observée par microscopie optique, avec un manque de marqueurs spécifiques, mais suffisamment pour indiquer si des efforts supplémentaires dans ce sens en vaudraient la peine. La diversité des fonctions testées combine des points communs entre les tests, réduisant ainsi le temps et les coûts d’analyse. La procédure a été nommée NeutroFun Screen, et bien qu’elle ait des limites, elle équilibre les facteurs susmentionnés. De plus, l’objectif de ce travail n’est pas d’établir un ensemble de tests défini, mais plutôt une ligne directrice qui peut être facilement adaptée aux ressources et aux exigences de chaque laboratoire.

Introduction

Les neutrophiles sont les cellules immunitaires innées les plus abondantes dans le sang humain et sont connues pour jouer un rôle majeur dans l’infection et l’inflammation, étant les premiers intervenants à arriver sur le site des lésions tissulaires¹. Ces dernières années, il y a eu une reconnaissance croissante du rôle crucial que jouent les neutrophiles dans une variété de maladies et dans le soutien de l’homéostasie². Les neutrophiles ont non seulement une signalisation étroitement régulée, mais participent également à la régulation d’autres composants du système immunitaire ^3,4,5. Par conséquent, l’étude des neutrophiles et de leurs nombreuses fonctions cellulaires inhabituelles, telles que la chimiotaxie, la migration inverse⁶, la phagocytose⁷, l’explosion respiratoire⁸ et la libération de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE)⁷, est impérative dans de nombreux contextes de recherche où il est nécessaire d’évaluer les changements fonctionnels, morphologiques ou moléculaires potentiels des neutrophiles déclenchés par des conditions spécifiques en cours d’analyse.

Les neutrophiles fraîchement isolés sont différenciés en phase terminale, de courte durée, très dynamiques et facilement activés⁹. Cependant, une méthode de stockage efficace qui n’affecte pas les réponses des neutrophiles n’a pas encore été mise au point, ce qui rend difficile la réalisation de plusieurs tests qui doivent être ininterrompus. De plus, les analyses fonctionnelles décrites précédemment^10,11, basées sur des tests qui nécessitent une cytométrie et/ou une coloration fluorescente, peuvent ne pas être un choix viable lorsqu’une évaluation large et initiale du neutrophile est nécessaire.

Pour répondre à ces questions, ce protocole décrit un ensemble de tests qui peuvent être effectués à la suite d’un seul processus d’isolement, y compris l’évaluation de la viabilité cellulaire, la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), la migration en temps réel et la phagocytose de Saccharomyces cerevisiae, dont les résultats peuvent être utilisés pour raisonner des études de suivi approfondies. Cette procédure, baptisée NeutroFun Screen, a été conçue pour englober les principales activités effectrices, à l’exception de la dégranulation, et peut être réalisée en un temps moyen de 4 h, dont 1 h d’activation. De plus, les cellules restantes peuvent être utilisées pour des approches plus détaillées telles que des études omiques. L’avantage de cette méthode réside dans son équilibre entre la rapidité, l’exhaustivité, le coût et la précision.

De plus, il existe un moyen d’observer facilement une suggestion préliminaire de TNE, sans marqueurs spécifiques, mais suffisamment pour indiquer si des efforts supplémentaires dans cette direction en vaudraient la peine. La diversité des fonctions testées vise à combiner les points communs entre les tests, réduisant ainsi le temps et les coûts d’analyse. L’objectif principal de cette méthode est de fournir une analyse fonctionnelle équilibrée en ce qui concerne la vitesse, l’exhaustivité, le coût et la précision qui permet d’avoir une vue d’ensemble de la réponse du neutrophile, ce qui en fait une première étape utile dans l’étude des effets de nouveaux stimuli sur les neutrophiles de densité normale.

Protocole

Toutes les expériences ont strictement suivi les directives éthiques établies par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Brasilia (processus 13364819.0.0000.5558), et les échantillons ont été identifiés par des codes pour garantir l’anonymat des donneurs. Les cellules ont été obtenues auprès de donneurs masculins normaux en bonne santé âgés de 18 à 35 ans, qui ont signé le consentement éclairé et répondaient aux critères d’admissibilité suivants : non-fumeurs/vapoteurs, aucun problème de santé chronique et aucun antécédent de troubles inflammatoires au cours des 14 derniers jours.

1. Prélèvement sanguin

1. Placer de manière aseptique 0,3 mL d’héparine à 5 000 UI/mL (voir le tableau des matériaux) dans une seringue stérile de 20 mL pour l’hépariniser.
2. Appliquez un garrot veineux à environ 4 pouces au-dessus du site de ponction et identifiez la veine cubitale ou céphalique médiane pour la ponction veineuse.
   REMARQUE : Assurez-vous que le temps total du garrot ne dépasse pas 1 min.
3. Nettoyez le site de ponction avec de l’alcool à 70% et effectuez la ponction veineuse.
4. Retournez doucement la seringue trois ou quatre fois après avoir recueilli le sang pour bien mélanger le sang et l’héparine.

2. Isolement des neutrophiles

NOTE : Les leucocytes polymorphonucléaires (PMN) sont isolés par centrifugation par gradient de densité suivie d’une lyse hypotonique des globules rouges (GR) restants, comme décrit précédemment¹¹ avec quelques modifications. Cette méthode n’est pas obligatoire pour effectuer les tests de criblage et peut être remplacée tant que la méthode choisie permet d’obtenir une viabilité de >97 %, un amorçage ou une activation de <3 % des PMN, et qu’elle donne suffisamment de cellules pour tous les essais, répétitions et conditions. Il est obligatoire d’effectuer ces étapes dans des conditions aseptiques et d’utiliser des solutions exemptes d’endotoxines pour éviter l’activation cellulaire.

1. Faire des dilutions de 12 mL de milieux de séparation à 60 % et à 70 % (disponibles dans le commerce ; voir le tableau des matériaux) dans des tubes coniques de 50 mL.
2. Préparez le gradient de bas en haut en ajoutant 4 mL à la fois de la dilution de 60 % sur la dilution de 70 %, à l’aide d’une pipette de 5 mL. Faites-le doucement pour éviter de mélanger l’interface.
3. Déposer délicatement 12 ml de sang hépariné sur le gradient de densité. Centrifuger à 200 x g pendant 15 min à température ambiante.
   REMARQUE : À partir de cette étape, jusqu’à l’activation du PMN, tous les réactifs et tubes utilisés doivent être conservés dans une glacière remplie de glace.
4. Jeter la couche de plasma/cellule mononucléée, puis transférer délicatement la couche au-dessus de la pastille érythrocytaire dans deux tubes coniques de 15 ml d’environ 7,5 ml chacun. Complétez le volume du tube avec la solution saline équilibrée de Hank (HBSS ; voir le tableau des matériaux).
5. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 19 °C.
6. Lavez la pastille cellulaire avec HBSS.
   1. Jeter le surnageant en versant le tube et remettre délicatement la pastille en suspension dans 7 mL de HBSS.
   2. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 19 °C pour éliminer tous les milieux de séparation.
7. Effectuer une lyse hypotonique des globules rouges restants.
   1. Jetez le surnageant et mélangez les granulés dans un seul tube.
   2. Remettre en suspension la pastille de globules rouges/PMN dans 3 mL de H₂O stérile et ajouter 3 mL d’HBSS (2x) dans les 25 s pour rétablir l’osmolarité. Ensuite, centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 19 °C.
   3. Répétez les étapes 2.8.1 et 2.8.2 pour obtenir une pastille blanche sans érythrocytes.
      REMARQUE : Le surnageant doit être retiré dès que possible afin de minimiser le contact des neutrophiles avec les produits de dégradation des globules rouges. Alternativement, la deuxième lyse hypotonique peut être remplacée en remettant doucement en suspension la couche résiduelle de globules rouges et en enlevant tout le surnageant, car les globules rouges restants sédimenteront au-dessus de la pastille de PMN.
8. Jetez le surnageant en versant le tube, remettez doucement en suspension les PMN dans le tampon restant et transférez-les dans un microtube glacé.
   REMARQUE : Assurez-vous d’annoter le volume lors du transfert des cellules remises en suspension à l’aide d’une micropipette.
9. Transférer 3 x 1 μL de la suspension cellulaire sur une lame de verre propre (trois puits de 1 μL chacun) et colorer avec des panoptiques rapides (voir le tableau des matériaux) pour l’évaluation de la morphologie et de la pureté¹².
   1. Pour colorer avec le panoptique rapide, immergez la lame cinq fois dans le fixateur panoptique n° 1, six fois dans l’éosine n° 2 et deux fois dans l’hématoxyline n° 3, chaque immersion durant 1 s.
   2. Lavez délicatement la lame en verre avec de l’eau distillée.
   3. Laisser égoutter et sécher à l’air libre.
10. Observez au microscope et comptez 300 cellules aléatoires dans chaque puits, différenciant ainsi les neutrophiles des autres granulocytes.
11. Transférer 1 μL de la suspension cellulaire sur 49 μL de colorant bleu de trypan à 0,2 %¹³ et compter les cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer, en distinguant les cellules mortes des cellules viables.
12. Ajustez la concentration cellulaire à 6 667 cellules/μL à l’aide d’une solution de plasma autologue à 50 % et d’HBSS à 50 % complétée par du calcium et du magnésium. Répartir uniformément les 6 667 cellules/μL de suspension entre les microtubes correspondant aux conditions à tester, y compris le témoin négatif.
    REMARQUE : Toute concentration cellulaire similaire aux neutrophiles circulants dans l’organisme modèle peut être utilisée, mais il est important d’utiliser la même concentration cellulaire dans toutes les expériences pour la reproductibilité.

Figure 1 : Protocole d’isolement des neutrophiles. Deux concentrations du milieu de séparation (percoll) (A) sont empilées (B), puis le sang est superposé au-dessus du gradient de séparation (C). Après centrifugation, le PMN se trouve dans la couche centrale (D), qui est divisée en deux tubes de 15 ml (E). La suspension cellulaire est lavée deux fois dans HBSS et centrifugée (G-I) pour éliminer le milieu, puis les cellules sont remises en suspension et les globules rouges résiduels sont soumis à deux cycles de lyse hypotonique (J-M). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Préparation à l’activation des neutrophiles

1. Dans des microtubes de 1,5 mL, préparer un système d’activation pour chaque condition de manière à ce que la concentration cellulaire finale soit de 6 600 cellules/μL. Par exemple, pour tester les effets de 100 nM de fMLP (N-formyl-méthionyl-leucyl-phénylalanine ; voir le tableau des matériaux), ajoutez 5 μL de 10 μM fMLP à 495 μL de la suspension de 6 667 cellules/μL. Pour le témoin négatif (non stimulé), ajouter de l’HBSS contenant du Ca²⁺ et du Mg²⁺.
   NOTA : Pour démontrer cette méthodologie, les concentrations finales suivantes des stimuli ont été utilisées : 100 nM de fMLP, 16 μM de fallaxine, un peptide antimicrobien naturel¹⁴, et 100 nM de PMA (phorbol 12-myristate 13-acétate) (voir le tableau des matériaux).
2. Incuber à 37 °C sans rotation.
   NOTA : Toutes les aliquotes pour les essais fonctionnels sont prélevées sur cette suspension cellulaire, ci-après dénommée le système d’activation.

4. Dosage du chlorure de bleu de nitrotétrazolium (NBT) pour l’évaluation de la production de ROS

1. Préparation de la solution de travail NBT : Pour chaque condition expérimentale, préparer une solution de travail NBT ( voir le tableau des matériaux) de 6 mM en suivant les étapes suivantes :
   1. Dissoudre 0,0005 g de NBT dans 10 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) et de vortex pendant au moins 15 minutes.
   2. Ajouter 90 μL de HBSS Ca²⁺Mg²⁺ et vortex jusqu’à 2 min.
      REMARQUE : Toutes les étapes impliquant la NBT doivent être effectuées dans l’obscurité.
2. Effectuez un test de glissement NBT.
   1. Après 20 min d’activation cellulaire, mélangez délicatement la suspension cellulaire et transférez soigneusement 2 μL de PMN sur une lame de verre propre. Incuber pendant 20 min dans une chambre humidifiée à 37 °C.
      REMARQUE : N’étalez pas trop la suspension de cellules sur la lame ; sinon, il risque de se dessécher avant l’incubation.
   2. Ajouter 1 μL de la solution de travail NBT sur les cellules et incuber pendant 20 minutes à l’abri de la lumière.
   3. Séchez la lame à l’air chaud et fixez-la avec une goutte de méthanol dans chaque puits pendant 1 min. Colorer avec 0,03 % de safranine (voir tableau des matériaux) pendant 1 min.
   4. Lavez délicatement la lame en verre avec de l’eau distillée.
   5. Laissez la lame sécher à l’air libre et observez-la au microscope.
   6. Comptez 100 cellules aléatoires dans chaque puits, en différenciant les neutrophiles avec et sans dépôts de formazan.
3. Effectuer un test de spectrophotométrie NBT.
   1. Après 40 min d’activation cellulaire, mélangez délicatement la suspension cellulaire et transférez 90 μL de PMN du système d’activation vers un microtube propre. Ensuite, ajoutez délicatement 20 μL de la solution NBT de 6 mM. Incuber dans l’obscurité pendant 20 min à 37 °C.
   2. Ajouter 100 μL de dodécylsulfate de sodium à 10 % (FDS ; voir le tableau des matériaux) et le vortex.
   3. Soniser à l’aide d’un sonicateur à pointe à une amplitude de 60%, cinq cycles de 15 s chacun avec des intervalles de 15 s. Centrifuger à 12 000 x g pendant 5 min.
   4. Transférer 60 μL du surnageant dans une plaque à fond transparent à 96 puits et mesurer l’absorbance du produit formazan à 570 nm.

5. Test de phagocytose

1. Préparez une suspension de 33 000 levures/μL pour chaque condition, comme décrit ci-dessous :
   1. Ajouter environ 0,75 mg de levure sèche (Saccharomyces cerevisiae ; voir le tableau des matériaux) à 200 μL de HBSS Ca²⁺Mg²⁺ et incuber dans un thermomélangeur à 100 °C à 500 tr/min pendant au moins 15 min.
   2. Homogénéiser le mélange par vortex et transférer 5 μL de suspension de levure à 45 μL de colorant bleu trypan à 0,2 %. Comptez les levures à l’aide d’une chambre Neubauer.
   3. Ajustez la concentration de la suspension initiale à 33 000 cellules de levure/μL à l’aide de HBSS Ca²⁺Mg²⁺. Gardez la suspension sur la glace jusqu’à utilisation.
2. Après 20 min d’activation cellulaire, mélangez délicatement la suspension cellulaire et transférez 5 μL du système d’activation à 5 μL de la suspension de 33 000 levures/μL de Saccharomyces cerevisiae dans un nouveau microtube stérile.
   REMARQUE : Le rapport neutrophiles/levure est de 1 :5 (PMN :levure).
3. Transférez immédiatement 6 μL de la suspension PMN/levure dans trois puits d’une lame de verre propre (2 μL chacun) et incubez la lame dans une chambre humidifiée pendant 40 min.
   REMARQUE : N’étalez pas trop la suspension de cellules sur la lame ; sinon, il risque de se dessécher avant l’incubation.
4. Séchez la lame sous l’air chaud et teignez-la avec un panoptique rapide, comme décrit à l’étape 2.9 ci-dessus.
   REMARQUE : La troisième étape de la coloration panoptique rapide est essentielle à l’analyse microscopique de la lame. La coloration de la lame pendant ≥3 s à cette étape peut la rendre impropre à l’analyse, car il sera difficile de différencier la levure des lobes nucléaires des neutrophiles.
5. Observez les lames au microscope, en comptant 100 neutrophiles aléatoires de chaque puits et en faisant la distinction entre les PMN positifs et négatifs pour la phagocytose.
   REMARQUE : Au moins une particule de levure à l’intérieur ou en contact direct avec la membrane cellulaire PMN indique un PMN positif pour la phagocytose. Si vous vous intéressez au rapport levure/neutrophile, comptez également le nombre de particules de levure englouties.

6. Test de chimiotaxie PMN en temps réel

NOTE : L’essai de migration est effectué de la même manière que le protocole décrit ci-dessus¹⁵, avec les adaptations suivantes :

1. Préparez le gradient chimiotactique en ajoutant 160 μL de chimioattractant (p. ex., fMLP, IL-8, C5 ou LTB4 ; voir le tableau des matériaux) dans la chambre inférieure d’une plaque d’analyseur de cellules en temps réel (RTCA) à impédance. Pour les témoins négatifs et les blancs, ajouter 160 μL d’HBSS Ca²⁺Mg²⁺.
2. Fixez la chambre supérieure et ajoutez 25 μL de HBSS Ca²⁺Mg²⁺. Incuber à température ambiante pendant au moins 1 h pour former le gradient chimiotactique.
3. Après 60 min d’activation cellulaire, mélangez délicatement la suspension cellulaire et placez 60 μL de suspension cellulaire dans la chambre supérieure. Ajouter 60 μL de HBSS Ca²⁺Mg²⁺ dans le blanc.
4. Placez la plaque RTCA et programmez le logiciel RTCA pour mesurer l’indice cellulaire (IC) toutes les 60 s pendant 2 h.
   REMARQUE : Les plaques RTCA peuvent être lavées pour être réutilisées comme décrit précédemment¹⁶. En résumé, lavez les chambres et les électrodes RTCA avec une solution saline phosphatée (PBS) trois fois, puis deux fois avec de l’eau ultrapure de type I. Incuber la chambre inférieure et la chambre supérieure avec 0,25 % de trypsine 0,53 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pendant 40 min. Laver trois fois à l’eau ultra-pure.

7. Essai suggestif NET

1. Après 10 min d’activation cellulaire, mélanger délicatement la suspension cellulaire et transférer 4 μL de PMN de chaque système d’activation évalué, divisés en deux puits d’une lame de verre propre. Incuber dans une chambre humidifiée à 37 °C pendant 30 min.
2. Ajouter 1 μL d’ADN I dans l’un des puits et incuber pendant 20 min à 37 °C (dans une chambre humide).
3. Séchez la lame et colorez avec un panoptique rapide, comme décrit précédemment à l’étape 2.9 de la section « Isolation des neutrophiles ».
4. Évaluez les lames au microscope.
   REMARQUE : Recherchez toute indication de libération de NET, caractérisée par la présence de structures en forme de toile. Une fois identifié, confirmez si le traitement à l’ADN I était capable d’éliminer de telles structures. Ce test suggère la formation de TNET, car des tests supplémentaires sont nécessaires pour confirmer leur présence.

Résultats

La méthode d’isolement basée sur la densité utilisée dans cette étude (figure 1) répondait aux critères des expériences proposées. Les paramètres des neutrophiles obtenus par cette méthode comprenaient la viabilité ≥98 %, la pureté ≥94 %) et le rendement cellulaire ≥1,5 x 10⁷, sans activation détectable par les tests de dépistage. Deux étapes pertinentes dans l’isolement des NMP sont l’anticoagulation et l’élimination des globules rouges. Le fait de maintenir le tube ou la seringue de sang anticoagulé à un léger balancement avant de superposer le gradient de densité et de choisir une méthode d’élimination des globules rouges pour éviter à la fois l’activation et la contamination peut influencer le rendement et la reproductibilité de l’expérience.

Afin d’évaluer la vue d’ensemble fonctionnelle de la fonction des neutrophiles, un flux de travail a été développé qui a permis d’effectuer les tests de criblage proposés avec au moins deux chercheurs dans un temps moyen de 4 h, avec 1 h d’activation et 2 h de surveillance de la migration en temps réel, comme le montre la figure 2.

Figure 2 : Le flux de travail de NeutroFun Screen. Afin d’évaluer le panel de réponses fonctionnelles déclenchées par des conditions spécifiques en cours d’évaluation, le flux de travail NeutroFun Screen inclut la participation d’au moins deux chercheurs. Le chercheur 1 (R1) démarre le processus d’isolement du PMN, suivi de l’ajustement de la concentration cellulaire et de l’incubation du système d’activation, tandis qu’en parallèle, le chercheur 2 (R2) prépare les matériaux pour effectuer les tests suivants, qui sont répartis entre les deux : R1 effectue des tests de phagocytose, de TNE et de NBT spectrophotométrique ; R2 effectue des tests de migration et de glissement NBT en temps réel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le test NBT classique¹⁷ a été optimisé pour l’évaluation à la fois de la lame et de la spectrophotométrie de la formation de formazan résultant de la réaction de NBT avec les ROS générés par les PMN. Le test spectrophotométrique a permis une quantification relative entre les conditions, tandis que le test de microscopie a été utile pour l’analyse descriptive et semi-quantitative, évaluant la régularité de la distribution des cristaux, la morphologie et le nombre de cellules contenant du formazan. Les résultats de l’essai spectrophotométrique sont présentés à la figure 3A, indiquant que la PMA de 100 nM a induit une production élevée de ROS (dans un rapport moyen de 3 :2 :1) par rapport au fMLP et aux groupes témoins. Les résultats des tests de lame NBT (Figure 3B) ont corroboré les résultats spectrophotométriques, montrant également que le PMA est le stimulus induisant la production de ROS le plus intense par rapport au fMLP (Figure 3C), comme l’a précédemment démontré la mesure directe des ROS par cytométrie¹⁸. En ce qui concerne le comptage cellulaire, le nombre de neutrophiles contenant des cristaux de formazan a montré un rapport de 7 :4 :1 dans les conditions PMA :fMLP :contrôle, révélant également des modèles de distribution de formazan différents entre les PMN activés par le fMLP et les PMA activés par PMA ; Le traitement par fMLP a entraîné l’activation intensive des cellules individuelles, tandis que la PMA a induit la formation de cristaux de formazan dispersés dans le cytoplasme dans la majorité des PMN. De plus, quelques caractéristiques morphologiques différenciant les conditions ont été observées, telles que l’agrégation cellulaire expressive après un traitement par PMA. L’absence de telles caractéristiques d’activation typiques et les faibles niveaux de formazan dans le groupe témoin ont indiqué que l’état de repos n’était pas significativement perturbé. Par conséquent, le test NBT s’est avéré être un test simple, peu coûteux et fiable pour la production de ROS neutrophiles qui peut être utilisé pour avoir une vue d’ensemble de la capacité et de l’intensité d’un stimulus donné à induire la production de ROS.

Figure 3 : Test NBT. (A) L’évaluation spectrophotométrique de l’éclatement respiratoire des neutrophiles dans différentes conditions (contrôle négatif : 100 nM fMLP et 100 nM PMA) par absorbance formazan (490-630 nm). Les données de quatre donneurs sont présentées sous forme de moyenne ±écart-type (ET). * = tous les groupes sont différents les uns des autres (p≤ 0,05) ; £ = Les comparaisons CTRL par rapport à PMA et fMLP par rapport à PMA montrent des différences significatives (p ≤ 0,05). (B) Le test sur lame peut être analysé qualitativement, caractérisant l’intensité des dépôts de formazan, leur emplacement dans la cellule et l’agrégation cellulaire. Les flèches noires pointent vers des cristaux de formazan. Barres d’échelle : 20 μm. (C) Nombre de PMN contenant du formazan, compté par microscopie optique. Les données de huit donneurs sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. *** p < 0,0001, test t de Student. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les lames de phagocytose ont été utilisées pour déterminer le taux de phagocytose en pourcentage de neutrophiles effectuant une phagocytose, comme le montre la figure 4. Bien que le fMLP de 100 nM et le peptide antimicrobien de 16 μM aient induit une augmentation apparente de l’engloutissement de levure, la différence n’était pas statistiquement significative jusqu’à la double stimulation, ce qui a considérablement amélioré la phagocytose par rapport au groupe témoin et pourrait suggérer une réponse lors de la double stimulation.

Figure 4 : Test de phagocytose. Les neutrophiles ont été évalués en fonction de leur capacité de phagocytose (comptage des neutrophiles contenant des levures). Bien que l’exposition à 100 nM de fMLP ou à un peptide antimicrobien de 16 μM avant l’incubation de la levure ait augmenté la phagocytose par rapport au groupe témoin, (A) l’augmentation n’était pas statistiquement significative. Il est intéressant de noter qu’une incubation initiale avec le fMLP, suivie de l’ajout du peptide antimicrobien, a entraîné une phagocytose significativement accrue chez les neutrophiles humains (astérisque entre CTRL et le peptide antimicrobien fMLP+). (B) Les flèches noires montrent les cellules de levure, les flèches vertes montrent les neutrophiles seuls et les flèches rouges indiquent les neutrophiles phagocytants. Les données de cinq donneurs sont présentées comme moyennes ±écart-type. Barres d’échelle : 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Un exemple de résultats de migration cellulaire en temps réel est présenté à la figure 5, montrant l’effet chimiotactique bien connu de 100 nM fMLP sur les neutrophiles. La cinétique de migration cellulaire a été ajustée au modèle de Gompertz, ce qui a permis de comparer ses paramètres.

Figure 5 : Migration cellulaire en temps réel. L’indice de cellule reflète l’impédance électrique résultant de la migration des cellules. Dans ce test, le fMLP a été utilisé comme contrôle positif de la migration des neutrophiles en ajoutant 100 nM de fMLP à la chambre inférieure. Un témoin négatif (CTRL) ne contenait que du HBSS dans la chambre inférieure. Les courbes superposées représentent la courbe ajustée au modèle de Gompertz, modifiée pour s’adapter au mieux aux pentes ascendantes et descendantes. Données provenant de trois donneurs, présentées sous forme de moyenne ± écart-type.* p < 0,05, test t de Student. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Enfin, un test de microscopie optique simple suggérant la présence de TNE est présenté, dans lequel les PMN sont colorés avec du panoptique rapide. Il est possible d’observer que pour certains stimuli spécifiques induisant des TNE, tels que le PMA ou certains peptides antimicrobiens, même après un court temps d’activation (1 h), il est possible d’observer des structures filamenteuses en forme de toile à proximité des cellules, alors que cela n’est pas possible dans d’autres conditions comme le contrôle négatif et le fMLP (Figure 6). Pour mieux étayer cette affirmation, la DNase I a été ajoutée après 40 minutes d’activation cellulaire avec 100 nm de PMA ou un peptide antimicrobien, en supprimant les structures de type TNE (Figure 6). Bien que cette méthode ne soit pas adaptée à la caractérisation des TNE et qu’elle puisse être influencée par des artefacts, il s’agit d’un point de départ peu coûteux, simple et intéressant pour justifier des investissements supplémentaires dans l’analyse des TNE, en particulier dans des contextes où les effets des stimuli sont inconnus ou mal décrits.

Figure 6 : Essai suggestif de formation de NET. Une analyse qualitative des neutrophiles colorés au panoptique après 1 h d’activation sur une lame de verre peut indiquer une libération de TNE. Les groupes CTRL (A,B) et fMLP (C,D) n’ont montré aucune indication de libération de TNE, tandis que l’activation avec PMA (E-H) a induit la formation de structures de type TNE qui ont été dégradées par le traitement par DNase I (I-L). L’étude des effets d’un peptide antimicrobien sur les neutrophiles a montré qu’un tel stimulus pourrait être capable de provoquer la libération de NET, puisque les lames présentaient les structures de type TNE (M-P) qui ont été dégradées par la DNase I (Q-T). Les flèches rouges pointent vers des structures de type NET. Barres d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les neutrophiles sont des cellules très dynamiques et réactives qui ont une courte durée de vie et ne peuvent pas encore être cryoconservées¹⁹, ce qui rend difficile l’étude de leur biologie. Par conséquent, il est essentiel de suivre des étapes minutieuses pour obtenir des neutrophiles viables, enrichis et au repos^11,20. Cette étude a utilisé une technique d’isolement basée sur la densité qui met l’accent sur une manipulation douce et minimale, ainsi que sur l’utilisation de basses températures jusqu’à l’étape d’activation. De plus, le traitement sanguin doit avoir lieu dans les 30 minutes suivant la ponction veineuse et être conservé à température ambiante. Le présent travail présente une option pour diminuer le stress de manipulation et le temps d’expérimentation. Pour simplifier davantage le processus, nous avons introduit une nouvelle étape (en option) dans le protocole, qui consiste à retirer les globules rouges par remise en suspension et aspiration douces de la couche de globules rouges après une seule procédure d’hémolyse. Cette étape réduit le stress de manipulation et le temps d’expérimentation, car elle élimine la majorité des globules rouges avec une seule étape d’hémolyse hypotonique. Cependant, il convient de noter que les compétences de l’opérateur influent grandement sur l’efficacité de cette étape et qu’elles n’éliminent pas toujours entièrement les globules rouges. De plus, l’aspiration des globules rouges peut entraîner une perte de neutrophiles, mais cela n’affecte pas le rendement, car un plus grand nombre de neutrophiles ont été initialement récupérés du gradient lors de la collecte plus près de la couche de globules rouges. Par conséquent, l’aspiration des globules rouges est recommandée si les tests ne nécessitent pas la plus grande pureté possible, ou si l’opérateur a toujours obtenu de bons résultats. Pour les tests de dépistage présentés ici, une petite quantité de globules rouges contaminants (<3 %) n’interférerait pas avec les résultats.

Pour s’assurer que toutes les procédures sont effectuées en temps voulu, y compris la préparation des réactifs, un flux de travail est présenté (Figure 2) qui détaille la chronologie et la répartition des tâches entre deux chercheurs. Une fois tous les tests fonctionnels terminés, les cellules restantes peuvent être préparées pour d’autres investigations moléculaires, telles que des études omiques par lyse cellulaire avec un tampon de lyse et un stockage appropriés.

Production de ROS
L’éclatement respiratoire est une caractéristique de l’amorçage et de l’activation des neutrophiles^18,21, et l’évaluation de la production de ROS est une méthode couramment utilisée pour estimer l’état d’activation des neutrophiles. Cette étude a évalué la production de ROS à l’aide de deux approches : la microscopie optique et la spectrophotométrie.

Le test NBT est une approche bien connue pour évaluer l’éclatement respiratoire chez les neutrophiles^22,23. Deux méthodes couramment utilisées sont les tests basés sur la microscopie optique (ou test sur lames) et les tests basés sur la spectrophotométrie 24,25,26. Bien que la microscopie optique permette de visualiser les détails au niveau de la cellule, elle est sujette à des biais de l’utilisateur. Par conséquent, le test de lame NBT sert de complément qualitatif au test spectrophotométrique concernant les caractéristiques phénotypiques, telles que les modèles de formation de formazan, l’intensité et l’agrégation cellulaire.

Les étapes critiques pour les tests de lame NBT et les tests spectrophotométriques sont la NBT et la solubilisation complète du formazan. Contrairement aux recommandations du fabricant, le NBT ne se dissout pas bien dans l’eau. Cependant, l’homogénéisation du NBT dans le DMSO pendant au moins 15 minutes, puis l’ajout d’eau/HBSS et le vortex pendant 2 min permettent une solubilisation complète. De plus, pour analyser l’absorbance du formazan, deux étapes critiques doivent être réalisées : (1) la libération des cristaux de formazan des cellules par lyse PMN et (2) la solubilisation complète des cristaux de formazan. Les deux étapes ont été réalisées en traitant la pastille cellulaire avec 10 % de SDS, comme cela a été récemment suggéré²⁷, suivie d’une sonication et d’une analyse d’absorbance du surnageant à 570 nm.

De plus, les résultats de la NBT des groupes témoins négatifs et positifs constituent la première étape du dépistage à évaluer. Cette étape doit montrer une différence remarquable, car l’évaluation de la production de ROS par formazan indique si le processus d’isolement pourrait avoir été responsable de changements indésirables dans l’état de repos des cellules, soit par stimulation, soit par inhibition.

D’autres méthodes, telles que la réduction du cytochrome c²⁸ ou l’analyse par cytométrie en flux²⁹, sont souvent utilisées pour la détection des ROS ; Cependant, si l’on considère une approche de criblage, leur application nécessite un temps d’expérimentation plus long, l’utilisation de marqueurs spécifiques et des instruments coûteux. La chimiluminescence du luminol/isoluminol est une méthode rapide et rentable pour détecter les ROS tout en permettant la différenciation des ROS intra- et extracellulaires. Cependant, un luminomètre est nécessaire pour cette méthode^30,31. Bien que le coût de l’instrument puisse être contourné par l’utilisation d’une installation, il serait toujours impropre à une analyse de dépistage effectuée simultanément avec d’autres tests.

Phagocytose
L’incubation PMN/levure fournit une vue d’ensemble de la capacité et de l’efficacité de la phagocytose des neutrophiles en comptant le nombre de neutrophiles effectuant la phagocytose et le nombre de levures englouties par neutrophile. Cependant, comme la particule de levure elle-même est un signal d’activation, la comparaison du groupe témoin avec le PMN prétraité constitue un système de double stimulation, qui peut ne pas présenter de changements significatifs, comme le montre le PMN CTRL par rapport au PMN traité au fMLP (Figure 4). Néanmoins, ce test est utile pour indiquer si un modulateur potentiel aurait un impact sur la phagocytose. Un nouveau peptide antimicrobien a été testé à l’aide de ce test, et les résultats indiquent une réponse potentielle intéressante à cette combinaison de stimuli, qui a récemment été discutée comme nécessaire pour une activation efficace³².

L’étape critique de ce test est la coloration, car l’analyse devient peu fiable si la lame est conservée sur le panoptique n° 3 (hématoxyline) pendant ≥3 s. En effet, les cellules de levure et les lobes nucléaires des neutrophiles ne peuvent pas être distingués l’un de l’autre. De plus, cette approche permet l’analyse morphologique des neutrophiles après exposition à des modulateurs. La cytométrie en flux est une autre technique efficace pour analyser la phagocytose³³, bien qu’elle présente des limites en raison de la difficulté à faire la distinction entre les particules liées à la membrane et les particules englouties et d’autres facteurs liés à l’ensemble de criblage proposé, comme nous l’avons vu dans la rubrique précédente. La même limitation est observée dans la méthode décrite ici, bien qu’elle doive être considérée comme un dépistage initial pour guider les études de suivi.

Migration en temps réel
Le protocole de criblage en temps réel a été optimisé pour évaluer la capacité de migration des PMN. Bien qu’une étude antérieure ait suggéré qu’un revêtement de la face inférieure de la plaque RTCA était nécessaire pour que le test de migration montre une différence entre le contrôle négatif et le traitement à l’IL-8¹⁵, cette étude a montré des valeurs d’intervalle de confiance (IC) élevées pour les cellules traitées au fMLP sans ajout d’agents d’enrobage. Les résultats ont présenté une reproductibilité élevée avec une migration significative à partir de 12 minutes. De plus, l’analyse de l’ajustement des courbes des données de migration obtenues peut révéler des paramètres, tels que l’indice de cellule maximal ainsi que la pente d’augmentation et de diminution, qui sont utiles pour comprendre la dynamique de la migration, et peuvent dépendre de la concentration ou différer entre les conditions. Le meilleur ajustement pour les courbes de migration des neutrophiles (Figure 5) a été la fonction de Gompertz ajustée³⁴, montrant que fMLP augmente l’indice cellulaire maximal et la pente accrue.

Une attention particulière est nécessaire pour éviter les bulles dans le système RTCA car elles peuvent bloquer les cellules passant à travers les électrodes, compromettant ainsi l’expérience. Un facteur limitant est le coût élevé des plaques. Bien que des techniques moins chères analysent la migration cellulaire, elles manquent d’une bonne reproductibilité ou sont difficiles et prennent du temps, comme la chambre de Boyden³⁵. Par conséquent, RTCA est une analyse de migration fiable compatible avec les autres tests de dépistage présentés ici.

Filets
Enfin, un test prometteur, facile et peu coûteux pour une évaluation préliminaire de la formation de TNE a été mis au point à l’aide de la microscopie optique. Il a été dérivé de l’observation de lames de phagocytose, dans lesquelles PMA, un stimulus spécifique induisant des TNE testé pour son effet sur la capacité de phagocytose, a également induit une formation de structure en forme de toile par rapport aux groupes CTRL et fMLP. Ce travail a émis l’hypothèse que ces structures pourraient indiquer la libération de TNE. Une telle hypothèse a été testée en traitant les échantillons avec de la DNase I après activation, où aucune structure filamenteuse n’a été trouvée dans les neutrophiles activés par PMA. L’hypothèse selon laquelle de telles structures sont susceptibles d’être des TNE est basée sur le fait que la PMA est citée comme un inducteur bien connu de la formation de TNE^36,37, la découverte de structures similaires par microscopie à fluorescence à l’aide de marqueurs spécifiques pour les TNE^38,39 et la dégradation des TNE catalysée par la DNase I^40,41. Il est important de souligner qu’il ne s’agit pas d’une méthode de confirmation de la formation de TNE, mais simplement d’un dépistage préliminaire qui suggère la présence de TNE. Bien que ce test ait des limites, car les TNE peuvent être confondues avec des artefacts de coloration, il sert un objectif pertinent en suggérant la formation de TNE dans un dépistage rapide et peu coûteux qui peut être effectué avec d’autres tests fonctionnels. Une fois qu’elles ont été détectées comme potentiellement pertinentes pour l’étude dépistée, les TNE peuvent être évaluées plus en détail par microscopie confocale ou électronique⁴², comme nous le verrons plus loin.

Dans notre laboratoire, de nouveaux peptides antimicrobiens, également susceptibles d’avoir des activités immunomodulatrices, sont fréquemment évalués par cet ensemble de tests de criblage afin de mieux guider l’analyse ultérieure des effets de certains peptides sur les neutrophiles humains, car certains présentent des propriétés intéressantes de ROS⁴³, de phagocytose, de migration et/ou de modulation des NET.

En conclusion, le NeutroFun Screen offre un outil précieux pour identifier les modulateurs potentiels de l’activité des neutrophiles de densité normale à partir d’un grand nombre de composés non testés. Cependant, il est important de noter que cette méthode ne sert que de dépistage préliminaire. Après ce premier examen, des méthodologies plus coûteuses, plus avancées et plus longues peuvent être dirigées vers des fonctions ou des voies spécifiques suggérées par ces premiers résultats pour la validation des données. Pour la production de ROS, la phagocytose et la formation de NET, il existe d’autres méthodes pour valider les données et obtenir d’autres résultats quantitatifs. La visualisation et la quantification des TNE peuvent être effectuées par analyse par microscopie d’immunofluorescence, qui détermine la présence et le chevauchement de l’ADN extracellulaire et des protéines granulaires, telles que la myéloperoxydase et l’élastase neutrophile, comme décrit en détail récemment⁴². Les ROS jouent différents rôles cruciaux dans de nombreux processus biologiques, et leur étude est donc très répandue et diversifiée. Parmi les méthodologies les plus établies, on trouve celles qui utilisent des anticorps, telles que le test immuno-enzymatique (ELISA) et l’immunotransfert de luminescence, ou la détection par fluorescence, comme la cytométrie en flux de cellules sous différents marquages - par DCFDA, la spectroscopie EPR et les mesures d’activité enzymatique⁴⁴. De même, une évaluation robuste de la phagocytose est également effectuée de plusieurs manières ; Les méthodes alternatives comprennent la cytométrie en flux seule^45,46 ou combinée à la microscopie à fluorescence⁴⁷. La migration cellulaire en temps réel décrite est un test robuste et suffisant qui ne nécessite pas de validation supplémentaire et présente des paramètres que d’autres méthodologies ne peuvent pas envisager. D’autres combinaisons de ces méthodes pourraient mieux convenir à des scénarios spécifiques, mais en résumé, cela représente une combinaison rapide et abordable qui englobe de nombreuses activités neutrophiles.

En résumé, cette étude vise à fournir un ensemble de tests composés de méthodologies simples, rapides et peu coûteuses pour évaluer les réponses multiples des neutrophiles à de nouvelles molécules et conditions afin de mieux orienter les efforts vers des méthodologies avancées. En tant que limites majeures, les résultats des tests ROS, NET et de phagocytose doivent être considérés comme préliminaires et nécessitent une validation plus approfondie par des tests plus spécifiques et plus élaborés, et ceux qui reposent sur une numération cellulaire par microscopie non automatisée sont sujets à des biais inconscients.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CIM-Planche 16	Agilent  ;
CLARIOstar Lecteur de plaques  ;	BMG LABTECH		Brevet américain numéro 9,733,124 Détails du produit : Logiciel d’analyse de données MARS
Dimethylsulfoxyde	Dinâ ; mica	1582
DNAse I	Sigma - Aldrich	DN 25
Acide éthylènediaminetétraacétique sel disodique dihydraté	Sigma - Aldrich	E5134
Coloration panoptique rapide	Laborclin	620529
Lame de verre	Exacta	7102
Hank' s Solution saline équilibrée avec calcium, magnésium, sans rouge de phénol.	Sigma - Aldrich	55037C
Hank' s Solution saline équilibrée sans chlorure de calcium, sulfate de magnésium et bicarbonate de sodium.	Sigma - Aldrich	H4641
Héparine	Blau	;
Armoire à flux laminaire	Veco	VLFS-12
Microscope	Zeiss	415501-0101-002	Détails de l’article : Primostar 1
Bloc de mélange	BIOER	MB-102
Neubauer amélioré aux lignes brillantes	Nouveau Optik	1110000
N-formyl-méthionyl-leucyl-phénylalanine	Sigma - Aldrich	F3506
Nitroblue tétrazolium	Neon	CAS 298-83-9
Percoll	Cytiva	17089101	milieu de séparation
Phorbol 12-myristate 13-acétate	Sigma - Aldrich	P8139
Comprimé de solution saline tamponnée au phosphate	Sigma - Aldrich	P4417
ROTOFIX 32 A	Hettich	1206
Saccharomyces cerevisiae	Fleischmann
Safranin	Sigma - Aldrich	50240
Dodécylsulfate de sodium	Cytiva	17-1313-01
Sonicator	Qsonica	Q125
Trypan blue solution	Vetec	C.I. 23850
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	0K-0500-902
xCELLigence Analyse cellulaire en temps réel (RTCA) DP (double usage)	Agilent  ;	380601050	Détails du produit : Système RTCA composé de matériel de détection, de plaques cellulaires et d’un logiciel