Reproductibilité et harmonisation dans la recherche à l’aide d’étalons biologiques : l’exemple du peptide associé au collagène agoniste plaquettaire

Beaucoup d’entre nous utilisent des agonistes et des antagonistes biologiques dans nos expériences, le plus souvent dans un test biologique qui quantifie leur effet sur la fonction cellulaire dans des conditions spécifiques. La méthode décrite ici concerne le peptide réticulé (CRP-XL), un agoniste de la glycoprotéine VI qui active les plaquettes et dont l’activité peut être mesurée dans une variété de tests (agrégation par transmission de lumière, microscopie, cytométrie en flux, libération de Ca²⁺ , etc.), mais le protocole de standardisation des agonistes est applicable à tout agoniste/antagoniste biologique et/ou essai biologique. Les sciences physiques connaissent bien l’utilisation des normes dans leurs pratiques de travail quotidiennes, et les entreprises qui développent des médicaments biothérapeutiques dans le secteur commercial comprennent la valeur de l’utilisation d’étalons de référence¹, mais elles restent sous-utilisées par de nombreux scientifiques en biologie, en particulier dans la communauté de la recherche universitaire, et leur manque d’utilisation a un impact négatif sur la qualité de la production scientifique.

CRP-XL est un agoniste spécifique du GPVI que le domaine plaquettaire utilise depuis des décennies depuis sa description en 1995², aidant la communauté à délimiter le rôle du GPVI de celui des autres protéines plaquettaires de liaison au collagène depuis ^3,4. Cet agoniste peut être obtenu auprès de diverses sources commerciales ou produit en interne. Le monomère peptidique peut être acheté auprès d’un fournisseur, puis réticulé en interne, ou cela peut être fait par le fournisseur moyennant des frais supplémentaires. Des économies supplémentaires peuvent être réalisées en réduisant la pureté requise à la livraison (70 % contre 95 %, par exemple). Il n’y a pas non plus de consensus sur la façon dont le CRP-XL devrait être stocké, certains optant pour le stockage cryogénique et d’autres la réfrigération, certains gardant le matériau lyophilisé jusqu’à son utilisation, et d’autres le stockant en solution (eau ou tampon, selon les préférences). Par conséquent, la qualité et la composition des stocks de laboratoire ne sont ni normalisées ni harmonisées. Étant donné que cet agoniste est utilisé à une concentration définie (masse/volume) plutôt qu’à des unités d’activité, la puissance de la CRP-XL dans un laboratoire, par exemple à 1 μg/mL, ne sera pas la même qu’un autre. Il convient de noter que d’autres agonistes plaquettaires utilisés dans le domaine sont déjà normalisés (par exemple, la thrombine, qui est fournie et utilisée en unités d’activité plutôt qu’en masse/volume), de sorte que le passage de la masse/volume aux unités biologiques ne devrait pas être trop difficile pour la communauté. Il convient également de noter que les réponses des patients aux agonistes plaquettaires, y compris la CRP-XL, sont variables en termes de sensibilité aux agonistes ainsi que de capacité de réponse (étendue de la réponse)⁵, il est donc encore plus important d’utiliser des quantités constantes d’activité agoniste dans les tests.

Si les agonistes plaquettaires peuvent être harmonisés en les utilisant à une activité définie plutôt qu’à un poids/volume, on peut s’assurer qu’une expérience dans un laboratoire est directement comparable à celle d’autres laboratoires et peut être reproduite avec précision et confiance. Jusqu’à ce que le terrain parvienne à un accord sur la façon de stocker et de normaliser l’activité du CRP-XL, il est essentiel d’effectuer des contrôles réguliers sur le matériau pour s’assurer de sa cohérence au cours des mois/années au cours desquels il est utilisé.

L’attribution de la valeur de l’activité pour les étalons biologiques doit être effectuée par le biais d’études collaboratives et multicentriques (par exemple ^6,7) et nécessite une expertise spécialisée. La nécessité d’établir des normes biologiques pour les agonistes plaquettaires a récemment été mise en évidence par une étude multicentrique collaborative⁸ soutenue par la Société internationale de thrombose et d’hémostase (ISTH) ; Jusqu’à ce qu’une norme internationale CRP-XL soit disponible, les chercheurs peuvent normaliser leur propre matériel localement pour assurer la cohérence dans le temps, et que le nouveau matériel provenant du commerce ou de l’interne a une activité comparable à celle des préparations précédentes, ainsi qu’à celle du reste de la communauté.

Le sang doit être prélevé sur des volontaires sains consentants et traité conformément aux règles locales. Ce protocole mesure l’agrégation plaquettaire induite par les agonistes dans le plasma riche en plaquettes (PRP) par agrégation par transmission de lumière (LTA). L’ISTH fournit des protocoles normalisés, y compris une méthode de 2013 pour la préparation du PRP et LTA⁹.  Prélever le sang total dans du citrate de sodium à 4 % conformément aux recommandations de l’ISTH, conformément aux règles du comité d’éthique local. Exclure les donneurs qui ont pris des AINS au cours des 2 dernières semaines.

1. Procédure d’analyse

1. Prélever une aliquote de CRP-XL et la diluer dans un tampon d’essai (Tyrodes¹⁰) (tableau 1) jusqu’à une concentration initiale qui provoquera une agrégation maximale (voir la NOTE ci-dessous l’étape 1.3).
   REMARQUE : Dans la littérature, une concentration de 1 μg/mL induira une agrégation maximale, mais certains laboratoires ont besoin de concentrations plus élevées pour obtenir le même effet - ajustez la série de dilution en conséquence
2. Faire une série de dilution correspondante avec l’étalon (voir la REMARQUE ci-dessous l’étape 1.3 et la figure 1) de manière à ce que les concentrations soient les mêmes que celles du réactif d’essai.
3. Produire une série de dilution de 6 à 8 points pour l’essai et l’étalon, toujours dans un tampon d’essai, qui fait passer la réponse d’agrégation de 100 % à 0 % d’agrégation. Le tableau 2 montre un exemple de courbe de concentration d’une série de dilution à 8 points.
   REMARQUE : Certains laboratoires ajoutent un agoniste à un volume total de 10 % du dosage, par exemple, 50 μL d’agoniste à 450 μL de plaquettes, de sorte qu’ils diluent une concentration de 10x à une concentration finale de 1x dans le test, tandis que d’autres ajoutent des volumes plus petits (plus concentrés) d’agoniste, par exemple, 5 μL d’agoniste pour 495 μL de plaquettes - assurez-vous simplement que la série de dilution est appropriée pour le test en tenant compte du déplacement du volume affecte la concentration plaquettaire - encore une fois, soyez cohérent. Dans l’exemple, 30 μL d’agoniste 10x sont ajoutés à 270 μL de plasma riche en plaquettes (PRP).
4. Une fois que les plaquettes sont reposées et prêtes à l’emploi, aliquotez-les dans des cuvettes LTA, ajoutez une barre d’agitation et laissez-les atteindre 37 °C dans les puits de rétention.
5. Une fois à température, placez la ou les cuvettes dans l’agrégateur et commencez à enregistrer la ou les traces. Ajouter l’agoniste (en agitant) et enregistrer les données.
6. Répétez l’étape 1.4 pour chaque concentration de l’essai et de l’étalon jusqu’à ce que les données nécessaires au tracé des courbes aient été recueillies (exemples de courbes illustrés à la figure 2).
7. Calculer la puissance du réactif d’essai par rapport à celle de l’étalon ; Encore une fois, utilisez n’importe quelle métrique (agrégation maximale ou aire sous la courbe) tant qu’il y a cohérence et que le modèle d’analyse s’adapte de manière appropriée aux données.

2. Vérification des courbes de concentration

1. Tout d’abord, vérifiez que les courbes de réponse à la concentration sont parallèles. Il existe de nombreux logiciels qui font cela, mais ici le processus est décrit pour Graphpad Prism (voir Figure 3).
   1. Entrez les données de manière à ce que log(concentration) soit sur l’axe X et que la réponse (% d’agrégation maximale/ASC) soit sur l’axe Y (Figure 3A)
   2. Transformer les concentrations de CRP-XL (Figure 3B)
   3. Sélectionnez Régression non linéaire dans les fonctions d’analyse et utilisez l’équation pour la stimulation/inhibition dose-réponse.
   4. Sélectionnez le journal (agoniste) par rapport à la réponse (pente variable) - utilisez un ajustement à 3 ou 4 voies selon ce qui convient le mieux aux données.
   5. Déterminez si les courbes sont parallèles à l’aide de l’onglet Comparer (comme illustré à la figure 3C) et cliquez sur le bouton pour comparer les jeux de données afin de vous assurer que la pente (pente de colline) et les asymptotes ( le haut et le bas des courbes) sont équivalentes. Dans cet exemple, la pente de Hill pour l’essai est de 2,279 et celle de la norme est de 2,025, ce qui donne un rapport de 1,125.
   6. Si les pentes sont parallèles (par exemple, un critère d’acceptation du rapport de pente entre 0,8 et 1,25) et que les asymptotes sont équivalentes, procédez au calcul de la puissance (EC₅₀) en utilisant les étapes 2.1.3 et 2.1.4. Dans l’exemple présenté ici, les asymptotes ont été contraintes car l’évaluation de l’étape 2.1.5 a confirmé que les asymptotes sont équivalentes.
   7. Divisez la valeur EC₅₀ de l’étalon par celle de l’essai pour déterminer la puissance relative. Dans l’exemple présenté ici, test/standard (0,07259/0,1498) = 0,4846, c’est-à-dire que le « test » est deux fois moins puissant que le standard.
   8. Ajuster les concentrations massiques/volumiques pour tenir compte de la différence de puissance, c’est-à-dire que si l’étalon était utilisé auparavant à 1 μg/mL, le nouveau matériau serait utilisé à 1/0,4846 = 2,063 μg/mL) pour s’assurer que des quantités comparables de matière active sont utilisées dans les expériences.

La figure 1 est une représentation schématique d’une série de dilution et vise à mettre en évidence qu’une série de dilution est nécessaire à la fois pour l’étalon et pour l’essai. La figure 2A montre les traces d’agrégation de la norme, tandis que les données de test sont illustrées à la figure 2B. À 0,075 μg/mL, il y a une réponse claire à la norme, tandis que pour le test, la concentration correspondante (0,075 μg/mL) est plate, c’est-à-dire qu’il n’y a pas de réponse. Ces données sont utilisées pour tracer les graphiques suivants afin d’obtenir l’EC50. Dans l’exemple illustré ici, une agrégation maximale de 100 % a été utilisée pour tracer la courbe concentration-réponse et déterminer l’EC50, comme le montre la figure 3.

Figure 1 : Description graphique des deux séries de dilutions de l’essai (à gauche) et de l’étalon (à droite). En commençant par la concentration maximale (concentration suggérée : 10 μg/mL CRP-XL), des dilutions séquentielles de 1 sur 2 sont effectuées en parallèle sur 8 points (>3 unités logarithmiques). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Traces d’agrégation pour la série de dilution standard (à gauche) et la série de dilution d’essai (à droite). Au fur et à mesure que l’agrégation plaquettaire se poursuit (axe des abscisses), la quantité de lumière traversant l’échantillon et atteignant le capteur augmente (axe des ordonnées). (A) Standard. (B) Test. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Saisie et analyse des données. (A) Les données sont saisies, (B) transformées et (C,D) analysées pour le parallélisme (demandez au logiciel de dire si les pentes et les asymptotes de Hill sont comparables [C]). (E) Si les courbes sont parallèles, déterminer la puissance (EC50) à l’aide d’un ajustement de courbe de régression non linéaire. (F) Données transformées tracées. Veuillez vous référer à la méthode pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition de la zone tampon de Tyrodes.

Tableau 2 : Exemple d’une série de dilution à 8 points.

Les auteurs n’ont rien à déclarer.