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Article de méthode

Activité adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis dans l’amélioration de l’immunogénicité des autoantigènes au cours de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

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DOI :

10.3791/65422

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12 mai 2023

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1Department of Neurology, Juntendo University, 2Biomedical Research Core Facilities, Juntendo University, 3Neurodegenerative Disorders Collaborative laboratory, RIKEN Center for Brain Science

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole alternatif pour induire activement l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale chez les souris C57BL / 6, en utilisant l’épitope immunogène myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG)35-55 en suspension dans l’adjuvant de Freund incomplet contenant la sous-espèce paratuberculose de Mycobacterium avium tuée par la chaleur.

Résumé

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) induite par la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) nécessite une immunisation par un peptide MOG émulsionné dans un adjuvant de Freund complet (CFA) contenant Mycobacterium tuberculosis. Les composants antigéniques de la mycobactérie activent les cellules dendritiques pour stimuler les cellules T à produire des cytokines qui favorisent la réponse Th1 via des récepteurs de type Toll. Par conséquent, la quantité et les espèces de mycobactéries présentes lors de la provocation antigénique sont directement liées au développement de l’EAE. Cet article sur les méthodes présente un protocole alternatif pour induire l’EAE chez les souris C57BL/6 à l’aide d’un adjuvant de Freund incomplet modifié contenant la souche K-10 de la sous-espèce Paratuberculosis de Mycobacterium avium tuée par la chaleur.

M. paratuberculosis, membre du complexe Mycobacterium avium, est l’agent causal de la paratuberculose chez les ruminants et a été identifié comme un facteur de risque de plusieurs troubles induits par les lymphocytes T humains, y compris la sclérose en plaques. Dans l’ensemble, les souris immunisées avec Mycobacterium paratuberculosis ont montré une apparition plus précoce et une plus grande gravité de la maladie que les souris immunisées avec CFA contenant la souche H37Ra de M. tuberculosis aux mêmes doses de 4 mg/mL. Les déterminants antigéniques de la souche K-10 de la sous-espèce paratuberculeuse de Mycobacterium avium ont pu induire une forte réponse cellulaire Th1 pendant la phase effectrice, caractérisée par un nombre significativement plus élevé de lymphocytes T (CD4+ CD27+), de cellules dendritiques (CD11c+ I-A/I-E+) et de monocytes (CD11b+ CD115+) dans la rate comparativement aux souris immunisées par le CFA. De plus, la réponse proliférative des lymphocytes T au peptide MOG semblait être la plus élevée chez les souris immunisées contre M. paratuberculosis. L’utilisation d’un encéphalitogène (p. ex. MOG35-55) émulsionné dans un adjuvant contenant M. paratuberculosis dans la formulation peut être une méthode alternative et validée pour activer les cellules dendritiques pour amorcer les lymphocytes T CD4+ spécifiques de l’épitope de myéline pendant la phase d’induction de l’EAE.

Introduction

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle commun pour l’étude des troubles démyélinisants humains1. Il existe plusieurs modèles d’EAE : immunisation active à l’aide de différents peptides de myéline en combinaison avec des adjuvants puissants, immunisation passive par transfert in vitro de lymphocytes CD4+ spécifiques de la myéline et modèles transgéniques d’EAE2 spontanée. Chacun de ces modèles présente des caractéristiques spécifiques qui permettent d’étudier différents aspects de l’EAE, tels que l’apparition, la phase effectrice ou la phase chronique. Le modèle de glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) de l’EAE est un bon modèle pour étudier les mécanismes à médiation immunitaire de la neuroinflammation chronique et de la démyélinisation, car il est caractérisé par une infiltration inflammatoire mononucléaire, une démyélinisation dans la substance blanche périphérique et une récupération réduite après le pic de la maladie1.

Le MOG-EAE est induit par l’immunisation de souris sensibles avec le peptide MOG35-55 dans l’adjuvant de Freund complet (CFA), suivie d’une injection intrapéritonéale de toxine coqueluche. Cela augmente la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique et permet aux lymphocytes T spécifiques à la myéline activés à la périphérie d’atteindre le système nerveux central (SNC), où ils seront réactivés3. La CFA joue un rôle clé dans l’induction de l’EAE en améliorant l’absorption de l’antigène par les cellules présentatrices d’antigènes et l’expression des cytokines liées aux réponses humorales et à médiation cellulaire4. Ce mécanisme est principalement dû à la présence de Mycobacterium tuberculosis tué émulsionné dans l’huile, dont les composants fournissent un puissant stimulant pour le système immunitaire5. En fait, l’induction de l’EAE est directement liée à la quantité de mycobactérie présente lors du défi antigénique6.

L’ajout d’autres mycobactéries tuées, telles que Mycobacterium butyricum, à l’adjuvant de Freundincomplet 7, ainsi que l’effet des combinaisons adjuvantes8, peuvent moduler l’évolution clinique de l’EAE et par conséquent influencer la reproductibilité des résultats. Mycobacterium avium sous-espèce paratuberculosis (MAP), l’agent étiologique de la paratuberculose chez les ruminants, a été associé à des troubles inflammatoires du SNC humain 9, car ses composants antigéniques sont capables de provoquer une forte réponse humorale et cellulaire chez les patients atteints de sclérose en plaques et de troubles du spectre de la neuromyélite optique9. Par conséquent, dans ce protocole, nous montrons une méthode alternative et reproductible pour induire MOG-EAE en remplaçant M. tuberculosis dans CFA par M. paratuberculosis.

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Protocole

Toutes les expériences sur les souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine de l’Université Juntendo (numéro d’approbation 290238) et ont été menées conformément aux directives des National Institutes of Health pour l’expérimentation animale.

1. Observations générales sur l’expérience

  1. Hébergez les souris dans des cages individuelles dans l’animalerie dans des conditions contrôlées et exemptes d’agents pathogènes à 23 °C ± 2 °C avec 50 % ± 10 % d’humidité, et un cycle lumière/obscurité de 12 h avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau.
  2. Injectez aux souris une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans antigène ni CFA, et utilisez-les comme témoins négatifs et positifs, respectivement.

2. Préparation des antigènes mycobactériens

  1. Cultiver la souche K-10 de M. paratuberculosis dans le milieu liquide 7H9 de Middlebrook enrichi de 10 % d’OADC (acide oléique, albumine, dextrose, catalase), de 0,005 % de Tween 80 et de 2 mg/L de mycobactine J pendant 2 semaines dans des flacons de culture tissulaire T25 à 37 °C. Évaluer régulièrement la croissance de la colonie par inspection visuelle.
    MISE EN GARDE : Manipuler M. paratuberculosis dans une installation de niveau de biosécurité 2 (BSL-2).
  2. Cultiver la culture d’enrichissement dans une fiole d’erlenmeyer de 500 mL avec une suspension de 1,7 × 105 unités formant colonies (UFC)/mL dans un volume final de 200 mL (même milieu que l’étape 2.1) dans un incubateur à agiter pendant 1 semaine.
    REMARQUE : Comme les organismes contaminants peuvent affecter les résultats, les bactéries doivent être inoculées sur un milieu solide Middlebrook 7H10 pour déterminer la morphologie de la colonie et vérifier la pureté par des trousses de détection conventionnelles de réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour M. paratuberculosis.
  3. Inactiver les suspensions bactériennes pendant 5-10 min à 70 °C et centrifuger à 3 000 × g pendant 10 min. Lavez deux fois la pastille pesée dans du PBS, perturbez-la par sonication et stockez-la à -20 °C.
  4. Transférer la pastille dans un récipient stérile et la congeler avec de la glace sèche ou de l’azote liquide. Transférer immédiatement dans une chambre de lyophilisation.
  5. Lyophiliser (4 h à -50 °C sous vide) M. paratuberculosis selon le manuel de la machine.
  6. À la fin de la lyophilisation, retirez le récipient en acier inoxydable du lyophilisateur et transférez-le sur un banc de nettoyage biologique. Utilisez une spatule en acier inoxydable pour déloger les morceaux de MAP séchés adhérant à la paroi intérieure du contenant en acier inoxydable et pulvérisez-les aussi finement que possible.
  7. Peser les cellules pulvérisées à l’aide d’une balance électronique et les placer manuellement dans un flacon aseptique de 10 mL à une concentration de 10 mg/mL.
    NOTE: La densité cellulaire a été quantifiée en grammes de poids sec par litre d’échantillon. Après 3 semaines, 1 mg (poids humide) de pastille cellulaire bactérienne contient environ 2,5 × 108 UFC.

3. Préparation de l’émulsion MOG 35-55

  1. Broyer le contenu d’un flacon de M. paratuberculosis séché (10 mg) en poudre fine avec un mortier et un pilon et ajouter 10 mL à l’adjuvant de Freund incomplet pour obtenir une solution mère de 10 mg/mL. Conserver à -4 °C.
  2. Avant l’immunisation, diluer la solution mère jusqu’à une concentration finale de 4 mg/mL.
  3. Diluer le peptide MOG35-55 dans duddH2Ojusqu’à obtention d’une concentration finale de 2 mg/mL et conserver à -20 °C.
  4. À l’aide d’un homogénéisateur, mélanger la solution MOG35-55 (2 mg/mL) avec un volume égal d’adjuvant (4 mg/mL) de l’étape 3.2 dans un tube de 5 mL jusqu’à formation d’une émulsion épaisse. Toutes les 10 s de mélange, placer la solution sur de la glace pendant 20 s et faire tourner le tube pour récupérer toute la solution.
  5. Transférer l’émulsion dans une seringue de 1 mL, retirer tout l’air et ajouter une aiguille de 27 G. L’émulsion est maintenant prête pour l’injection.
    NOTE. Étant donné qu’une certaine perte de l’émulsion visqueuse de MOG35-55 se produit pendant la préparation, il est préférable de préparer 1,5 fois la quantité nécessaire.

4. Immunisation des animaux

  1. Anesthésier les animaux par inhalation d’isoflurane afin de minimiser le stress sur les animaux.
  2. Injecter l’émulsion (200 μL contenant 200 μg/souris de MOG35-55) par voie sous-cutanée dans le bas du dos.
  3. Administrer une dose de toxine anticoqueluche (100 μL contenant 200 ng/souris) par voie intrapéritonéale aux jours 0 et 2 suivant l’immunisation.
    ATTENTION : La toxine de la coqueluche a un effet suppresseur multiple sur le système immunitaire; Éviter l’ingestion et le contact avec les yeux et la peau.

5. Évaluation clinique

  1. Surveillez quotidiennement le poids des souris et les signes cliniques. Utilisez le système de notation suivant : 0 = aucun signe clinique; 1 = queue flasque; 2 = altération du réflexe de redressement et faiblesse des membres postérieurs; 3 = paralysie complète des membres postérieurs; 4 = paralysie complète des membres postérieurs avec paralysie partielle des membres antérieurs; 5 = moribond.
    REMARQUE : Lors de l’observation initiale des signes cliniques, les animaux bénéficient d’un accès accru à l’eau et à la nourriture. Le chow de rongeurs est ramolli et humidifié, puis placé sur le sol de la cage à partir de la trémie de nourriture. Dans le cas des animaux déshydratés, une supplémentation en liquide sous-cutané est administrée ou une suspension de chow de rongeur est administrée par gavage oral. Si une souris a besoin de ce type d’assistance pendant plus de 3 jours, l’euthanasie sera effectuée.
  2. Pour éviter ou minimiser la douleur et la détresse chez l’animal, utilisez les critères humains suivants : perte de poids corporel supérieure à 20 %, score clinique ≥4,0, absence du réflexe de redressement au score 3 et lorsque l’animal est incapable d’accéder à de la nourriture ou à de l’eau pendant 24 heures.
    NOTE: Les souris ont été euthanasiées le jour 30 après l’induction de l’EAE par injections intrapéritonéales de pentobarbital (≥150 mg / kg).

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Résultats

Des groupes de souris C57BL/6 (n total = 15/groupe) ont été immunisés avec MOG35-55 dans une émulsion contenant M. paratuberculosis ou par la méthode commune avec CFA. Tous les groupes de souris ont manifesté une maladie monophasique aiguë caractérisée par un seul pic d’incapacité observé à 14-17 jours, suivi d’une récupération partielle des symptômes au cours des 10 jours suivants (Figure 1A). Les souris immunisées avec l’adjuvant contena...

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Discussion

Nous avons démontré un protocole alternatif robuste pour induire activement une EAE sévère chez les souris C57BL/6J en utilisant le peptide MOG35-55 émulsionné dans un adjuvant contenant M. paratuberculosis10. L’induction de l’EAE par cette méthode a entraîné une maladie plus sévère que celle induite par le protocole commun avec le CFA. Cette différence pourrait être due aux différents composants lipidiques dans la paroi cellulaire des mycobactéries11. E...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a reçu le soutien d’une subvention de la Société japonaise pour la promotion de la science (subvention no. JP 23K14675).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
anticorps anti-souris CD115Biolegend, États-Unis135505pour la cytofluorimétrie 1:1 000
anti-souris CD11bBiolegend, États-Unis101215pour la cytofluorimétrie 1:1 000
anti-souris CD11cBiolegend, États-Unis117313pour la cytofluorimétrie 1:1 000
anticorps anti-souris CD16/32  ; Biolegend, États-Unis101302pour cytofluorimétrie 1:1 000
anticorps anti-souris CD4  ;Biolegend, États-Unis116004pour cytofluorimétrie 1:1 000
anticorps anti-souris CD8a  ;Biolegend, États-Unis100753pour cytofluorimétrie 1:1 000
anti-souris I-A/I-EBiolegend, États-Unis107635pour cytofluorimétrie 1:1 000
anticorps anti-Ly-6Cde souris Biolegend, États-Unis128023pour la cytofluorimétrie 1:1 000
BBL Middlebrook OADC EnrichmentThermo Fisher Scientific, États-UnisBD 211886pour l’isolement et la culture de mycobactéries
C57BL/6J sourisCharles River Laboratory, Japon3 semaines, mâle et femelle
FBS 10279-106Gibco Life Techologies, États-Unis42F9155Kpour la culture cellulaire, chaude à 37 ° ; C avant utilisation
LyophilisateurMachine Eyela, Tokyo, JaponFDU-1200pour lyophilisation
bactérienne incomplète e Freund' s adjuvantDifco Laboratories, MD, USA263810pour utilisation dans l’adjuvant
Middlebrook 7H9 BrothDifco Laboratories, MD, USA90003-876aider à la croissance des mycobactéries
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10ATCC, USABAA-968bactéries d’origine bovine
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, desséchéBD Biosciences, USA743-26880-EApour utilisation dans l’adjuvant
Mycobactine JAllied Laboratory, MO, États-Unispromoteur de croissance
Myéline Oligodendrocyte Glycolipide (MOG) 35-55AnaSpec, États-UnisAS-60130-10peptide encéphalotigène
Ovalbumine (257-264)Sigma-Aldrich, États-UnisS7951-1MGantigène de contrôle négatif  ; pour le dosage prolifératif de
la toxine coqueluche solutionFujifilm Wako, Osaka Japon168-22471À partir de bactéries à Gram négatif Bordetella pertussi, augmente la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique
Homogénéisateur Polytron PT 3100Kinematicapour mélanger l’antigène avec l’adjuvant
RPMI 1640 avec de la L-glutamineGibco Life Techologies, États-Unis11875093 Pourla culture cellulaire
Thymidine, [Methyl-3H], dans 2 % d’éthanol, 1 mCiPerkinElmer, Waltham, MA, États-UnisNET027W001MCpour l’essai de prolifération, utilisation (1 &mu ; Ci/well)
Zombie NIR Fixable Viability KitBiolegend, États-Unis423105  ; la cytofluorimétrie, pour la viabilité cellulaire
anticorps anticorps anticorps

Références

  1. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275(2014).
  2. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  3. Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
  4. Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114(2013).
  5. Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064(2020).
  6. Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
  7. O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
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  9. Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216(2017).
  10. Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
  11. Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
  12. Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179(2017).
  13. Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477(2021).
  14. Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).

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Mots-clés

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Activité adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis dans l’amélioration de l’immunogénicité des autoantigènes au cours de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale
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