Établissement de cultures de cellules neuronales et gliales mixtes à partir de cerveaux de souris embryonnaires pour étudier l’infection et l’immunité innée

Summary

Ce protocole présente une façon unique de générer des cultures cellulaires du système nerveux central à partir de cerveaux de souris embryonnaires du jour 17 pour la recherche en neuro(immuno)logie. Ce modèle peut être analysé à l’aide de diverses techniques expérimentales, notamment la RT-qPCR, la microscopie, l’ELISA et la cytométrie en flux.

Abstract

Les modèles du système nerveux central (SNC) doivent récapituler le réseau complexe de cellules interconnectées trouvé in vivo. Le SNC se compose principalement de neurones, d’astrocytes, d’oligodendrocytes et de microglies. En raison des efforts croissants pour remplacer et réduire l’utilisation animale, une variété de systèmes de culture cellulaire in vitro ont été développés pour explorer les propriétés cellulaires innées, ce qui permet le développement de thérapies pour les infections et les pathologies du SNC. Alors que certaines questions de recherche peuvent être abordées par des systèmes de culture cellulaire basés sur l’homme, tels que les cellules souches pluripotentes (induites), travailler avec des cellules humaines a ses propres limites en ce qui concerne la disponibilité, les coûts et l’éthique. Ici, nous décrivons un protocole unique pour isoler et cultiver des cellules à partir de cerveaux de souris embryonnaires. Les cultures de cellules neurales mixtes qui en résultent imitent plusieurs populations cellulaires et interactions trouvées dans le cerveau in vivo. Par rapport aux méthodes équivalentes actuelles, ce protocole imite plus étroitement les caractéristiques du cerveau et recueille également plus de cellules, permettant ainsi d’étudier plus de conditions expérimentales à partir d’une souris gravide. De plus, le protocole est relativement facile et hautement reproductible. Ces cultures ont été optimisées pour une utilisation à différentes échelles, y compris des cribles à haut débit à 96 puits, des analyses de microscopie à 24 puits et des cultures à 6 puits pour la cytométrie en flux et l’analyse de la réaction en chaîne de la polymérase quantitative à transcription inverse (RT-qPCR). Cette méthode de culture est un outil puissant pour étudier l’infection et l’immunité dans le contexte d’une partie de la complexité du SNC avec la commodité des méthodes in vitro .

Introduction

Il est essentiel d’améliorer notre compréhension du système nerveux central (SNC) pour améliorer les options thérapeutiques pour de nombreuses maladies neuroinflammatoires et neurodégénératives. Le SNC, un réseau complexe de cellules interconnectées dans le cerveau, la moelle épinière et les nerfs optiques, comprend des neurones, des oligodendrocytes, des astrocytes et leurs cellules immunitaires innées, la microglie¹. Une approche in vitro peut souvent réduire considérablement le nombre de souris nécessaires pour effectuer des recherches significatives; Cependant, la nature complexe du SNC rend impossible la récapitulation de la situa....

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux étaient conformes aux lois et directives locales pour l’utilisation des animaux et ont été approuvées par le comité d’examen éthique local de l’Université de Glasgow. Les animaux ont été logés dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes conformément à la loi britannique de 1986 sur les procédures scientifiques sur les animaux, sous les auspices d’une licence de projet du ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni. Pour cette étude, des souris adultes C57BL/6J élevées en interne ont été utilisées. L’utilisation de jeunes femmes (8-12 semaines) est recommandée en raison du taux de réussite plus élevé de la grossesse; ....

Results

Microscopie
Les cultures cultivées sur des lamelles de verre sont idéales pour être analysées par microscopie. Pour visualiser le développement des cultures, les lamelles de couverture ont été fixées dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4% à plusieurs points temporels de DIV0 (une fois les cellules attachées) à DIV28. Les cultures ont été colorées pour l’imagerie par immunofluorescence comme décrit précédemment⁵ en utilisant trois combinaisons de coloration différentes: NG2 (oligod.......

Discussion

Le SNC est un réseau complexe qui s’étend du cerveau à la moelle épinière et se compose de nombreux types de cellules, principalement des neurones, des oligodendrocytes, des astrocytes et des microglies¹. Comme chaque cellule a un rôle important dans le maintien de l’homéostasie et la génération de réponses appropriées aux défis du SNC 9,10,11^, un système de culture qui contient tous ces types de cellules est un outil utile et .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	Pour digérer les tissus
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Mettre 8 plats de 35 mm par 1 plat de 140 mm
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	Pour collecter les cellules en granulés pour les remettre en suspension dans un milieu de placage
Aiguille 18 G	Henke Sass Wolf	4710012040	Pour la trituration de l’échantillon
21 G Aiguille	BD	304432	Pour la trituration de l’échantillon
Aiguille 23 G	Henke Sass Wolf	4710006030	Pour la trituration de l’échantillon
Antenne TC de 35 mm	Corning	430165	Plaque de sortie 3 lamelles enrobées PLL par 1 boîte de 35 mm
Seringue de 5 mL		Fisher 15869152	Pour la trituration de l’échantillon
Plaque à 6 puits	Corning	3516	Pour plaque de cellules pour RT-qPCR et écoulement cytométrie
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	Pour mettre les cerveaux intp
96 bien plaque	Corning	3596	Pour placage cellules pour tests à haut débit
ACSA-2 Anticorps, anti-souris, PE	Miltenyi	130-123-284	Pour la coloration par cytométrie en flux des astrocytes
Pince coudée	Dumont	0108-5/45-PO	Pour la dissection
Biotine	Sigma	B4501	Pour l’acide DM+/-
Borique	Sigma	B6768-500G	Pour le tampon d’acide borique
Brilliant Violet 421 Anticorps anti-souris CD24, clone M1-69	Biolegend	101825	Pour la coloration par cytométrie en flux des neurones et des astrocytes
Brilliant Violet 605 Anticorps CD45 anti-souris, clone 30-F11	Biolegend	103139	Pour la coloration par cytométrie en flux de la microglie
Brilliant Violet 785 anti-souris/humain CD11b Anticorps, clone M1/70	Biolegend	101243	Pour la coloration par cytométrie en flux de la microglie
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	Pour inhibiteur de SD
CNP	Abcam	AB6319	Oligodendrocytes matures
Coverslip	VWR	631-0149	Pour placage de cellules pour la microscopie
Dissection Ciseaux	Sigma	S3146-1EA	Pour la dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	Pour DM+/-, et pour le placage
de milieux DNase I	Thermofisher	18047019	Pour inhibiteur de SD, peut utiliser cette ou l’autre Dnase de sigma
DNase I	Sigma	D4263	Pour Inhibiteur de SD, peut utiliser cette ou l’autre Dnase de thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Teinture vivante / morte
Pince fine	Dumont	0102-SS135-PO	Pour dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	Pour support de placage
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	Pour les cerveaux à ajouter au
sérum	de chevalGibco	26050-070	Pour les milieux de placage
Hydrocortisone	Sigma	H0396	Pour DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	Pour DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	Pour Inhibiteur de SD
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myéline
Souris CCL5/RANTES DuoSet Kit ELISA	BioTechne	DY478-05	Kit ELISA pour la quantification de la concentration de CCL5 dans les surnageants de 96 puits
plaque N1 média supplément	Sigma	N6530-5ML	Pour DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Cellules souches/progénitrices neuronales
NeuN	Thermofisher	PA578499	Corps cellulaire neuronal
NG2	Sigma	AB5320	Oligodendrocytes immatures
O4 Anticorps anti-humain/souris/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	Pour la coloration par cytométrie en flux des oligodendrocytes
Pen/	Strep Sigma	P0781-100ML	Pour DM+/-, et pour les milieux de placage
Poly-L-Lysinehydrobromure	Sigma	P1274	Pour l’acide borique / solution de poly-L-lysine pour enrober les lamelles
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Tétraborate de sodium	Sigma	221732-100G	Pour tampon d’acide borique
Trizol	Thermofisher	15596026	Pour lyser les cellules pour RT-qPCR
Inhibiteur de trypsine du soja	Sigma	T9003-100MG	Pour inhibiteur de SD