Profilage génétique et criblage de décrochage à l’échelle du génome pour identifier des cibles thérapeutiques dans des modèles murins de tumeur maligne de la gaine nerveuse périphérique

Summary

Nous avons développé une approche d’oncogénomique comparative inter-espèces utilisant des analyses génomiques et des criblages génomiques fonctionnels pour identifier et comparer des cibles thérapeutiques dans les tumeurs apparaissant dans des modèles murins génétiquement modifiés et le type de tumeur humaine correspondant.

Abstract

Les tumeurs malignes de la gaine des nerfs périphériques (MPNST) sont dérivées de cellules de Schwann ou de leurs précurseurs. Chez les patients atteints du syndrome de susceptibilité tumorale neurofibromatose de type 1 (NF1), les MPNST sont la tumeur maligne la plus fréquente et la principale cause de décès. Ces sarcomes des tissus mous, rares et agressifs, offrent un avenir radieux, avec des taux de survie sans maladie à 5 ans de 34 à 60 %. Les options de traitement pour les personnes atteintes de MPNST sont décevantes et limitées, la chirurgie défigurante étant la principale option de traitement. De nombreuses thérapies autrefois prometteuses telles que le tipifarnib, un inhibiteur de la signalisation Ras, ont échoué cliniquement. De même, les essais cliniques de phase II avec l’erlotinib, qui cible le facteur de croissance épidermique (EFGR), et le sorafénib, qui cible le récepteur du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), et le Raf, en association avec la chimiothérapie standard, n’ont pas non plus réussi à produire de réponse chez les patients.

Au cours des dernières années, les méthodes de criblage génomique fonctionnel combinées au profilage génétique des lignées cellulaires cancéreuses se sont avérées utiles pour identifier les voies de signalisation cytoplasmique essentielles et le développement de thérapies spécifiques à la cible. Dans le cas des types de tumeurs rares, une variante de cette approche connue sous le nom d’oncogénomique comparative inter-espèces est de plus en plus utilisée pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans le cadre de l’oncogénomique comparative inter-espèces, le profilage génétique et la génomique fonctionnelle sont effectués dans des modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) et les résultats sont ensuite validés dans les rares spécimens humains et lignées cellulaires disponibles.

Cet article décrit comment identifier les mutations des gènes moteurs candidats dans les cellules MPNST humaines et murines à l’aide du séquençage de l’exome entier (WES). Nous décrivons ensuite comment effectuer des criblages d’ARNsh à l’échelle du génome pour identifier et comparer les voies de signalisation critiques dans les cellules MPNST de souris et humaines et identifier des cibles médicamenteuses dans ces voies. Ces méthodologies fournissent une approche efficace pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans une variété de types de cancer humain.

Introduction

Les tumeurs malignes de la gaine des nerfs périphériques (MPNST) sont des néoplasmes fusiformes très agressifs qui surviennent en association avec le syndrome de susceptibilité tumorale neurofibromatose de type 1 (NF1), sporadiquement dans la population générale et aux sites de radiothérapie antérieure ^1,2,3. Les patients atteints de NF1 naissent avec une copie de type sauvage du gène suppresseur de tumeur NF1 et un deuxième allèle NF1 avec une mutation de perte de fonction. Cet état d’haploinsuffisance rend les patients atteints de NF1 sensibles à une deux....

Protocol

Avant le début des études, faire examiner et approuver les procédures et les protocoles de manipulation des vecteurs viraux sur les animaux par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) et le Comité de biosécurité institutionnel (IBC). Les procédures décrites ici ont été approuvées par les conseils d’administration de l’IACUC et de l’IBC de l’Université médicale de Caroline du Sud et ont été effectuées par un personnel correctement formé conformément au Guide des NIH pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire et aux directives institutionnelles de MUSC en matière de soins aux animaux.

....

Results

Les graphiques de la figure 5 montrent les scores d’appauvrissement des gènes essentiels de base (CEG) étiquetés comme VRAI par rapport aux non-CEG (étiquetés comme FAUX) dans chaque lignée cellulaire humaine qui a été criblée. Les points représentent log2 des scores d’épuisement des plis pour les gènes individuels, qui sont tracés sur une représentation en boîte à moustaches de la distribution globale des scores. Le test t de Student a été utilisé pour tester une différence signifi.......

Discussion

Les méthodes détaillées présentées ici ont été développées pour étudier la néoplasie du système nerveux périphérique et la pathogenèse MPNST. Bien que nous ayons trouvé ces méthodes efficaces, il faut reconnaître qu’il existe certaines limites potentielles aux méthodes que nous décrivons ici. Ci-dessous, nous discutons de certaines de ces limitations et des stratégies potentielles pour les surmonter dans d’autres systèmes de modèles.

Nous avons constaté que le séquençage de l’exome entier iden.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Système de sonication bioruptor	Diagenode  ;	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Cytomètre d’image Celigo	Nexcelom	N/A
Cellecta Analyseur de codes-barres et logiciel
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96 puits Microplaque noire	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml tubes coniques	Diagenode  ;
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Tampon d’élution	Qiagen  ;	19086
Éthanol (200 proof)	Decon Laboratories	2716
Excel  ;	Microsoft  ;
FWDGEX 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3'
FWDHTS 5'-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3'
GexSeqS (5' AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3'			HPLC purifié
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldéhyde (4 %)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Réactif de transfection	Thermo Scientific	11514015
Réactif de transfection en polybrène	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Quick PCR Kit de purification	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen  ;	19051
Qiagen Kit d’Extraction de Gel	Qiagen	28704
RevGEX 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3'
RevHTS1 5'-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3'
Titane Taq polymérase	Clontech	639210
Trimmomatic software		www.usadellab.org