Criblage des canaux ioniques dans les cellules cancéreuses

Les protéines de transport membranaire sont essentielles à la communication entre les cellules, ainsi qu’au maintien de l’homéostasie cellulaire. Parmi les protéines de transport membranaire, les canaux ioniques servent à stimuler la croissance et le développement des cellules et à maintenir l’état des cellules dans des environnements difficiles et changeants. Il a également été rapporté que les canaux ioniques conduisent et soutiennent le développement de tumeurs solides, à la fois systémiques et dans le système nerveux central (SNC)^1,2. Par exemple, les canaux KCa3.1 sont responsables de la régulation du potentiel membranaire et du contrôle du volume cellulaire, ce qui est important dans la régulation du cycle cellulaire. Des canaux KCa3.1 défectueux ont été signalés pour contribuer à la prolifération anormale des cellules tumorales³. De plus, les canaux ioniques peuvent contribuer à la dissémination métastatique des cancers. Les canaux du potentiel récepteur transitoire (TRP), par exemple, sont impliqués dans l’afflux de Ca 2+ et de Mg²⁺; Cet afflux active plusieurs kinases et protéines de choc thermique qui fonctionnent pour réguler la matrice extracellulaire entourant une tumeur, ce qui est, à son tour, important pour initier les métastases cancéreuses⁴.

Étant donné que les canaux ioniques peuvent contribuer au développement de cancers, ils peuvent également être des cibles pour le traitement du cancer lié aux médicaments. Par exemple, la résistance aux modalités de traitement, y compris la chimiothérapie et la nouvelle immunothérapie, est liée à la dysrégulation de la fonction des canaux ioniques ^5,6,7. En outre, les canaux ioniques deviennent des cibles médicamenteuses importantes pour entraver la croissance et le développement des cancers, avec des médicaments à petites molécules réutilisés (approuvés par la FDA) à l’étude, ainsi que des biopolymères, y compris des anticorps monoclonaux 1,2,8,9. Bien qu’il y ait eu beaucoup de progrès sur ce front, la découverte de médicaments contre le cancer des canaux ioniques reste sous-développée. Cela est dû en partie aux défis uniques de l’étude des canaux ioniques dans les cellules cancéreuses. Par exemple, il existe des limites techniques dans la mise en place de tests électrophysiologiques pour les composés à action lente et des différences temporelles dans l’activation des canaux et l’action du médicament. En outre, la solubilité des composés peut également entraver les progrès, car la plupart des systèmes électrophysiologiques automatisés couramment utilisés aujourd’hui utilisent des substrats hydrophobes, ce qui peut contribuer aux artefacts résultant de l’adsorption des composés. En outre, les grands traitements moléculaires bioorganiques tels que les produits naturels, les peptides et les anticorps monoclonaux sont techniquement difficiles à dépister à l’aide de tests électrophysiologiques conventionnels¹⁰. Enfin, les propriétés bioélectriques des cellules cancéreuses restent mal comprises¹¹.

Pendant ce temps, la coloration par immunofluorescence des canaux ioniques est souvent difficile. Cela est dû, en partie, à la complexité de leurs structures et de leur contexte dans la membrane, qui ont un impact sur la capacité de générer et d’utiliser des anticorps pour les études de microscopie. Il est particulièrement important que la spécificité, l’affinité et la reproductibilité des anticorps utilisés pour colorer les canaux ioniques soient validées. Les anticorps commerciaux pour les canaux ioniques doivent être envisagés en fonction de leur stratégie de validation et de leur dossier de publication. Les expériences doivent inclure des témoins négatifs pour démontrer l’absence de liaison non spécifique par knockdown ou knockout de la protéine cible. Alternativement, les lignées cellulaires dans lesquelles la protéine cible est absente ou en faible abondance basée sur les déterminations d’ARNm ou de protéines peuvent servir de témoins négatifs. Par exemple, cette étude montre la localisation de la sous-unité du récepteur (GABA) Gabra5 dans une lignée cellulaire de médulloblastome (D283). Les cellules D283 avec un siRNA knockdown et les cellules Daoy, une autre lignée cellulaire de médulloblastome cérébelleux, ont été colorées pour Gabra5 et n’ont montré aucune coloration appréciable (données non présentées).

Ici, des méthodes sont présentées pour analyser et tester la fonction des canaux ioniques, ainsi que l’effet des modulateurs des canaux ioniques sur les cellules cancéreuses. Des protocoles sont fournis pour (1) colorer les cellules d’un canal ionique, (2) tester l’état polarisé des mitochondries, (3) établir la fonction du canal ionique à l’aide de l’électrophysiologie et (4) valider des médicaments in vitro. Ces protocoles mettent l’accent sur les études du récepteur 2,12,13,14,15,16 de l’acide gamma-aminobutyrique de type A (GABA A), un canal anionique chlorure et un récepteur neurotransmetteur inhibiteur majeur. Cependant, les méthodes présentées ici s’appliquent à l’étude de nombreuses autres cellules cancéreuses et canaux ioniques.

1. Canaux ioniques immunomarqueurs dans les cellules en culture

1. Préparation des cellules et mise en place expérimentale
   1. Maintenir les cellules en culture en croissance active dans des flacons de culture de 75 cm² . Passez les cellules une fois jusqu’à ce qu’elles deviennent confluentes à 50%-90%, en fonction du temps de doublement de la lignée cellulaire utilisée.
      REMARQUE : Pour la présente étude, des cellules D283, une lignée cellulaire de médulloblastome du groupe 3, ont été utilisées.
   2. Recueillir les cellules du ballon de culture dans un tube à centrifuger (15 mL ou 50 mL) et ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % pour détacher les cellules adhérentes. Incuber pendant 5 min à température ambiante (RT). Après 5 min, tapoter la fiole trois à cinq fois pour aider à détacher les cellules. Recueillir les cellules dans 10 mL de milieu avec 10% FBS pour arrêter l’action de la trypsine.
   3. Centrifuger à 480 x g pendant 5 min à TA. Aspirer doucement le milieu. Ne pas déranger la pastille de cellule.
   4. Remettez les cellules en suspension dans 5 mL à 10 mL de milieu, selon la densité de la culture.
      NOTA : La densité doit correspondre à celle des cellules en croissance active et dépend de la confluence des cellules dans le flacon. L’évaluation visuelle devrait être utilisée pour estimer la densité cellulaire optimale; Plus précisément, les cellules doivent être confluentes entre 40% et 90% et réparties uniformément.
   5. Retirer 100 μL de cellules et les ajouter dans un tube de 1,5 mL contenant 100 μL de bleu de trypan à 0,4 % pour marquer les cellules non viables. Incuber 5-15 min à TA, selon la lignée cellulaire.
   6. Compter les cellules manuellement à l’aide d’un hémocytomètre (voir le tableau des matériaux) dans 10 μL de solution. Comptez les cellules vivantes non colorées dans chacun des quatre coins des 16 carrés de l’hémocytomètre. Multipliez le nombre moyen de cellules par le facteur de dilution et par 10 000 pour obtenir les cellules par millilitre (cellules/mL). Alternativement, un compteur de cellules automatisé peut être utilisé.
   7. Diluer les cellules à 1 x 10⁵ cellules/mL dans le milieu de culture spécifié pour chaque lignée cellulaire. Graine 1. 8 mL de cellules dans chaque puits d’une plaque de 6 puits contenant une lamelle de couverture de 22 mm x 22 mm prérecouverte de poly-D-lysine de 0,1 mg/mL conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE: On peut vouloir tester l’utilisation de la poly-D-Lysine et de la poly-L-lysine, car il existe des rapports de préférences spécifiques à la lignée cellulaire^17,18. Certaines lignées cellulaires ont des protéases qui peuvent décomposer la poly-L-lysine, alors qu’il y a des rapports que la poly-D-lysine est toxique pour certaines lignées cellulaires. En revanche, les cellules neuronales, telles que PC12, ont été signalées pour être plus saines sur les surfaces poly-D-lysine.
   8. Cultivez les cellules dans un incubateur avec un environnement humidifié à 5% de CO₂ à 37 ° C pendant la nuit pour permettre aux cellules de se fixer à la lame. Examiner la fixation des cellules sous un microscope inversé avec un objectif 20x.
      REMARQUE: Les cellules doivent être complètement attachées à la lamelle de couverture avant le traitement ou l’immunomarquage direct. À ce stade, les cellules peuvent être traitées avec des médicaments (ou le contrôle du véhicule) soit par l’ajout d’un stock concentré (par exemple, 600 μL d’une solution mère 4x), soit par le remplacement du milieu par un milieu frais contenant le médicament à la concentration désirée de 1x; Les cellules peuvent ensuite être retournées à l’incubateur jusqu’à 48 heures supplémentaires. Des cellules traitées au solvant sont incluses pour évaluer les effets du médicament sur le niveau et la localisation de la molécule cible. Dans la présente étude, les cellules D283 ont été traitées avec 600 μL d’une solution 3,2 μM d’un modulateur allostérique positif du récepteur GABA_A , QH-II-066¹⁴ (voir le tableau des matériaux), pendant 48 h. Les cellules témoins ont été traitées avec un volume équivalent de DMSO.
2. Préparation à l’immunomarquage : fixation, perméabilisation et blocage
   1. Rincer les cellules avec 2,5 mL de 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM_Na2HPO4, 2 mM KH₂PO₄, voir le tableau des matériaux), et aspirer immédiatement la solution.
   2. Fixez les cellules en utilisant 1 mL de PFA à 4% dans 1x PBS pendant 1 h à TA.
      REMARQUE: Alors que 4% PFA est le fixateur standard pour l’immunomarquage, le glutaraldéhyde ou le glyoxal peuvent également être utilisés pour fixer les protéines membranaires pour l’immunofluorescence. Les méthodes de fixation à base d’alcool, telles que les traitements au méthanol glacé, peuvent entraîner une morphologie moins bien préservée et une perte de protéines membranaires^19,20.
   3. Laver six fois avec 2,0 ml de 1x PBS (5 min par lavage) en agitant sur un shaker. Incuber pendant 1 h à TA dans un tampon de blocage composé de 1x PBS avec 0,8% de Triton X-100 et 10% de sérum normal correspondant à l’espèce hôte de l’anticorps primaire (alternativement, 3% de BSA ou d’albumine de fraction V sérique bovine peuvent être utilisés à la place du sérum normal).
      Remarque : Cette étape est utilisée pour bloquer la liaison non spécifique.
3. Immunomarquage
   NOTE: Après avoir ajouté les anticorps conjugués aux fluorophores, des mesures doivent être prises rapidement pour éviter le photoblanchiment. Les incubations avec des anticorps conjugués doivent être protégées de la lumière. L’utilisation d’un support de montage contenant des agents qui éliminent les radicaux libres réduira le photoblanchiment. Conserver les lames dans un récipient opaque et étanche à la lumière (à 4 °C) après avoir scellé les lames de couverture. Lors de l’imagerie, le photoblanchiment peut être minimisé en limitant l’intensité de l’éclairage d’excitation et les temps d’exposition.
   1. Préparer une chambre humidifiée en tapissant le fond d’une capsule de culture de 150 mm de papier filtre. Humidifiez le papier filtre avec de l’eau distillée stérile. Dessinez une grille 3 x 2 sur un morceau de film de laboratoire découpé pour l’adapter au-dessus du papier filtre et étiquetez-le pour préserver l’orientation des lamelles de couverture dans la plaque à 6 puits. Placez le film de laboratoire sur le papier filtre, en exposant les bords supérieur et inférieur pour humidifier la chambre.
   2. Préparer 100 μL par lamelle de couverture de la dilution souhaitée de l’anticorps primaire dans 1x PBS avec 3% de BSA. Pour détecter le produit protéique du gène GABRA , utiliser un anticorps primaire monoclonal recombinant de lapin à une dilution de 1:200 (anticorps Gabra5, région médiane; voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Pour déterminer empiriquement la concentration d’anticorps primaire qui produit le signal optimal sur le bruit de fond, utilisez une série de dilution de l’anticorps primaire tout en maintenant la concentration secondaire constante. Des dilutions de 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 et 1:1 000 sont recommandées pour établir des concentrations optimales d’anticorps primaires.
   3. Transférer la lame de couverture de la solution de bloc dans la plaque à 6 puits à l’emplacement approprié sur la grille dessinée sur le film de laboratoire. Jetez la solution de bloc de la plaque à 6 puits et conservez la plaque pour les étapes de lavage.
   4. Ajouter délicatement 100 μL d’anticorps primaire dilué au centre de chaque lame. Évitez de placer la solution sur le bord de la lame. Incuber pendant 1 h chez RT.
   5. Ajouter 2,5 mL de 1x PBS à chaque puits de la plaque à 6 puits. Replacez la lamelle de couverture à l’endroit approprié dans la plaque à 6 puits.
   6. Effectuez six lavages de 5 minutes chacun avec 2,5 ml de 1x PBS.
      REMARQUE: Ne laissez pas les lamelles de couverture sécher pendant les étapes de rinçage, car cela peut contribuer à un signal de fluorescence de fond.
   7. Remettez les lames de couverture à l’endroit approprié sur le film de laboratoire. Pour chaque lamelle de couverture, ajouter 100 μL d’anticorps secondaire dilué dans 1x PBS + 1%-5% BSA.
      REMARQUE: Initialement, les anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor 488 (voir le tableau des matériaux) sont utilisés à une dilution de 1: 1 000 dans 1x PBS + 3% BSA. La concentration d’anticorps secondaires peut être optimisée en augmentant la concentration pour détecter les protéines cibles de faible abondance ou en diminuant la concentration pour réduire le bruit de fond, si nécessaire.
   8. Pour les étapes restantes, minimiser l’exposition à la lumière pour éviter le photoblanchiment de l’anticorps secondaire conjugué. Couvrir le plat de culture avec du papier d’aluminium et incuber pendant 1 h à RT.
   9. Transférez les lamelles de couverture sur la plaque à 6 puits. À l’aide d’un agitateur, effectuez six lavages de 5 minutes chacun avec 2,5 ml de 1x PBS. Retirez le PBS en retournant la plaque au-dessus de l’évier ou d’une poubelle. Après le dernier lavage, laissez le PBS dans le puits pour faciliter le retrait de la lamelle de couverture.
   10. Étiquetez une lame de microscope pour chaque lamelle de couverture. Ajouter une goutte de milieu de montage contenant du glycérol avec DAPI (pour colorer les noyaux) (voir le tableau des matériaux) au centre de la lame.
   11. À l’aide d’une pince, retirez la lamelle de couverture du puits et placez-la délicatement sur la goutte de support de montage au centre de la glissière.
       REMARQUE: Évitez la formation de bulles d’air dans le support de montage.
   12. Utilisez de petits morceaux de papier filtre pour enlever l’excès de support de montage. Scellez les bords de la lamelle de couverture avec du vernis à ongles et laissez le vernis sécher complètement avant l’imagerie. Conservez les lames de verre à 4 °C dans une boîte en plastique opaque.
4. Imagerie et analyse
   1. Acquérir des images avec un microscope à fluorescence sous un objectif 40x avec de l’huile d’immersion (voir le tableau des matériaux).
   2. Visualisez les images de fluorescence avec les filtres appropriés.
   3. REMARQUE: Pour Alexa Fluor 488, utilisez une excitation/émission de 496 nm/519 nm ; pour le DAPI, utiliser une excitation/émission de 358 nm/461 nm.
   4. Capturez et enregistrez les fichiers d’images numériques. Une valeur de regroupement de 4 x 4 est utilisée pour faciliter les taux de collecte d’images et réduire l’arrière-plan.
   5. Préparez les images finales. Les images peuvent être traitées avec ImageJ ou un logiciel disponible dans le commerce. Les résultats sont illustrés à la figure 1.

2. Tester l’état polarisé des mitochondries

REMARQUE: Ce protocole utilise le test TMRE (tétraméthylrhodamine, ester éthylique) pour marquer le potentiel membranaire dans les mitochondries actives, en maintenant une charge négative^21,22. L’EMRT est un colorant rouge-orange, chargé positivement perméable aux cellules, qui s’accumule dans les mitochondries actives en raison de leur charge négative relative. Les mitochondries inactives ou dépolarisées ont un potentiel membranaire réduit et ne parviennent pas à séquestrer proportionnellement l’EMRT. FCCP (carbonyl cyanure 4-[trifluoromethoxy]phenylhydrazone), un ionophore découpleur de phosphorylation oxydative (OXPHOS), dépolarise les membranes mitochondriales, empêchant ainsi l’accumulation et la séquestration de TMRE²³. Ceci est illustré à la figure 2.

1. Préparation des cellules et mise en place expérimentale
   1. Maintenir les cellules dans des flacons de culture de 75 cm² . Aspirer le milieu de culture et rincer les cellules avec 1x PBS sans calcium ni magnésium.
   2. Ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % pour détacher les cellules adhérentes. Incuber pendant 5 min à TA, et remettre les cellules en suspension dans 10 mL de milieu.
   3. Recueillir les cellules du ballon de culture dans un tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger à 480 x g pendant 5 min à TA. Aspirer le milieu.
   4. Remettez les cellules en suspension dans 5 mL à 10 mL de milieu, selon la confluence originale de la culture, de sorte que la concentration cellulaire soit de 50 à 100 cellules par carré sur l’hémocytomètre. Ajustez le volume, si nécessaire, pour fournir la densité de cellules nécessaire pour un comptage précis.
   5. Retirer 100 μL de cellules et les ajouter dans un tube de 1,5 mL contenant 100 μL de bleu de trypan à 0,4 %. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé. Diluer les cellules à 3 x 10⁴ cellules/mL dans un milieu de culture sans rouge de phénol.
      REMARQUE : Un milieu DMEM dépourvu de rouge de phénol est utilisé parce que l’exposition au rouge de phénol inhibe la perméabilité de la membrane et peut contribuer à l’autofluorescence de fond.
   6. Ensemencer 2,5 mL de la suspension cellulaire (75 000 cellules) par puits dans une plaque à 6 puits contenant une lamelle de couverture de 22 x 22 mm prérecouverte de poly-D-lysine conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
   7. Cultiver les cellules dans un incubateur avec 5% de CO₂ humidifié à 37 °C pendant la nuit pour permettre aux cellules de se fixer à la lame.
   8. Examiner la fixation des cellules sous un microscope inversé avec un objectif 20x. Les cellules doivent être entièrement attachées à la lamelle de couverture avant de continuer.
2. Préparation des solutions de stock
   1. Pour préparer une solution mère de 1 mM (1 000x) de TMRE (MW = 514,96 g/mol) (voir le tableau des matières), dissoudre 1 mg de TMRE dans 1,94 mL de DMSO. Aliquote et conserver à −20 °C à l’abri de la lumière. Évitez les cycles répétés de gel et de dégel.
   2. Pour préparer une solution mère de 50 mM (2 500x) de FCCP (MW = 254,17 g/mol) (découpleur de phosphorylation oxydative mitochondriale), dissoudre 10 mg de FCCP dans 786,9 μL de DMSO. Aliquote et conserver à −20 °C à l’abri de la lumière. Évitez les cycles répétés de gel et de dégel.
   3. REMARQUE : Les solutions mères préparées font partie de la trousse TMRE Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (voir le tableau des matériaux).
3. Établissement de la concentration d’EMRT pour les lignées cellulaires
   1. Préparer une solution TMRE fonctionnelle de 500 nM dans un milieu de culture cellulaire. Protégez la solution de travail de la lumière.
   2. Ajouter l’EMRT aux cellules cultivées sur les lames de couverture dans une plage de concentration moyenne à finale comprise entre 50 et 200 nM. Pour ce faire, aspirez d’abord le milieu de culture et remplacez-le par un milieu de culture contenant de l’EMRT.
   3. Incuber 20 min à 37 °C. Assurez-vous d’échelonner les temps de traitement pour permettre l’imagerie, puisque les cellules sont visualisées en direct.
   4. Lavez les cellules deux fois avec 1x PBS et inversez la lame de couverture sur une lame de microscope étiquetée avec la concentration finale de TMRE.
   5. Imagez immédiatement les cellules vivantes (pic E_x/E_m = 549 nm/575 nm).
      REMARQUE: Imagez immédiatement les échantillons une fois retirés des conditions de culture, car la santé mitochondriale est compromise une fois que les cellules sont retirées du milieu et placées sur une lame de microscope. Comme alternative aux lamelles de couverture, les cellules peuvent être imagées dans des plats à fond de verre.
   6. Capturez les images à l’aide du microscope et du logiciel disponibles.
      REMARQUE : Établir les paramètres d’imagerie par microscopie expérimentale pendant le processus d’optimisation de la concentration de l’EMRT et maintenir les mêmes conditions dans les expériences subséquentes afin d’assurer une comparaison précise des données. Le protocole détaillé utilisait un microscope confocal et un logiciel compatible (voir le tableau des matériaux).
   7. Sélectionnez la concentration optimale d’EMRT, qui dépend de la lignée cellulaire.
      REMARQUE: La concentration TMRE qui fournit le meilleur signal pour résoudre les changements dans les niveaux TMRE mitochondriaux est généralement la concentration TMRE la plus faible, ce qui donne un signal de fluorescence uniforme et facilement détectable.
4. Test de l’état polarisé d’une cellule
   1. Préparation du dosage
      1. Préparer les solutions mères de traitement aux concentrations souhaitées et préparer les milieux avec la concentration finale du composé à doser. Pour FCCP, la solution mère doit être de 20 mM (préparée avec du DMSO à partir d’une solution mère de 50 mM).
      2. En travaillant sur une seule lamelle de couverture à la fois, ajouter 1,8 mL de milieu plus le composé d’essai aux cellules.
      3. Incuber les cellules avec la substance d’essai à 37 °C et 5% de CO₂ dans un environnement humidifié pendant la période désirée.
         REMARQUE: Les temps de traitement varient en fonction du mécanisme par lequel le composé d’essai peut modifier le potentiel de la membrane mitochondriale. Les protonophores puissants comme le FCCP qui dépolarisent rapidement et directement les potentiels de la membrane mitochondriale nécessitent une analyse peu de temps après le traitement (en quelques minutes). En revanche, les effets du traitement avec des composés qui ont un impact indirect sur la fonction de la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux, tels que ceux qui modifient l’activation ou le renouvellement des protéines ou nécessitent la synthèse des protéines, peuvent prendre plus de temps pour montrer un effet.
      4. Pendant l’incubation, allumez le microscope et réglez-le sur les paramètres d’imagerie optimaux prédéterminés, y compris en termes de gain, d’intensité laser, de taux de capture d’image, de moyenne et de temps d’exposition.
      5. Après la période de traitement médicamenteux, ajouter 200 μL de TMRE 10x (concentration optimale déterminée ci-dessus) aux cellules témoins et traitées par le médicament.
      6. Incuber pendant 15-30 min à 37 °C dans 5% CO₂ dans un environnement humidifié. Aspirez doucement le milieu et rincez les cellules une fois avec 1x PBS.
      7. Répétez l’étape de rinçage 1x PBS pour éviter le bruit de fond causé par le milieu de culture cellulaire ou les composés de traitement, et inversez la lame de couverture sur une lame de microscope étiquetée avec les conditions de traitement.
      8. Image les cellules vivent à E_x/E_m = 549 nm/575 nm. À l’aide d’un microscope confocal, collectez plusieurs champs z-stack avec capture d’image à grande vitesse (512 pixels x 512 pixels, moyenne = 4) avant la perte d’intégrité de la cellule.
      9. Enregistrez et stockez le fichier image pour analyse. La procédure est répétée pour la condition expérimentale suivante.
   2. Contrôles expérimentaux
      1. Utiliser un témoin sans traitement (négatif), effectué comme indiqué ci-dessus (étapes 3.1.1-3.1.8), dépourvu de la substance d’essai dans le milieu.
      2. Utiliser un contrôle positif de perturbation potentielle de la membrane mitochondriale constitué du composé protonophore FCCP. Ajouter 1,8 mL de 20 μM de FCCP (voir le tableau des matières) dans le milieu aux cellules. Comme décrit ci-dessus (étapes 3.1.1-3.1.2; et imagerie cellulaire, comme indiqué aux étapes 3.1.3-3.1.8), incuber pendant 10 minutes à 37 °C dans 5 % de CO₂ dans un environnement humidifié avant la coloration par TMRE.
         NOTE: Des contrôles positifs et négatifs sont requis pour ces expériences.
   3. Quantification
      1. Mesurez les intensités de pixels capturées de cellules individuelles à partir d’une seule image représentative de la région centrale de chaque pile z. Dans ce travail, un seul plan d’intérêt a été choisi pour faciliter l’analyse.
      2. Analysez les intensités de pixels d’au moins 30 cellules (dans leur intégralité) par traitement. Utilisez Excel ou Prism pour faire la moyenne des intensités de pixels pour chaque traitement, et présentez-les sous forme de graphique à barres avec l’erreur type de la moyenne.
         REMARQUE: ImageJ peut également être utilisé pour la quantification de la fluorescence. Alternativement, la fluorescence de coloration TMRE peut être quantifiée avec des plates-formes logicielles commerciales.

3. Établissement de la fonction du canal ionique à l’aide de l’électrophysiologie

REMARQUE : La procédure décrite dans cette section décrit l’utilisation d’un essai électrophysiologique automatisé pour dépister les composés d’essai dans une lignée cellulaire cancéreuse (Figure 3).

1. Préparation des cellules
   1. Récoltez des cellules d’une culture saine qui manque de cellules mortes et / ou de prolifération cellulaire. Utilisez soit la solution chimique de détachement de cellules TrypLE, soit un grattoir manuel pour récolter les cellules adhérentes et groupées. Dissocier les cellules qui se développent en amas ou sphères, qui sont particulièrement fréquents parmi les cellules cancéreuses du SNC.
      REMARQUE: Une dissociation douce des cellules aide à maintenir l’intégrité des protéines membranaires essentielles à la conductance ionique.
   2. Centrifuger les cellules à 561 x g pendant 10 min à TA. Jeter le surnageant et suspendre la pastille dans du DMEM (sans rouge de phénol), du HEPES et de la pénicilline/streptomycine avec 20 % de FBS et 4 mM de L-glutamine (voir le tableau des matières) maintenus à 37 °C.
      REMARQUE: Un milieu DMEM dépourvu de rouge de phénol est utilisé car l’exposition au rouge de phénol inhibe la perméabilité de la membrane.
   3. Plaquez les cellules sur une lame de couverture recouverte de poly-L-lysine à faible densité, de sorte qu’il y ait séparation entre les cellules individuelles.
      REMARQUE: Poly-L-lysine est utilisé ici, et non poly-D-lysine, car la poly-L-lysine a de meilleures propriétés de revêtement.
   4. Incuber les cellules à 37 °C et 5% de CO₂ dans une chambre humidifiée pendant 12 h à 24 h (un temps optimal devra être établi) avant de procéder à un enregistrement.
2. Enregistrement électrophysiologique
   1. Retirez le support des lamelles de couverture. Lavez doucement les cellules deux fois avec 1x PBS. Ajouter ~300 μL de solution de TrypLE. À l’aide de la pipette, montez ou descendez doucement quatre à cinq fois jusqu’à ce que les cellules se détachent.
   2. Ajouter un milieu sans sérum (DMEM) (sans phénol rouge) et maintenir un nombre final de cellules par volume d’au moins 1 million de cellules/mL. À l’aide d’une pipette de 1 mL, désencombrer les cellules pour obtenir une suspension cellulaire dépourvue d’amas cellulaires.
   3. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1 mL. Incuber les cellules à 4 °C pendant 10 min pour stabiliser la membrane cellulaire. Gardez les cellules en rotation sur un agitateur (cycle doux) pour éviter la formation d’amas cellulaires.
   4. Préparez la configuration de Port-a-Patch (voir le tableau des matériaux). Allumez l’ordinateur, l’amplificateur et le système de perfusion. Ouvrez le logiciel Patch-Master et créez un nouveau fichier.
   5. Apportez les tampons (extracellulaires et internes) à RT, puis chargez les tampons dans les tubes de perfusion respectifs.
      NOTE: Les enregistrements du récepteur GABA_A nécessitent à la fois une « solution extracellulaire (bain) » contenant 161 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,5 mM CaCl 2, 10 mM HEPES et 6 mM D-glucose (pH ajusté à 7,4 à l’aide de NaOH) et une « solution interne » contenant 120 mM KCl, 2 mM MgCl ₂, 10 mM EGTA, et 10 mM HEPES (pH ajusté à 7,2 à l’aide de NaOH).
   6. Remplissez le fond d’une puce d’électrode (fournie par le fabricant) avec 5 μL de solution interne et placez la puce d’électrode sur le dessus Faraday du Port-a-Patch. Ajoutez 10 μL de solution externe à la puce et observez l’impulsion rectangulaire sur l’oscilloscope à l’aide du logiciel Patch-Master (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE: La résistance peut être comprise entre 2 et 3 MΩ, mais cela dépend de la lignée cellulaire.
   7. Commencez l’enregistrement une fois que l’impulsion rectangulaire est visible, après les réglages électroniques initiaux et après que le logiciel invite l’utilisateur à ajouter des cellules.
   8. Ajoutez doucement 20 μL de suspension unicellulaire sur la partie centrale de l’électrode et attendez le patch cellulaire suivi d’un joint Giga-Ohm en observant les valeurs de résistance dans le logiciel.
   9. La progression en direct du patching cellulaire peut être observée dans la colonne de gauche du logiciel. Une fois que la cellule est « maintenue en mode cellule entière », commencez les enregistrements en ouvrant un protocole dans le logiciel.
   10. Fixer le potentiel de rétention à −80 mV. Exécutez un protocole d’enregistrement continu sans interruption à l’aide du logiciel Patch-Master pour enregistrer le courant de la cellule.
   11. Obtenez une base de référence stable et passez à un ligand et à une application composée respective pour une durée spécifiée en utilisant l’onglet de perfusion automatisée sur le panneau gauche du logiciel.
   12. Acquérir des données à l’aide du logiciel Patch-Master.
       REMARQUE: Les données sont filtrées passe-bas à 1 kHz et numérisées à 100 kHz.
   13. Effectuer l’analyse des données en calculant l’amplitude maximale de la réponse actuelle à l’aide du logiciel Nest-o-Patch (voir le tableau des matériaux).

4. Puissance in vitro

REMARQUE: Cette procédure détaille un test MTS pour déterminer la puissance du médicament. Le test de prolifération cellulaire à solution unique combine tous les réactifs de dosage requis en une solution préparée qui peut être ajoutée en une seule étape aux puits de culture cellulaire pour évaluer la viabilité et la prolifération cellulaires après traitement avec des composés expérimentaux. Le réactif est reconstitué conformément aux recommandations du fabricant (voir le tableau des matériaux), aliquote et stocké à −20 °C. La section décrit l’utilisation de l’essai pour déterminer la CI₅₀ des composés d’essai dans une lignée cellulaire particulière (figure 4). Ce réactif MTS peut également être utilisé pour le criblage à haut débit d’un grand nombre de composés à des concentrations connues.

1. Préparation des cellules
   REMARQUE: Le nombre de cellules dépend de la croissance et du métabolisme de chaque lignée cellulaire individuelle. Déterminer expérimentalement le nombre optimal de cellules avant d’utiliser le test pour évaluer tout traitement expérimental.
   1. Récolter les cellules adhérentes de la culture par trypsinisation et utiliser l’Accutase (voir le tableau des matériaux) pour dissocier les cellules qui se développent en touffes ou en sphères.
      REMARQUE: Le glioblastome et les lignées cellulaires de médulloblastome primaire nécessitent souvent Accutase car ils ont tendance à se développer en touffes ou en sphères.
   2. Comptez les cellules et fabriquez une solution cellulaire avec 10 000 cellules par puits dans un volume de 75 μL. Effectuer des dilutions du stock pour les numéros de cellules à tester. Préparer au moins 1 mL par dilution.
   3. Plaque 75 μL de chaque dilution dans des ensembles de cinq puits consécutifs dans une plaque de 96 puits. Incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant une nuit dans un environnement humidifié (c.-à-d. un incubateur).
      REMARQUE: Les lignées cellulaires à croissance ou métabolisme lent (qui acidifient leur milieu de croissance en plus de 3 jours) peuvent nécessiter plus de 10 000 cellules comme la plage de nombre de cellules supérieures, tandis que les lignées cellulaires qui se développent rapidement (généralement plus de 20 heures de temps de doublement) nécessitent moins de cellules. Les lignées cellulaires avec un métabolisme élevé peuvent nécessiter moins de 1 000 cellules par puits. La gamme cellulaire peut être ajustée pour déterminer la densité de placage optimale pour le test MTS pour ces lignées cellulaires.
2. Contrôle de traitement simulé
   1. Ajouter 25 μL de milieu par puits pour simuler l’ajout de la substance d’essai dans le test MTS.
      REMARQUE: Dans le test MTS réel, 25 μL d’un stock 4x de la concentration de traitement choisie pour le composé d’essai (ici un modulateur du récepteur GABA_A , QH-II-066) seront ajoutés aux cellules pour donner la concentration finale de traitement 1x dans un volume total de 100 μL par puits.
   2. Incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ en milieu humidifié pendant 48 h. Cela simule l’incubation standard en présence d’un médicament.
3. Dosage MTS
   1. Décongeler les aliquotes requises du réactif MTS. Ajouter 20 μL de réactif MTS par puits. Incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ dans un environnement humidifié pendant 1 h.
   2. Centrifuger la plaque (1 350 x g pendant 5 min) à température ambiante pour éliminer les bulles, qui peuvent interférer avec la lecture de l’absorbance.
      REMARQUE: Enlevez toutes les bulles avec une aiguille de calibre fin.
   3. Lire l’absorbance à 490 nm. Enregistrez les données en tant que fichier Excel.
   4. Ramener les plaques à 37 °C dans 5 % de CO₂ et les lire à plusieurs reprises pendant la période linéaire de 4 heures de l’essai.
      REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de recentrifuger avant de lire l’absorbance. Les données des lectures ultérieures, en particulier la lecture de 2 heures, peuvent être importantes pour examiner la vitesse à laquelle une lignée cellulaire métabolise le réactif MTS et sont utiles pour sélectionner le nombre de cellules à la plaque pour le test.
   5. Tracez la densité optique d’absorbance (OD) à 490 nm (OD₄₉₀) par rapport au nombre de cellules plaquées à l’aide d’Excel ou de Prism.
   6. Sélectionnez le numéro de cellule pour le test. Le nombre optimal de cellules sera dans la plage linéaire et en dessous de la saturation (OD₄₉₀ = 1).
      REMARQUE: Pour les cellules à croissance lente, le nombre de cellules le plus élevé plaqué peut être ajusté à 20 000 cellules par puits, et 500 cellules par puits peuvent être exclues du test.
4. Détermination du CI₅₀
   1. Jour 1 : Plaquer les cellules pour le test MTS
      1. Notez le nom de la lignée cellulaire et le numéro de passage de chaque lignée de l’étude. Pour contrer l’évaporation pendant l’essai, remplir au moins les rangées supérieure et inférieure du périmètre extérieur et les colonnes d’extrémité gauche et droite de la plaque de 96 puits avec 1x PBS, 100 μL par puits, pour contrer l’évaporation pendant l’essai.
      2. Plaquer le nombre optimal de cellules pour chaque lignée cellulaire tel que déterminé avant le début de l’essai. Plaquer les cellules dans 75 μL par puits de milieu sans phénol rouge et sans antibiotique qui ne contient pas de tampon HEPES. Le FBS peut être augmenté à 20% pour soutenir la croissance des lignées cellulaires.
         NOTE: Un milieu dépourvu de rouge de phénol est utilisé parce que l’exposition au rouge de phénol inhibe la perméabilité de la membrane.
      3. Plaquer l’échantillon en quintuplicat au moins pour la concentration du traitement. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre manuel ou automatisé.
         NOTE: Pour utiliser un hémocytomètre manuel, (1) préparer une dilution 1:1 des cellules remises en suspension dans un milieu dans du bleu de trypan; (2) incuber 5-15 min, selon la lignée cellulaire; (3) charger 10 μL des cellules dans le bleu de trypan dans la chambre de comptage de l’hémocytomètre; 4° compter les cellules viables dans les carrés des quatre coins et du milieu et déterminer le nombre moyen de cellules par carré; 5° calculer les cellules viables par millilitre comme suit:
         Cellules viables par mL = Cellules viables moyennes × 2 (facteur de dilution) × 10⁴
      4. Utiliser un volume suffisant pour préparer la concentration désirée de cellules dans un milieu sans rouge de phénol et sans antibiotique qui ne contient pas de tampon HEPES (c.-à-d. 75 μL par puits x 60 puits par plaque = 4,5 mL de cellules par plaque).
         REMARQUE: Chaque plaque doit avoir une commande moyenne uniquement pour la soustraction d’arrière-plan. Le contrôle du milieu peut remplacer les puits PBS si nécessaire.
   2. Jour 2: Ajout du composé de traitement
      1. Préparer les traitements expérimentaux à 4x la concentration finale souhaitée pour donner la concentration finale souhaitée lorsque 25 μL de solutions de traitement sont ajoutés aux cellules plaquées dans 75 μL de milieu (= 100 μL de volume total par puits).
      2. Préparer les solutions d’essai (dans ce cas, le modulateur des récepteurs du GABA_A QH-II-066) par dilution en série des stocks les plus concentrés. Par exemple, si les concentrations finales du médicament doivent être de 5,0 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 0,625 μM et 0,3125 μM, préparer des dilutions en série 1:1 commençant par 20 μM pour obtenir des concentrations de 10 μM, 5 μM, 2,5 μM et 1,25 μM, respectivement.
         REMARQUE : Chaque plaque nécessite deux témoins à base de cellules en plus du témoin du milieu seul : cellules non traitées (milieu seul) et cellules traitées au solvant (souvent du DMSO) à une concentration connue. Il est recommandé de s’assurer que le véhicule n’affecte pas la prolifération cellulaire dans la plage active du composé.
      3. Une fois la substance d’essai ajoutée, incuber les cellules à 37 °C et 5% de CO₂ dans un environnement humidifié pendant 48 h.
   3. Jour 3 : Réalisation du test de prolifération cellulaire (MTS)
      1. Calculer le volume de réactif MTS nécessaire (20 μL par 100 μL de culture d’essai) et décongeler le volume requis de réactif MTS aliquote (voir le tableau des matériaux).
      2. Vortex, et s’assurer que le réactif est complètement en solution avant utilisation. Introduire le réactif décongelé dans un réservoir de réactif stérile de 25 mL.
      3. Piper 20 μL de réactif MTS (à l’aide d’une pipette multicanal) dans chaque puits de la plaque de 96 puits contenant des échantillons dans 100 μL de milieu de culture.
      4. Incuber la plaque à 37 °C et 5% de CO₂ dans un environnement humidifié pendant 1 h à 4 h. Les plaques peuvent être lues à plusieurs moments. Généralement, les plaques sont lues à 1 h et à 2 h ou 3 h.
      5. Les bulles dans le milieu peuvent conduire à des résultats erronés. Avant de lire dans le lecteur de plaques, faites tourner la plaque à 1 350 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Une aiguille ou une pointe de pipette peut être utilisée pour éliminer les bulles qui restent après la centrifugation.
      6. Mesurer l’absorbance à 490 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques ou d’un spectrophotomètre approprié (voir le tableau des matériaux).
      7. Enregistrez les données en tant que fichier Excel.
         NOTE: Le temps d’incubation en présence du composé d’essai variera en fonction du taux de métabolisme et de la croissance de la lignée cellulaire à l’étude, en plus du composé testé. Une période d’incubation de 48 h est un bon point de départ pour la plupart des lignées cellulaires et des composés d’essai.
5. Analyse des données
   1. Transférez les données dans un fichier Excel et organisez les données pour chaque répétition en augmentant la concentration du composé d’essai. Faites la moyenne de la valeur de contrôle du milieu seulement et soustrayez cette valeur des données expérimentales.
   2. Déterminer le pourcentage de prolifération cellulaire dans les puits de traitement par rapport aux puits de véhicule (ou aux puits témoins traités au solvant) en réglant le contrôle sur 100 % de prolifération pour chaque répétition.
   3. Transférez les données générées dans Excel dans un programme de votre choix. Les auteurs utilisent généralement le logiciel Prism (voir le tableau des matériaux) pour déterminer la concentration de médicament qui inhibe la prolifération cellulaire de 50 % (IC₅₀).
   4. Dans le logiciel Prism, créez une table de données avec la colonne X comme numéro de cellule et la colonne Y comme DO moyenne pour cinq valeurs de réplication dans des sous-colonnes côte à côte.
   5. Entrez les valeurs de concentration du traitement dans la colonne X lors de l’analyse d’un traitement médicamenteux. Étiqueter l’axe des x avec le nom du composé de traitement et les unités de concentration.
   6. Entrez les valeurs calculées de viabilité des cellules répliquées de l’analyse Excel dans les sous-colonnes Y. Étiquetez l’axe des y comme prolifération cellulaire (%).
   7. À l’aide de l’outil d’analyse, sélectionnez Régression non linéaire (ajustement de la courbe) sous Analyses XY.
   8. Sélectionnez la dose-réponse [inhibition] par rapport à la réponse normalisée - pente variable.
   9. Exécutez la fonction d’analyse. Consultez le tableau des résultats pour voir les valeurs calculées du meilleur ajustement pour IC₅₀ et le graphique d’ajustement de la courbe. L’axe des x du graphique peut être remplacé par une échelle logarithmique si vous le souhaitez.

Ci-dessus sont des procédures sélectionnées qui peuvent être utilisées pour caractériser les canaux ioniques dans les cellules cancéreuses. Le premier protocole met en évidence la coloration d’un canal ionique. Comme détaillé, il existe de nombreux défis lors de la coloration d’un canal ionique ou, d’ailleurs, de toute protéine présente dans la membrane extracellulaire. La figure 1 montre la coloration d’une sous-unité du récepteur pentamère GABAA. Le deuxième protocole met en évidence les résultats des tests de l’état polarisé des mitochondries dans les cellules cancéreuses. Les mitochondries jouent un rôle essentiel pour la viabilité et la prolifération cellulaires, ainsi que pour la mort cellulaire. Dans les cellules de mammifères, les mitochondries activent l’apoptose en réponse au stress cellulaire par la libération des protéines de la famille Bcl-2 situées entre les membranes interne et externe mitochondriales. Dans le cytosol, les protéines de la famille Bcl-2 activent les caspases protéases, qui interviennent dans la mort cellulaire programmée. Les altérations de la fonction des canaux ioniques de la membrane plasmique peuvent entraîner une perturbation de l’homéostasie ionique intracellulaire, y compris en termes de niveaux d’ions dans les mitochondries, ce qui peut entraîner une perte de potentiel membranaire, déclenchant ainsi l’apoptose14. Les niveaux de Ca2+, K +, Na+ et H+ sont des déterminants importants dans les événements de signalisation qui peuvent déclencher la mort cellulaire initiée par les mitochondries. La figure 2 montre la coloration avec le colorant TMRE chargé positivement perméable aux cellules pour marquer et imager le potentiel membranaire dans les mitochondries actives, qui maintiennent une charge négative21,22. TMRE est un colorant rouge-orange qui se lie aux mitochondries actives en raison de leur charge négative relative. Les mitochondries dépolarisées ou inactives ont un potentiel membranaire réduit et, par conséquent, ne parviennent pas à séquestrer l’EMRT. Dans cette expérience, le découpleur ionophore FCCP est un contrôle important, car il dépolarise les membranes mitochondriales, empêchant ainsi l’accumulation de TMRE23. Le troisième protocole met en évidence l’électrophysiologie patch-clamp unicellulaire. La figure 3 montre des enregistrements représentatifs d’une trace enregistrée à partir de la lignée cellulaire de médulloblastome D283 dérivée du patient. Enfin, le quatrième protocole met en évidence un test permettant de déterminer l’état de prolifération des cellules cancéreuses. La figure 4 présente des détails sur le fonctionnement du test MTS et une illustration de la plaque et de la lecture lorsqu’elle est incubée avec un agent qui nuit à la viabilité des cellules cancéreuses à l’étude (dans ce cas, DAOY).

Figure 1 : Coloration des cellules pour les canaux ioniques. (A) Coloration de la protéine Gabra5, une sous-unité du récepteur GABA A, dans les cellules cancéreuses du médulloblastome D283. (B) Cellules fixes traitées avec la coloration fluorescente 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), qui se lie à l’ADN. (C) Fusion de cellules cancéreuses du médulloblastome colorées pour Gabra5 et DAPI. Barres d’échelle = 10 μm. La figure est adaptée de Kallay et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Test de l’état polarisé des mitochondries. (A) Les cellules cancéreuses vivantes du médulloblastome D283 sont traitées avec des concentrations croissantes du médicament QH-II-066. Les cellules sont ensuite traitées avec une TMRE (tétraméthylrhodamine, ester éthylique) chargée positivement et perméable aux cellules, qui s’accumule dans les mitochondries actives (chargées négativement). Les mitochondries dépolarisées ou inactives ont un potentiel membranaire réduit et, par conséquent, ne parviennent pas à retenir le colorant TMRE; En conséquence, ils montrent un signal de fluorescence faible. Image par microscopie à fluorescence; FCCP (cyanure de carbonyle 4-[trifluorométhoxy]phénylhydrazone). Crête: λex, 549 nm; λem, 575 nm. Barres d’échelle = 10 μm. (B) Quantification de la coloration TMRE (images montrées dans le panneau A) à l’aide de la plate-forme logicielle. Les données sont présentées comme la moyenne et l’erreur-type de la moyenne. La figure est adaptée de Kallay et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Établissement de la fonction du canal ionique à l’aide de l’électrophysiologie. (A) La configuration ou plate-forme Port-a-Patch montrée, composée d’une cage de Faraday (a), d’une chambre d’enregistrement (b) et d’une unité d’aspiration (c, à droite). (B) Vue de dessus de l’engin Port-a-Patch mettant en évidence la chambre d’enregistrement équipée d’une entrée de perfusion (a), d’une sortie (b) et d’une électrode de référence (c). (C) Le Port-a-Patch est relié à un système de perfusion à échange rapide de solutions avec des modes de fonctionnement automatisés et manuels et des réservoirs de solution. (D) Trace de courant représentative provenant d’un enregistrement électrophysiologique patch-clamp à cellules entières à l’aide d’une plate-forme Port-a-Patch (Nanion) et de cellules cancéreuses de médulloblastome D283. Le GABA (10 μM) a été appliqué pendant 5 s avec un potentiel de rétention de −80 mV. (E) Trace de courant représentative d’un enregistrement électrophysiologique à pince patch-clamp à cellules entières à l’aide d’une plate-forme Port-a-Patch (Nanion) et de cellules cancéreuses du médulloblastome D283 avec la co-application de GABA (1 μM) et de l’agoniste du récepteur GABAA (anesthésie générale) propofol (50 μM), qui potentialise le courant induit par le GABA seul. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Dosage MTS pour évaluer la puissance du médicament. (A) Réactions chimiques sous-jacentes au « test MTS » utilisé pour évaluer la puissance d’un agent, telle qu’elle se traduit par une réduction de la prolifération cellulaire. Réduction du tétrazolium MTS par des cellules viables, générant le colorant formazan. (B) Une plaque de 96 puits montrant les résultats colorimétriques d’un essai MTS avec des concentrations croissantes de médicaments. Dans cette expérience, les cellules cancéreuses du médulloblastome DAOY sont traitées avec des concentrations croissantes d’un médicament préclinique, KRM-II-08, un modulateur allostérique positif du récepteur GABAA. (C) Une courbe dose-réponse générée avec le test MTS (à partir de la quantification de la plaque à 96 puits). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Comparaison des configurations électrophysiologiques manuelles et semi-automatisées et/ou entièrement automatisées.

D.A.P.K. est cofondateur, président et chef de la direction d’Amlal Pharmaceuticals Inc. S.S. est cofondateur d’Amlal Pharmaceuticals Inc. et siège au conseil de surveillance de l’innocuité des médicaments de Bexion Pharmaceuticals, Inc.