Protocole de dosage de cisaillement pour la détermination des propriétés d’un matériau unicellulaire

Résumé

Ce protocole décrit la quantification des propriétés mécaniques des lignées cellulaires cancéreuses et non cancéreuses in vitro. Les différences conservées dans la mécanique des cellules cancéreuses et normales peuvent agir comme un biomarqueur qui peut avoir des implications dans le pronostic et le diagnostic.

Résumé

La biomécanique irrégulière est une caractéristique de la biologie du cancer qui fait l’objet d’études approfondies. Les propriétés mécaniques d’une cellule sont similaires à celles d’un matériau. La résistance d’une cellule au stress et à la tension, son temps de relaxation et son élasticité sont autant de propriétés qui peuvent être dérivées et comparées à d’autres types de cellules. La quantification des propriétés mécaniques des cellules cancéreuses (malignes) par rapport aux cellules normales (non malignes) permet aux chercheurs de découvrir davantage les fondements biophysiques de cette maladie. Bien que les propriétés mécaniques des cellules cancéreuses soient connues pour différer systématiquement des propriétés mécaniques des cellules normales, il n’existe pas de procédure expérimentale standard pour déduire ces propriétés à partir de cellules en culture.

Cet article décrit une procédure pour quantifier les propriétés mécaniques de cellules individuelles in vitro à l’aide d’un test de cisaillement fluide. Le principe derrière ce test consiste à appliquer une contrainte de cisaillement fluide sur une seule cellule et à surveiller optiquement la déformation cellulaire résultante au fil du temps. Les propriétés mécaniques des cellules sont ensuite caractérisées à l’aide de l’analyse de corrélation d’images numériques (DIC) et de l’ajustement d’un modèle viscoélastique approprié aux données expérimentales générées par l’analyse DIC. Dans l’ensemble, le protocole décrit ici vise à fournir une méthode plus efficace et ciblée pour le diagnostic des cancers difficiles à traiter.

Introduction

L’étude des différences biophysiques entre les cellules cancéreuses et non cancéreuses ouvre de nouvelles possibilités diagnostiques et thérapeutiques¹. Comprendre comment les différences en biomécanique/mécanobiologie contribuent à la progression tumorale et à la résistance au traitement révélera de nouvelles voies pour la thérapie ciblée et le diagnostic précoce².

Bien que l’on sache que les propriétés mécaniques des cellules cancéreuses diffèrent de celles des cellules normales (p. ex. viscoélasticité de la membrane plasmique et de l’enveloppe nucléaire)^3,4,5

Protocole

1. Préparation pour le test de cisaillement unicellulaire

1. Culture cellulaire
   1. Ensemencer environ 50 000 cellules simples en suspension dans une boîte de Petri de 35 mm x 10 mm contenant 2 ml de milieux de culture.
      REMARQUE : Vortex des cellules en suspension avant l’ensemencement pour briser les agrégats cellulaires.
   2. Incuber les cellules à 37 °C et laisser entre 10 et 48 h pour l’attachement cellulaire et la formation complète des protéines cytosquelettiques.
      REMARQUE: Tenez compte de la durée de l’attachement cellulaire, ainsi que des taux de prolifération et de croissance, pour assurer une croissance et une fixation ....

Résultats

Le protocole d’essai de cisaillement associé à une analyse de déformation à l’aide de CIVD et d’un modèle viscoélastique permet de quantifier les propriétés mécaniques d’une seule cellule in vitro. Cette méthode a été testée sur des lignées cellulaires humaines et murines, y compris des cellules mammaires humaines normales (MCF-10A)^3,4,9, des cellules de cancer du sein triple négatif moins métastatiques (MDA-MB-468)3, des cellules cancéreuses du sein triple négatif (MDA-MB-231)3, des cell.......

Discussion

La méthode de dosage par cisaillement, qui comprend la mise en place d’un environnement pseudo-mécanobiologique pour simuler l’interaction des cellules avec le microenvironnement mécanique environnant et leurs réponses aux contraintes mécaniques, a produit un catalogue de propriétés mécaniques cellulaires, dont les modèles montrent des atypies physiques conservées parmi les lignées cellulaires cancéreuses 3,4,5,7,8

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CELL CULTURE
.25 % Trypsine, 2,21 mM EDTA, 1x[-] bicarbonate de sodium	Corning	25-053-ci	Pour le détachement cellulaire du substrat en culture cellulaire
15 mL Tubes à centrifuger	Falcon by Corning	05-527-90
35 mm Boîtes de Pétri	Corning	430165
50 mL Tubes	à centrifugerFalcon by Corning	14-432-22
Centrifugeuse	n’importe quelle		Pour la culture cellulaire stérile
Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Ou tout autre milieu pour la culture de cellules. Le DMEM a été utilisé pour la culture de cellules U87
Gants	n’importe quel		Pour la culture cellulaire stérile
Heracell Vios 160i CO2 Incubateur	Thermo Scientific	51033770	Pour l’incubation pendant la culture cellulaire
Capot	n’importe quel		Pour la culture cellulaire stérile
Micropipette	n’importe quel		Pour la culture cellulaire stérile
Embouts de micropipette	tout		Pour la culture cellulaire stérile
Microscope	Leica/any		Pour la culture cellulaire stérile
Saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésium PBS, 1x	Corning	21-040-CM
Pipetman	tout		Pour la culture cellulaire stérile
Pointes de pipette	n’importe quel		Pour la culture cellulaire stérile
Incubateur liquide Precision GP 10	Thermo Scientific	TSGP02
T25 Flacon	Corning	430639
T75 Flacon	Corning	430641U
SHEAR ASSAY
100 mL bécher	n’importe quel		Pour créer un média de cisaillement visqueux DMEM + méthylcellulose
DMEM	Corning
Chambre d’écoulement + joint en caoutchouc	d’écoulement circulaire Glycotech	31-001	(pour boîtes de culture tissulaire de 35 mm)
Rhéomètre hybride	HR-2 Discovery Rhéomètre		Pour la détermination de la viscosité du fluide de cisaillement Barre d’agitation
magnétique	n’importe quel		Pour créer un média de cisaillement visqueux DMEM + méthylcellulose
Plaque d’agitation magnétique	n’importe quoi		Pour la création de milieux de cisaillement visqueux DMEM + méthylcellulose
Méthylcellulose	n’importe quelle		Pour augmenter la viscosité du DMEM dans les fluides d’écoulement
Pompe à seringue	KD Scientific Geminin 88 plus	788088
			de fluides Pour la configuration de l’appareil de cisaillement
SOFTWARE
Logiciel ABAQUS	Simulia
Logiciel de corrélation d’images numériques	LaVision, Allemagne	DAVIS 10.1.2
Logiciel d’imagerie	Leica/any microscope MATLAB
	MATLAB	MATLAB_R2020B