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Article de méthode

Électrophysiologie de l’activité corticale laminaire chez le ouistiti commun

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DOI :

10.3791/65397

⸱

4 août 2023

 ,  , 
1Neuroscience, University of Rochester, 2Brain and Cognitive Sciences, University of Rochester

Dans cet article

Résumé

Des micro-variateurs sur mesure permettent de cibler des sites d’enregistrement corticaux submillimétriques avec des réseaux linéaires de silicium.

Résumé

Le ouistiti fournit un modèle idéal pour examiner les circuits corticaux laminaires en raison de sa surface corticale lisse, qui facilite les enregistrements avec des réseaux linéaires. Le ouistiti a récemment gagné en popularité en raison de son organisation fonctionnelle neuronale similaire à celle des autres primates et de ses avantages techniques pour l’enregistrement et l’imagerie. Cependant, la neurophysiologie dans ce modèle pose des défis uniques en raison de la petite taille et de l’absence de gyri comme repères anatomiques. À l’aide de micro-disques personnalisés, les chercheurs peuvent manipuler le placement du réseau linéaire avec une précision inférieure au millimètre et enregistrer de manière fiable au même endroit ciblé par le rétinotopie pendant les jours d’enregistrement. Ce protocole décrit la construction étape par étape du système de positionnement du micro-entraînement et la technique d’enregistrement neurophysiologique avec des réseaux d’électrodes linéaires en silicium. Grâce à un contrôle précis du placement des électrodes au cours des sessions d’enregistrement, les chercheurs peuvent facilement traverser le cortex pour identifier les zones d’intérêt en fonction de leur organisation rétinotopique et des propriétés d’accord des neurones enregistrés. De plus, en utilisant ce système d’électrodes à réseau laminaire, il est possible d’appliquer une analyse de densité de source de courant (CSD) pour déterminer la profondeur d’enregistrement des neurones individuels. Ce protocole présente également des exemples d’enregistrements laminaires, y compris des formes d’onde de pointe isolées dans Kilosort, qui couvrent plusieurs canaux sur les réseaux.

Introduction

Le ouistiti commun (Callithrix jacchus) a rapidement gagné en popularité en tant que modèle pour étudier le fonctionnement du cerveau ces dernières années. Cette popularité croissante est due à l’accessibilité du cortex lisse du ouistiti, aux similitudes dans l’organisation fonctionnelle neuronale avec les humains et les autres primates, ainsi qu’à la petite taille et au taux de reproduction rapide1. Au fur et à mesure que cet organisme modèle a gagné en popularité, il y a eu un développement rapide des techniques neurophysiologiques adaptées à une utilisation dans le cerveau des ouistitis. Les méthodes d’électrophysiologie sont largement utilisées en neurosciences pour étudier l’activité des neurones uniques dans le cortex des rongeurs et des primates, ce qui permet d’obtenir une résolution temporelle et un accès à la localisation inégalés. En raison de la relative nouveauté du singe ouistiti en tant que modèle de neurosciences visuelles, l’optimisation des techniques d’électrophysiologie à comportement éveillé est encore en évolution. Des études antérieures ont montré l’établissement de protocoles robustes pour l’électrophysiologie dans les préparations anesthésiées2, et des études de neurophysiologie précoce à comportement éveillé ont montré la fiabilité des électrodes de tungstène à canal unique3. Ces dernières années, les chercheurs ont établi l’utilisation de réseaux de microélectrodes à base de silicium pour la neurophysiologie éveillée4. Cependant, le ouistiti pose des défis de ciblage uniques en raison de la petite taille de son cerveau et de l’absence de repères anatomiques. Ce protocole décrit comment construire et utiliser un système d’enregistrement de micro-entraînement adapté au ouistiti qui permet d’enregistrer de grandes populations de neurones avec des réseaux linéaires en silicium tout en produisant des dommages tissulaires minimaux.

Travailler avec le ouistiti pose un défi en raison de la plus petite échelle des cartes rétinotopiques dans le cortex visuel par rapport aux primates plus grands. Un léger décalage des électrodes de seulement 1 mm peut entraîner des changements significatifs dans les cartes. De plus, les chercheurs doivent souvent modifier le placement des électrodes entre les sessions d’enregistrement pour obtenir une gamme plus large de positions rétinotopiques dans le cortex visuel. Les préparations semi-chroniques actuelles ne permettent pas d’ajuster quotidiennement le positionnement de l’électrode ou avec suffisamment de précision pour cibler des emplacements spécifiques à des échelles submillimétriques5. Dans cette optique, le système de micro-entraînement proposé utilise un étage d’électrode X-Y qui monte un micro-entraînement léger sur une chambre d’enregistrement et permet le ciblage submillimétrique des sites corticaux. Les composants mobiles de la platine X-Y permettent un mouvement vertical et horizontal du réseau linéaire afin de traverser systématiquement les zones corticales, ce qui est nécessaire pour identifier les zones d’intérêt (via les propriétés de rétinotopie et d’accordage). Au fil des sessions d’enregistrement, les chercheurs peuvent également ajuster manuellement la platine X-Y pour déplacer les sites ciblés dans la zone. Il s’agit d’un avantage clé par rapport aux techniques alternatives utilisant des préparations d’enregistrement semi-chroniques, qui n’ont pas de mécanismes de ciblage d’électrodes faciles.

Le micro-entraînement est un outil polyvalent qui permet de fixer divers réseaux de silicium pour les descendre dans le cortex. Dans ce protocole, une sonde personnalisée avec deux réseaux linéaires à 32 canaux espacés de 200 μm a été utilisée pour l’étude des circuits laminaires couvrant la profondeur corticale. La plupart des méthodes de sondage des circuits neuronaux échantillonnent généralement les potentiels électriques ou les unités uniques moyennées sur toutes les couches du cortex cérébral. Cependant, des recherches récentes ont révélé des résultats intrigants sur les microcircuits laminaires corticaux6. En utilisant le micro-entraînement, les chercheurs peuvent utiliser des sondes laminaires et ajuster finement la profondeur d’enregistrement pour assurer un échantillonnage complet sur toutes les couches.

Ce système peut être construit avec des composants disponibles dans le commerce et est facilement modifié pour différentes techniques expérimentales ou sondes. Les principaux avantages de cette préparation sont la possibilité de changer la position d’enregistrement X-Y avec une précision submillimétrique et de contrôler la profondeur de l’enregistrement dans le cortex. Ce protocole présente des instructions étape par étape pour la construction de l’étape X-Y, des techniques de micro-entraînement et d’enregistrement neurophysiologique.

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Protocole

Les procédures expérimentales ont suivi le Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les protocoles pour les procédures expérimentales et comportementales ont été approuvés par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Rochester.

1. Construction du micro-entraînement contenant l’électrode pour l’enregistrement (Figure 1)

REMARQUE : Des platines X-Y sur mesure contenant des réseaux linéaires de silicium multicanaux permettent un ciblage submillimétrique des sites d’enregistrement.

  1. Rassemblez toutes les pièces du micro-lecteur décrites dans la Figure 1. Utilisez du plastique acrylonitrile butadiène styrène (ABS) transparent pour imprimer en 3D les pièces personnalisées. Cela comprend le manchon de protection, la base, l’étage X et l’étage Y. Les conceptions de pièces 3D sont disponibles en ligne (https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html). De plus, rassemblez l’électrode, la plate-forme rectangulaire en plastique, la grille, le micromanipulateur, le tube en acier et six vis en acier inoxydable (taille de la vis : 00).
    1. À l’aide d’un outil rotatif équipé d’une meule diamantée, découpez une section de 4 mm x 3 mm x 3 mm de la grille en plastique avec un espacement des trous de 1 mm x 1 mm.
    2. Utilisez de l’époxy pour fixer la petite section de grille découpée au sommet de la platine en Y. Ensuite, placez le micro-lecteur sur cette grille avec une vis. Ajoutez de l’époxy à sa base pour plus de stabilité.
    3. Fixez la petite plate-forme rectangulaire imprimée en 3D à un tube en acier 28 G avec de l’époxy. Celui-ci sera utilisé dans les étapes futures pour maintenir l’électrode en silicium.
    4. Enfilez un tube de guidage de 23 G à travers la grille. Ensuite, enfilez le tube en acier fixé à la plate-forme en plastique à travers le tube de guidage 23 G. Placez le tube en acier 28 G dans l’un des emplacements du micro-entraînement.
    5. Ensuite, assemblez les pièces 3D (base, étage X, étage Y) à l’aide de vis hexagonales en acier inoxydable (taille : 00, longueur : 1/8 po) pour construire la base du lecteur.
      1. Tout d’abord, utilisez un outil de taraudage manuel pour tarauder les trous de vis préfabriqués dans la base et l’étage X. Ensuite, commencez par insérer quatre vis dans les longues fentes de la scène X et fixez-les aux trous de vis correspondants préfabriqués dans la base.
      2. Une fois que la platine X mobile est fixée à la base, insérez deux vis dans la longue fente de la platine Y et fixez-les aux trous de vis préfabriqués de la platine X.
        REMARQUE : Les étages X et Y doivent rester mobiles jusqu’à ce que les vis soient complètement serrées.
  2. Assurez-vous que le lecteur du micromanipulateur est équipé d’une plate-forme en plastique pour fixer le connecteur de l’électrode, ainsi que d’un tube en polyimide allongé pour maintenir l’électrode. Fixez le connecteur à 64 broches à la plate-forme du micromanipulateur à l’aide de ruban adhésif.
  3. Placez délicatement une noisette de bacitracine (pommade stérile) sur le tube en plastique du micromanipulateur et fixez l’électrode connectée au connecteur à 64 broches via un câble plat flexible.
  4. Utilisez l’entraînement du micromanipulateur pour maintenir l’électrode en silicium et son connecteur tout en enfilant le tube en plastique à travers un trou dans la platine Y. L’électrode sera suspendue sous la platine de la sonde, en attendant d’être fixée à la plate-forme rectangulaire en plastique (étape 7, section 1).
  5. Détachez le connecteur à 64 broches du lecteur du micromanipulateur et utilisez du gel de colle pour fixer le connecteur à la plate-forme de la platine X. De l’époxy supplémentaire peut être ajouté pour renforcer la liaison du connecteur une fois que la colle le maintient en place. Laisser sécher toute la nuit.
  6. Détachez soigneusement l’électrode du tube en plastique et retirez l’entraînement du micromanipulateur de l’ensemble.
    REMARQUE : À ce stade, le lecteur n’est tenu qu’avec la pince crocodile d’un Helping Hands, et l’électrode n’est pas sécurisée dans la construction du lecteur.
  7. Déplacez délicatement la pince crocodile pour retourner le lecteur et voir l’électrode non sécurisée. À l’aide d’une pince à pointe émoussée, placez l’électrode sur le support en plastique sous la platine Y et fixez-la avec une petite quantité d’élastomère de silicone (silastic). Attendez 5 min jusqu’à ce que l’adhésif ait durci.
  8. Utilisez la commande à vis sur le micro-entraînement pour rétracter l’électrode.
  9. Placez le manchon de protection sur l’électrode du micro-entraînement. Ce manchon de protection est de la même taille que les chambres d’enregistrement imprimées sur mesure et s’insère solidement dans la base de l’ensemble de lecteur.
  10. À l’aide d’un tournevis à tête plate, serrez les trois vis latérales sur le composant de base du micro-lecteur pour fixer le manchon de protection en place. Connectez l’étage de tête utilisé pour les enregistrements sur le connecteur à 64 broches.

2. Placage polytrode des électrodes pour réduire l’impédance globale (Figure 2)

REMARQUE : Pour une meilleure qualité d’enregistrement, il est utile d’électroder les réseaux d’électrodes en silicium avec une solution de poly(3,4-éthylènedioxythiophène) (PEDOT). Il a été démontré que cette méthode augmente le rapport signal/bruit 7,8.

  1. Pour préparer la solution de PEDOT, mélanger 0,075 mL de 3,4-éthylènedioxythiophène (EDOT) et 1,4 g de poly(4-styrènesulfonate de sodium) (PSS) dans 70 mL d’eau distillée. Vortex cette solution brièvement pour assurer la dissolution complète des composants. Mélanger cette solution la veille de l’utilisation pour une meilleure dissolution.
  2. Après avoir lancé le logiciel du testeur d’impédance (voir Tableau des matériaux), préparez les réglages avec la préparation d’électrode choisie. À l’aide du menu déroulant supérieur en haut à gauche de la fenêtre du logiciel, sélectionnez la carte utilisée (N2T A32). À l’aide du deuxième menu déroulant, sélectionnez l’électrode utilisée (NLX-EIB-36). Si l’électrode n’est pas répertoriée dans le menu déroulant, consultez le manuel pour savoir comment définir une nouvelle électrode. Assurez-vous que le nombre de canaux est correct.
  3. Connectez la sonde au système de test d’impédance via le connecteur et abaissez la sonde dans une solution saline mise à la terre pour obtenir une lecture de base.
    1. Dans le système de test d’impédance, appuyez sur le bouton Test Impédances sur le côté gauche et assurez-vous que les paramètres sont corrects (Paramètres : Fréquence de test : 1 004 Hz, Cycles : 100, Pause : 0). Ensuite, appuyez sur le bouton Test de la sonde en bas à droite.
    2. Une fenêtre de rapport de sonde s’affiche pendant l’exécution du testeur d’impédance, stockant les résultats dans une feuille de calcul. Conservez ces résultats pour référence ultérieure pour les deux tiges de l’électrode (le montage de l’électrode dans un bécher à utiliser avec le testeur d’impédance est illustré à la figure 2D). Si vous utilisez une sonde à plusieurs tiges, assurez-vous que l’étape 3 est répétée pour chaque tige.
  4. Retirez la sonde de la solution saline en abaissant le socle (c’est-à-dire le cric de laboratoire) qui maintient le bécher. Remplacez le liquide du bécher par de l’eau distillée. Soulevez le cric de laboratoire pour immerger l’électrode, rincez la solution saline restante, puis abaissez à nouveau le vérin de laboratoire.
  5. Remplacez l’eau distillée dans le bécher par une solution PEDOT et soulevez le vérin de laboratoire jusqu’à ce que l’électrode soit immergée dans la solution.
  6. Sélectionnez le bouton DC Electroplate sur le côté gauche de la fenêtre du logiciel et assurez-vous que les paramètres corrects sont utilisés (Paramètres : Autoplate : 0,004 μA, 350 Hz, Durée : 5, Pause : 1). Ensuite, appuyez sur le bouton Autoplate en bas à droite. Une fois de plus, une fenêtre de rapport de sonde apparaîtra avec les résultats de la galvanoplastie. Enregistrez ces résultats pour référence future. Si vous utilisez une sonde à plusieurs tiges, assurez-vous que cette étape est répétée pour chaque tige.
  7. Retirez la sonde de la solution PEDOT en abaissant le vérin de laboratoire et rincez la sonde à l’eau distillée comme effectué précédemment (étape 4). Après le rinçage, remplissez le bécher de solution saline et soulevez le vérin de laboratoire jusqu’à ce que l’électrode soit immergée.
  8. Appuyez sur le bouton Test Impédances sur le côté gauche de la fenêtre du logiciel et assurez-vous que les paramètres corrects sont utilisés (Paramètres : Fréquence de test : 1 004 Hz, Cycles : 100, Pause : 0). Appuyez sur le bouton Test de la sonde en bas à droite. Enregistrez ces résultats pour référence future. Si vous utilisez une sonde à plusieurs tiges, assurez-vous que cette étape est répétée pour chaque tige.
    REMARQUE : Comparez les valeurs post-galvanoplastie avec les valeurs pré-galvanoplastie. Il devrait y avoir une diminution des valeurs d’impédance.
  9. En cas d’utilisation continue, les sondes peuvent montrer des augmentations des valeurs d’impédance après 6 mois. Si les valeurs d’impédance du signal d’enregistrement suscitent des inquiétudes, testez à nouveau les impédances de la sonde en suivant l’étape 3. Si les valeurs d’impédance ont augmenté par rapport aux valeurs initiales, répétez la galvanoplastie (étape 6).

3. Mise en place chirurgicale du capuchon de tête, des cavités et de la craniotomie (figure 3A-C)

NOTE : Dans ce travail, à la fin de l’étude, l’animal a été anesthésié sous isoflurane et a reçu des injections intramusculaires (IM) de kétamine, suivies d’une injection intrapéritonéale (IP) d’euthasol. Le cerveau a été extrait après perfusion transcardique avec une solution saline suivie de 10% de formol.

  1. Entraînez les ouistitis (âgés d’au moins 1,5 an) à s’asseoir dans une petite chaise de primate en suivant les méthodes décrites précédemment 3,9,10,11 2 mois avant la chirurgie.
  2. Le jour de la chirurgie, induire les sujets avec une injection intramusculaire (i.m.) de kétamine (5-15 mg/kg)/dexdormitor (0,02-0,1 mg/kg) (et midazolam à 0,25 mg/kg comme relaxant musculaire), et confirmer une anesthésie appropriée en fonction de la fréquence cardiaque, de la respiration et du réflexe de pincement des orteils. Intuber les animaux pour une administration continue d’isoflurane (0,5 % à 2 % dans 100 % d’oxygène) tout au long de la chirurgie tout en surveillant leurs signes vitaux. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pendant la chirurgie pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
  3. Une fois que les chirurgiens ont mis l’EPI stérile, préparez un champ opératoire stérile à l’aide de champs stériles pour couvrir les surfaces et le champ opératoire. À l’aide de techniques aseptiques, demandez aux chirurgiens d’implanter un capuchon de tête en acrylique avec des tenons et des vis en titane pour stabiliser la tête en utilisant les méthodes décrites en détail précédemment par Nummela et al.11.
  4. Pendant la chirurgie implantaire, planifiez les emplacements de la chambre d’enregistrement sur les zones d’intérêt (par exemple, les zones visuelles, la zone temporale moyenne [MT] et le cortex visuel primaire [V1]) en fonction des coordonnées stéréotaxiques12.
  5. Placez un fil de mise à la terre.
    1. Commencez par percer un trou de bavure de 1,1 mm dans le crâne près de la zone de la chambre d’enregistrement prévue. Pliez un fil d’acier inoxydable de 36 G à environ 0,075-1 mm de la pointe et faites glisser la partie pliée du fil entre le crâne et la dure-mère au fond du trou de bavure.
    2. Scellez d’abord le fil et le trou avec de la cire d’os, puis avec du ciment et de l’acrylique lors de la mise en place des chambres. Assurez-vous de laisser une partie à l’extérieur près de la chambre à fixer pour la mise à la terre.
  6. Après avoir placé une couche de base de ciment adhésif rapide pour couvrir toute la zone du site d’enregistrement et du fil de mise à la terre, collez les chambres d’enregistrement (constituées de pièces imprimées en 3D personnalisées) sur le crâne à l’aide du ciment adhésif rapide et renforcez avec de l’acrylique lors de la construction de l’implant de tête.
  7. Scellez les chambres avec un capuchon de chambre imprimé en 3D qui est conçu pour s’adapter étroitement à l’intérieur de la chambre (et ne peut pas être retiré par des compagnons de cage logés par paires avec le sujet).
    1. Versez une petite quantité d’élastomère de silicone (silastic) sur les bords intérieurs de la chambre à l’aide des embouts mélangeurs inclus, puis insérez le capuchon de la chambre jusqu’à ce qu’il affleure les parois extérieures de la chambre.
    2. Les chambres sont conçues avec des trous d’accès (1 mm de diamètre) de chaque côté de la chambre pour garantir que le capuchon de la chambre peut être retiré facilement. Utilisez du silastic pour sceller ces trous d’accès, ce qui permet d’obtenir un joint de chambre étanche à l’air.
      REMARQUE : Pour retirer les capuchons de la chambre, utilisez une pince à épiler pour retirer le silastic scellant d’abord les trous d’accès afin de briser le joint étanche à l’air de la chambre. Ensuite, une goupille peut être utilisée pour tirer parti du capuchon de la chambre hors de la chambre.
  8. Récupérez les animaux de l’anesthésie et ne les laissez pas sans surveillance jusqu’à ce qu’ils aient repris suffisamment conscience pour maintenir le décubitus sternal. Traiter les animaux après la chirurgie avec des antibiotiques (amoxicilline-acide clavulanique à 13,75 mg/kg) pendant 7 jours et des anti-inflammatoires (méloxicam à 0,1 mg/kg) pendant 3 jours. Donnez des analgésiques à libération lente avant la récupération pour durer 72 heures après l’opération et hébergez les animaux de manière indépendante jusqu’à leur rétablissement complet.
  9. Deux à trois semaines après la chirurgie, commencez à entraîner l’appuie-tête et le comportement visuel. Placez le ouistiti dans une chaise de primate et laissez-le s’acclimater à l’appuie-tête. Une fois à l’aise, entraînez le ouistiti à effectuer plusieurs tâches de base, y compris la fixation visuelle centrale13 et une tâche de saccade vers un réseau de Gabor détecté en périphérie, qui est utilisé pour mesurer son acuité visuelle11.
  10. Après un entraînement comportemental suffisant, effectuez une craniotomie dans la chambre d’enregistrement. Dans le cadre de techniques stériles, effectuer une deuxième intervention chirurgicale pour créer une craniotomie (2 à 3 mm de diamètre) dans la chambre d’enregistrement au-dessus de la zone d’intérêt (par exemple, la zone MT). Sceller la craniotomie avec une application épaisse de silastic d’environ 1 mm ou la profondeur de la craniotomie pour protéger le cerveau de l’infection et réduire la croissance de la granulation14. Assurez-vous que le joint silastique a des bords qui s’accrochent à au moins 2 mm ou plus du ciment dentaire de tous les côtés. Replacez le capuchon de la chambre comme décrit à l’étape 7.
  11. Si un saignement se produit ou si le joint silastique fuit des fluides clairs dans les jours suivant la chirurgie, la chambre devra être nettoyée.
    1. Si le joint silastique est intact, utilisez des techniques stériles pour nettoyer avec 10 % de bétadine et lavez-le avec une solution saline stérile avant de retirer le joint. Si le joint silastique n’est pas intact, nettoyez-le uniquement avec une solution saline stérile selon des techniques stériles.
    2. Une fois le silastic retiré, rincez la dure-mère avec une solution saline stérile plusieurs fois et séchez-la avec un coton-applicateur. Séchez ensuite soigneusement la chambre à l’aide d’un applicateur à embout en coton avant d’appliquer une nouvelle couche de silastic. En règle générale, la chambre se stabilise et reste sèche avec un joint étanche après quelques jours à 1 semaine.
  12. Une fois que la craniotomie s’est stabilisée et ne montre aucun signe de saignement, effectuez un grattage dural pour éliminer l’excès de tissu sur la dure-mère. Ensuite, appliquez une fine couche (<1 mm) de silastic (suffisamment mince pour permettre le passage des électrodes pour les enregistrements) et utilisez un foret à meule 1/4 pour évacuer le silastic sur les parois de la craniotomie, comme le montre la figure 3C, pour l’achat mécanique.
    REMARQUE : Cela permettra également un retrait plus facile à des fins de nettoyage. Le silastic peut rester en place pendant toute la durée de l’étude et peut être perforé avec des électrodes à réseau linéaire pour l’enregistrement.

4. Configuration de l’enregistrement en neurophysiologie (figure 3D-F)

REMARQUE : Les étapes de manipulation des animaux varient en fonction du laboratoire et de l’expérience. Les étapes suivantes sont spécifiques à l’emplacement du micro-lecteur et à la pénétration de la dure-mère pour les enregistrements.

  1. Retirez le capuchon de la chambre d’enregistrement (décrit dans la section 3, étape 7.2). Placez le capuchon dans de l’alcool isopropylique à 91 % pour le faire tremper pendant l’enregistrement. Assurez-vous que les bords de la chambre sont exempts de silastic. Si du silastic est laissé sur les bords de la chambre, le micro-entraînement ne sera pas correctement installé.
  2. La base du micro-entraînement a trois vis pour le serrer à la chambre de l’animal. Normalement, ces vis sont serrées en place autour d’un manchon de protection de la même taille que la chambre pour protéger la sonde en silicone à l’intérieur contre les coups.
    1. Tout d’abord, utilisez le tournevis pour desserrer les trois vis qui maintiennent le manchon de protection sur la sonde en silicone, puis retirez délicatement le manchon. Fixez le micro-lecteur à la chambre d’enregistrement, en faisant attention de ne pas heurter les électrodes en silicium sur les parois de la chambre (Figure 3D, E).
    2. De plus, assurez-vous que les électrodes sont dans une position complètement rétractée avant de placer le lecteur sur la chambre, de sorte qu’elles se trouvent bien au-dessus du cortex lors de la mise en place initiale.
  3. Une fois placé, utilisez le tournevis pour serrer chaque vis sur le côté du micro-lecteur (Figure 3F). Choisissez un ordre pour serrer les vis et utilisez-le à chaque fois pour maintenir la stabilité de l’emplacement. Les chercheurs voudront peut-être également compter le nombre de tours lors du desserrage initial des vis pour les serrer d’une quantité similaire. Vérifiez si la sonde est desserrée et serrez-la au besoin, mais veillez à ne pas dénuder les filetages dans le plastique en serrant trop.
  4. Une fois le micro-entraînement fixé à la chambre, placez tous les fils de mise à la terre nécessaires.
    REMARQUE : Laissez la scène de tête insérée dans le connecteur pendant la nuit et n’insérez le câble d’interface périphérique série (SPI) dans la scène de tête que pour les enregistrements car il est difficile d’insérer la scène de tête dans le connecteur lorsqu’elle est sur l’animal.
  5. Branchez soigneusement le câble SPI dans l’étage de tête (déjà connecté à la sonde). Assurez-vous de ne pas plier le fil. Amplifiez et numérisez toutes les données neurophysiologiques de la tête à 30 kHz à l’aide de l’interface graphique Open-Ephys (https://github.com/open-ephs/plugin-GUI). Filtrez passe-haut le signal à large bande de l’étage de tête à 0,1 Hz. Corrigez les déphasages de ce filtrage, comme décrit précédemment15. Pour les tableaux linéaires, prétraitez les traces résultantes par référencement de moyenne commune.
  6. Entrez la carte des canaux pour le réseau d’électrodes particulier utilisé dans le système d’enregistrement afin que les canaux tracés pendant l’enregistrement soient classés par profondeur dans la vue du signal d’enregistrement filtré passe-haut. Cette vue sera utilisée lors de l’avancement et de la rétraction de l’électrode.

5. Réalisation de l’expérience d’enregistrement neurophysiologique (Figure 4)

REMARQUE : Ici, la méthode pour faire pénétrer les réseaux d’électrodes dans le cortex est décrite ; Cette méthode a été optimisée pour éviter les capitons excessifs du tissu sous-jacent. Une augmentation du bruit dans les enregistrements électrophysiologiques fournit une bonne indication de fossettes avant de pénétrer dans le silastique et d’entrer dans le cerveau. Une fois dans le cerveau, s’il y a trop de fossettes, le chercheur peut remarquer que les unités se déplacent sur la sonde même sans manipulation de l’entraînement (unités se déplaçant progressivement à travers les canaux en profondeur), ou alternativement, le chercheur peut remarquer une suppression de l’activité neuronale, en particulier sur les sites superficiels de la sonde. Dans ces conditions, le lecteur est rétracté pour soulager les fossettes et faciliter de meilleurs enregistrements.

  1. À l’aide de la commande à vis du micro-entraînement, abaissez la sonde en silicium en faisant un tour (250 μm) toutes les 1 à 2 s jusqu’à ce que des unités soient observées à l’extrémité du réseau.
    REMARQUE : Une légère augmentation du bruit lors de la pénétration du silastic placé sur la dure-mère peut être observée. Les tiges creuseront le silastic avant de passer à travers, ce qui peut augmenter le bruit sur la sonde. Une descente rapide jusqu’au premier signe d’unités aide à la pénétration de la couche de silastique.
  2. Une fois les premiers neurones observés, rétractez d’un tour le micro-drive (250 μm) pour réduire la vitesse d’entrée lorsque l’électrode commence à traverser le silastique et la dure-mère dans le tissu cortical. Si l’électrode semble continuer à progresser dans le tissu au fil du temps sans micromanipulation, rétractez un tour supplémentaire pour soulager la pression de la sonde poussant sur le silastique et le tissu en dessous.
    REMARQUE : Il devrait être possible de suivre l’emplacement des neurones si la carte de canaux correcte pour le réseau linéaire a été chargée (les canaux apparaîtront classés par leur profondeur par rapport au cortex).
  3. Continuez à enfoncer le réseau dans le cortex très lentement, en avançant d’environ quatre à six tours (1-1,5 mm) sur une durée de 20 à 30 minutes jusqu’à ce que les neurones soient uniformément répartis sur toute la longueur de la sonde.
  4. Rétractez lentement le réseau d’un à deux tours (0,25-0,5 mm) pour réduire la pression sur le tissu avant de commencer les enregistrements.
    REMARQUE : Les neurones ne changent généralement pas l’emplacement du canal sur le réseau linéaire pendant cette rétraction, ce qui suggère qu’il agit principalement pour réduire la pression sur le tissu. Sans rétraction, un décalage continu de la matrice peut être observé pendant l’enregistrement lorsque le tissu se détend, perturbant ainsi la stabilité de l’enregistrement (Figure 4C).
  5. Après vous être rétracté, attendez 20 min avant de commencer les enregistrements. Cela limitera la quantité de mouvement visible dans l’enregistrement. Utilisez ce temps pour vous préparer à l’enregistrement (c.-à-d. calibrer l’oculométrie et préparer les systèmes de présentation des stimuli).
  6. Sélectionnez Enregistrer sur le logiciel d’enregistrement.
  7. Une fois l’expérience terminée, sélectionnez à nouveau le bouton d’enregistrement. Cela créera le fichier d’enregistrement complet dans la destination sélectionnée. Assurez-vous que le fichier a été enregistré correctement avant de continuer.
  8. Commencez lentement à rétracter le réseau hors du cortex à une vitesse similaire à celle d’avant (quatre à six tours sur une durée de 20 à 30 minutes). Visualisez la sonde se rétracter en regardant les neurones se déplacer le long de la sonde. Après s’être rétracté du nombre de tours depuis la première apparition de neurones et lorsqu’aucun autre neurone n’est observé sur la sonde, continuez à vous rétracter plus rapidement jusqu’à revenir à la position de départ complètement rétractée.
  9. Pour retirer la sonde de la chambre d’enregistrement, effectuez les étapes 1 à 3 de la section 4 dans l’ordre inverse (c’est-à-dire effectuez d’abord l’étape 3, puis l’étape 2, puis l’étape 1).
  10. Une fois la sonde retirée de la chambre d’enregistrement, faites-la tremper dans une solution pour lentilles de contact pendant 20 minutes pour éliminer tout tissu ou sang de l’électrode. Ensuite, placez la sonde dans de l’alcool pendant 1 min pour retirer la solution pour lentilles de contact et laissez sécher l’électrode.
  11. Utilisez Kilosort2 pour trier les données de la matrice après le filtrage initial du système d’enregistrement (comme décrit précédemment dans la section 4, étape 5).
    1. Étiquetez manuellement les sorties des algorithmes de tri des pointes à l’aide de l’interface graphique « phy » (https://github/kwikteam/phy). Classez les unités avec des formes d’onde minuscules ou physiologiquement invraisemblables comme du bruit et excluez-les.
    2. Si vous utilisez des sondes laminaires, visualisez les formes d’onde de pointe sur chaque canal pour vous assurer que les unités individuelles sont étiquetées sur le canal avec la forme d’onde de crête (Figure 5A). N’incluez que les unités qui ont des clusters clairs dans l’espace PCA, moins de 1 % de violations d’intervalle entre les pointes et des formes d’onde de pointe biphasiques (qui doivent être localisées dans les canaux adjacents sur le réseau linéaire). Un exemple d’unité unique est illustré à la figure 5B, qui montre des clusters clairs dans l’espace ACP (en haut à droite) et la stabilité dans le temps (en bas à droite).

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Résultats

Ce protocole décrit comment construire un étage d’électrode X-Y (Figure 1) qui permet le ciblage submillimétrique des sites et maintient un positionnement fiable sur des sessions d’enregistrement distinctes. La fiabilité du positionnement X-Y est illustrée à la figure 6, qui montre que deux sessions d’enregistrement menées à une semaine d’intervalle ont montré un chevauchement de 70,8 % de leurs emplacements RF moyens (figure 6A). D...

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Discussion

Plusieurs méthodes (par exemple, chronique, semi-chronique, aiguë) sont actuellement disponibles pour effectuer des expériences de neurophysiologie chez les primates non humains. Le ouistiti commun pose des défis uniques pour les expériences de neurophysiologie en raison de sa petite taille et de l’absence de gyri comme repères anatomiques. Cela oblige les chercheurs à utiliser des repères neurophysiologiques tels que la rétinotopie et les propriétés d’ajustement des zones d’intérêt pour identifier les cibles d’enregistr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention R01 des National Institutes of Health (NIH) EY030998 (J.F.M., A.B. et S.C.). Cette méthode est basée sur les méthodes développées dans Coop et al. (en cours de révision, 2022 ; https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.11.511827v2.abstract). Nous tenons à remercier Dina Graf et les membres du laboratoire Mitchell pour leur aide dans les soins et la manipulation des ouistitis.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Mèche à meule 1/4 HpMcMaster & CarrCat# 43035A32Fraise en carbure avec diamètre de tige de 1/4", culasse arrondie, numéro de commerce SC-1, coupe simple(https://www.mcmaster.com/products/bur-bits/burs-7/?s=1%2F4%22+bur+bits)
1x1mm Grille CristInstrumentsCrist 1 mm x 1 mm Grillehttps://www.cristinstrument.com/products/implant-intro/grids
91 % alcool isopropyliqueMedlineN/A
https://www.medline.com/product/Medline-Isopropyl-Rubbing-Alcohol/Bulk-Alcohol/Z05-PF03807?question=91%25%20isopropyl%20alcohol Conseil d’acquisitionOpen-EphysN/Ahttps://open-ephys.org/acquisition-system/eux9baf6a5s8tid06hk1mw5aafjdz1
Pommade à la bacitracineMedline : Cosette Pharmaceuticals IncN/Ahttps://www.medline.com/product/Bacitracin-Ointment/Antibiotics/Z05-PF86957?question=bacitr
Pince droite émousséeMedlineN/Ahttps://www.medline.com/category/Central-Sterile/Surgical-Instruments/Forceps/Z05-CA16_02_20/products
Cire d’osMedlineETHW31Ghttps://www.medline.com/product/Ethicon-Bone-Wax/Bone-Wax/Z05-PF61528?question=bonewax
C& B Système de ciment adhésif rapide MetabondParkell, Inc.UGS : S380https://www.parkell.com/C-B-Metabond-Quick-Adhesive-Cement-System
ClavamoxMWI Santé animaleN/A
Solution pour lentilles de contactBausch et lombDiverses sources disponibles
Pièces imprimées en 3D imprimées sur mesureProtoLabhttps://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
DB25-G2 25 broches Connecteur de signal de port de priseSources diversesDB25-G2 25DB25-G2 25 broches mâle prise Port Signal 2 rangée Borne Breakout Board Vis Écrou Connecteur
Fixation de scie diamantée pour dremelDremel Dremel545 Diamond Wheelhttps://www.dremel.com/us/en/p/545-26150545ab
Numérisation des étages de têteIntanRHD 32channel (Part #C3314)https://intantech.com/RHD_headstages.html?tabSelect=RHD32ch&yPos=120.80
000305175781
EDOTSigma AldrichProduit # 483028https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/483028
Coup de mainFret portuaireN/ACrochet https://www.harborfreight.com/helping-hands-60501.html
Clips électriquesDiverses sourcesN/ACrochet Test Fils de câble
Câbles d’interface (RHD 3 pi (0,9 m) câble SPI ultra mince)Intan  ; Partie #C3213https://intantech.com/RHD_SPI_cables.html
Prise de laboratoireSources diversesN/Ahttps://www.amazon.com/Stainless-Steel-Scissor-Stand-Platform/dp/B07T8FM85H/ref=asc_df_B07T8FM85H/?tag=&linkCode=df0&hvadid=366343
827267& hvpos=& hvnetw=g& hvrand
=2036619536500717246& hvpone
=& hvptwo=& hvqmt=& hvdev=c& hv
dvcmdl=& hvlocint=& hvlocphy=900
5674& hvtargid=pla-795933567991&
ref=& adgrpid=71496544770& th=1
MeloxicamMWI Santé animaleN/A
Micro-driveCrist Instrument3-NRMDhttps://www.cristinstrument.com/products/microdrives/miniature-microdrive-3-nrmd
Réseaux linéaires multicanaux en silicium avec connecteur 64 canauxNeuroNexusA1x32-5mm-25-177https://www.neuronexus.com/products/electrode-arrays/up-to-10-mm-depth/
Adaptateur NanoZ Omentics - 32 canauxNeuraLynxADPT-NZ-N2T-32https://neuralynx.com/hardware/adpt-nz-n2t-32
NanoZ SystemPlexonNanoZ Testeur d’impédancehttps://plexon.com/products/nanoz-impedance-tester/
Narishige MicromanipulateurNarishigeStereotaxic Micromanipulatorhttps://usa.narishige-group.com/
Open-Ephys GUIOpen-Ephyshttps://open-ephys.org/
Tube en polyimide (OD(in) : 0.021 / ID(in) 0.018 )Sources diverses (Chamfr)Chamfr Cat#HPC01895https://chamfr.com/sellers/teleflex-medical-oem-llc/
Primate ChairCustom made by University of RochesterMachine Shop Designs onlinehttps://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
Poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS)Sigma AldrichProduit # 243051https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/243051
RHD Carte d’interface USBIntanRHD2000 Carte d’évaluation Version 1.0https://intantech.com/RHD_USB_interface_board.html
Silastic gelWorld Precision Instruments# KWIK-SILAdhésif silicone à faible toxicité ((https://www.wpiinc.com/kwik-sil-low-toxicity-silicone-adhesive)
Buprénorphine à libération lenteCompounding Pharmacy
Fil d’acier inoxydable de calibre 36McMaster & CarrCat# 6517K11Fil d’acier inoxydable 304 rond polyvalent plié, finition mate, 1 pied de long, 0,008" de diamètre
Stanley Jeu de 6 tournevis de précision Stanley1,4 mmhttps://www.amazon.com/Stanley-Tools-6-Piece-Precision-Screwdriver/dp/B076621ZGC/ref=sr_1_3?crid=237VSK5FNFP9N&keywords=
stanley+66-052& qid=1672764369& sprefix=
stanley+66-052%2Caps %2C90& sr=8-3
Vis en acierMcMaster & Vishexagonales en acier inoxydable Carr de type 00 et 1/8" de longueurhttps://www.mcmaster.com/
tube d’acierMcMaster & Tubeen acier inoxydable Carr de calibre 28https://www.mcmaster.com/tubing/multipurpose-304-stainless-steel-6/id~0-055/
SuperglueLoctiteSuperGlue Gel Controlhttps://www.loctiteproducts.com/en/products/fix/super-glue/loctite_super_gluegelcontrol.html
mâle

Références

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  18. Okun, M., Lak, A., Carandini, M., Harris, K. D. Long term recordings with immobile silicon probes in the mouse cortex. PloS One. 11 (3), e0151180(2016).

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