Une méthode améliorée pour isoler les sites de contact mitochondrial

Les mitochondries remplissent une variété de fonctions différentes chez les eucaryotes, la plus connue étant la production d’ATP par phosphorylation oxydative. D’autres fonctions incluent la production d’amas fer-soufre, la synthèse des lipides et, chez les eucaryotes supérieurs, la signalisation Ca²⁺ et l’induction de l’apoptose 1,2,3,4. Ces fonctions sont indissociablement liées à leur ultrastructure complexe.

L’ultrastructure mitochondriale a été décrite pour la première fois par microscopie électronique⁵. Il a été montré que les mitochondries sont des organites assez complexes constitués de deux membranes : la membrane externe mitochondriale et la membrane interne mitochondriale. Ainsi, deux compartiments aqueux sont formés par ces membranes : l’espace intermembranaire et la matrice. La membrane interne mitochondriale peut être encore plus divisée en différentes sections. La membrane limite interne reste à proximité de la membrane externe et les crêtes forment des invaginations. Ce que l’on appelle des jonctions de crêtes relient la membrane limite interne et les crêtes (Figure 1). De plus, les micrographies électroniques de mitochondries osmotiquement rétrécies révèlent qu’il existe des sites où les membranes mitochondriales sont étroitement connectées ^6,7. Ces sites dits de contact sont formés par des complexes protéiques qui s’étendent sur les deux membranes (Figure 1). On pense que ces sites d’interaction sont essentiels à la viabilité cellulaire en raison de leur importance pour la régulation de la dynamique et de l’hérédité mitochondriales, ainsi que pour le transfert de métabolites et de signaux entre le cytosol et la matrice⁸.

Le complexe MICOS dans la membrane interne mitochondriale est probablement le complexe de formation de site de contact le mieux caractérisé et le plus polyvalent. MICOS a été décrit dans la levure en 2011 et se compose de six sous-unités 9,10,1 ¹ : Mic60, Mic27, Mic26, Mic19^, Mic12 et ^Mic10. Ceux-ci forment un complexe d’environ 1,5 MDa qui se localise aux jonctions^de crista 9,10,11. La délétion de l’une ou l’autre des sous-unités centrales, Mic10 ou Mic60, conduit à l’absence de ce complexe ^9,11, ce qui signifie que ces deux sous-unités sont essentielles à la stabilité de MICOS. Il est intéressant de noter que MICOS forme non pas un, mais plusieurs sites de contact avec diverses protéines et complexes de la membrane externe mitochondriale : le complexe TOM 11,12, le complexe TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, le complexe Fzo1-Ugo1⁹,^Por1 10^, OM45 10 et Miro ¹⁷. Cela indique fortement que le complexe MICOS est impliqué dans divers processus mitochondriaux, tels que l’importation de protéines, le métabolisme des phospholipides et la génération de l’ultrastructure mitochondriale¹⁸. Cette dernière fonction est probablement la fonction majeure de MICOS, car l’absence du complexe MICOS induite par la délétion de MIC10 ou MIC60 conduit à une ultrastructure mitochondriale anormale qui est pratiquement complètement dépourvue de crêtes régulières. Au lieu de cela, les vésicules membranaires internes sans connexion à la membrane limite interne s’accumulent^{19, 20}. Il est important de noter que MICOS est conservé dans sa forme et sa fonction de la levure à l’homme²¹. L’association de mutations dans les sous-unités MICOS avec des maladies humaines graves souligne également son importance pour les eucaryotes supérieurs^22,23. Bien que MICOS soit très polyvalent, il doit exister d’autres sites de contact (sur la base de nos observations non publiées). En effet, plusieurs autres sites de contact ont été identifiés, par exemple, les machineries de fusion mitochondriale Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 ou encore Mdm31-Por1^, qui est impliquée dans la biosynthèse du phospholipide spécifique mitochondrial, cardiolipine ²⁷. Récemment, nous avons amélioré la méthode qui nous a conduits à l’identification de MICOS pour identifier Cqd1 dans le cadre d’un nouveau site de contact formé avec le complexe membranaire externe Por1-Om14²⁸. Il est intéressant de noter que ce site de contact semble également être impliqué dans de multiples processus tels que l’homéostasie de la membrane mitochondriale, le métabolisme des phospholipides et la distribution de la coenzyme Q^28,29.

Ici, nous avons utilisé une variante du fractionnement des mitochondries 9,30,31,32,33 décrit précédemment. Le traitement osmotique des mitochondries conduit à la perturbation de la membrane externe mitochondriale et à un rétrécissement de l’espace matriciel, ne laissant les deux membranes qu’à proximité sur les sites de contact. Cela permet de générer des vésicules qui se composent exclusivement de la membrane externe mitochondriale ou de la membrane interne mitochondriale ou des sites de contact contenus des deux membranes par sonication douce. En raison de la membrane interne mitochondriale possédant un rapport protéines/lipides beaucoup plus élevé, les vésicules de la membrane interne mitochondriale présentent une densité plus élevée que les vésicules de la membrane externe mitochondriale. La différence de densité peut être utilisée pour séparer les vésicules membranaires par centrifugation à gradient de densité flottante de saccharose. Ainsi, les vésicules de la membrane externe mitochondriale s’accumulent à de faibles concentrations de saccharose, tandis que les vésicules de la membrane interne mitochondriale sont enrichies à des concentrations élevées de saccharose. Les vésicules contenant des sites de contact se concentrent à des concentrations intermédiaires de saccharose (figure 2). Le protocole suivant décrit en détail cette méthode améliorée, qui nécessite moins d’équipement spécialisé, de temps et d’énergie par rapport à notre méthode précédemment établie³², et fournit un outil utile pour l’identification d’éventuelles protéines du site de contact.

1. Tampons et solutions mères

1. Préparez une solution d’acide 3-morpholinopropane-1-sulfonique (MOPS) de 1 M dans de l’eau déminéralisée, pH 7,4. Conserver à 4 °C.
2. Préparer 500 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans de l’eau déminéralisée, pH 8,0. Conserver à température ambiante.
3. Préparez 2,4 M de sorbitol dans de l’eau déminéralisée. Conserver à température ambiante après l’autoclavage.
4. Préparer 2,5 M de saccharose dans de l’eau déminéralisée. Conserver à température ambiante après l’autoclavage.
5. Préparer 200 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) dans de l’isopropanol. Conserver à −20 °C.
   ATTENTION : Le PMSF est toxique en cas d’ingestion et provoque de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. Ne respirez pas la poussière et portez des gants et des lunettes de protection.
6. Préparez de l’acide trichloracétique (TCA) à 72 % dans de l’eau déminéralisée. Conserver à 4 °C.
   ATTENTION : Le TCA peut provoquer une irritation des voies respiratoires, de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. Ne respirez pas la poussière et portez des gants et des lunettes de protection.
7. Préparer le tampon SM : 20 mM MOPS et 0,6 M de sorbitol, pH 7,4.
8. Préparez le tampon gonflant : 20 mM de MOPS, 0,5 mM d’EDTA, 1 mM de PMSF et un cocktail d’inhibiteurs de protéase, pH 7,4.
9. Préparez les tampons de gradient de saccharose : 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M et 1,3 M de saccharose dans 20 mM de MOPS, et 0,5 mM d’EDTA, pH 7,4.
   REMARQUE : Tous les tampons peuvent être stockés à 4 °C ; cependant, il est recommandé de stocker les tampons contenant du saccharose à −20 °C pour éviter la croissance fongique. Les inhibiteurs de protéase doivent être ajoutés fraîchement avant utilisation.

2. Génération de vésicules soumissionnochondriales

1. Isolez les mitochondries de levure brutes fraîchement selon les protocoles établis^34,35.
   NOTE : Pour cette expérience, des mitochondries ont été isolées de Saccharomyces cerevisiae. La génération de mitochondries pures à gradient dépourvues d’autres organites n’est pas nécessaire.
2. Remettre en suspension 10 mg de mitochondries fraîchement isolées dans 1,6 mL de tampon SM (4 °C) par pipetage (Figure 2, étape 1).
3. Transvaser la suspension mitochondriale dans un erlenmeyer pré-refroidi de 100 ml.
4. Ajouter lentement 16 mL de tampon gonflant à l’aide d’une pipette en verre de 20 mL. Appliquez en remuant doucement et constamment sur la glace pendant l’ajout. Ce traitement osmotique entraîne l’absorption d’eau dans l’espace matriciel. Le gonflement de la membrane interne mitochondriale va perturber la membrane externe. Cependant, les deux membranes resteront en contact aux sites de contact⁹ (Figure 2, étape 2).
5. Incuber les échantillons en remuant doucement et constamment pendant 30 minutes sur de la glace.
6. Ajouter lentement 5 mL de solution de saccharose à 2,5 M à l’aide d’une pipette en verre de 5 mL pour augmenter la concentration de saccharose dans les échantillons à environ 0,55 M. Ce traitement osmotique se traduit par un efflux d’eau de la matrice³⁶. Le retrait de la membrane interne est destiné à maximiser sa distance par rapport aux fragments résiduels de la membrane externe. Cela diminue la probabilité de générer des vésicules hybrides artificielles de membranes internes et externes par sonication (Figure 2, étape 3).
7. Incuber les échantillons en remuant doucement pendant 15 min sur de la glace.
8. Soumettre les mitochondries à une sonication pour générer des vésicules membranaires soumisesochondriales (Figure 2, étape 4).
   1. Transférez la suspension mitochondriale dans une cellule de rosette pré-refroidie.
   2. Soniser la suspension mitochondriale à une amplitude de 10 % pendant 30 s tout en refroidissant la cellule de la rosette dans un bain de glace.
   3. Reposer la suspension pendant 30 s dans un bain de glace.
   4. Répétez les étapes 2.8.2 et 2.8.3 trois fois de plus.
      REMARQUE : Les conditions de sonication varient en fonction du sonicateur utilisé. L’optimisation sera nécessaire pour les machines individuelles. Une sonication trop dure conduira à la formation artificielle de vésicules constituées de membranes internes et externes mitochondriales.

3. Séparation des vésicules soumissionnochondriales

1. Séparez les vésicules générées des mitochondries intactes restantes par centrifugation à 20 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Les mitochondries intactes se granuleront tandis que les vésicules resteront dans le surnageant.
2. Concentrez le mélange de vésicules.
   1. Transférez le surnageant dans des tubes d’ultracentrifugation neufs.
   2. Charger un coussin de 0,3 mL de solution de saccharose 2,5 M au fond du tube à l’aide d’une seringue de 1 mL munie d’une canule de 0,8 mm x 120 mm.
   3. Centrifuger à 118 000 x g pendant 100 min à 4 °C.
      REMARQUE : Ici, un rotor à godets oscillants d’un rayon maximal de 153,1 mm a été utilisé. Les conditions de centrifugation dépendent fortement du rotor et devront être adaptées lors de l’utilisation d’un autre rotor.
3. Les vésicules apparaîtront sous la forme d’un disque sur le dessus du coussin de saccharose après la centrifugation. Jeter environ 90 % du surnageant. Maintenant, récoltez les vésicules concentrées en les remettant en suspension dans le tampon restant, y compris le saccharose de 2,5 M en pipetant de haut en bas. Transférez la suspension dans un homogénéisateur Dounce glacé.
4. Homogénéiser la suspension avec au moins 10 coups à l’aide d’un potier en polytétrafluoroéthylène.
5. Préparez le dégradé de saccharose.
   1. Pour un gradient de pas de 11 mL avec cinq étapes (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M et 0,8 M de saccharose dans 20 mM MOPS et 0,5 mM EDTA, pH 7,4), chaque couche contient 2,2 mL de solution de saccharose.
      REMARQUE : Un réfractomètre est recommandé pour mesurer et ajuster les concentrations de saccharose ; Cependant, ce n’est pas indispensable. Appliquez 10 μL du tampon sur le réfractomètre et détectez les indices de réfraction respectifs. Le calcul de la concentration en saccharose est le suivant :
      
      1,3333 représente l’indice de réfraction de l’eau. 0,048403 est un indice de conversion spécifique du saccharose obtenu à partir de la mise à l’échelle linéaire de la réfraction molaire à la concentration de saccharose dans des solutions aqueuses ³⁷.
   2. Ajoutez la concentration de saccharose la plus élevée dans le tube de centrifugation et placez le tube à −20 °C. Attendez que la couche soit complètement gelée avant d’appliquer la suivante. Procédez ainsi jusqu’à ce que la dernière couche soit ajoutée et stockez les dégradés à −20 °C.
      REMARQUE : N’oubliez pas de transférer les gradients gelés à 4 °C au début de l’expérience pour permettre aux gradients de dégeler. Cela prendra environ 3 h. Pour la centrifugation, un rotor à godets oscillants d’une capacité de 13,2 ml a été utilisé. Lorsqu’un rotor différent est utilisé, les volumes de pas de gradient doivent être adaptés en conséquence.
6. Mesurer la concentration en saccharose des échantillons à l’aide d’un réfractomètre. S’il n’y a pas d’accès à un réfractomètre, on peut également supposer que la concentration de saccharose est de 2 M. Cette concentration supposée de saccharose servira ensuite de base à l’étape suivante.
7. Ajustez la concentration de saccharose à 0,6 M par l’ajout d’une quantité appropriée de 20 mM de MOPS, 0,5 mM d’EDTA, 1 mM de PMSF et d’un cocktail d’inhibiteurs de protéase, pH 7,4. Si la concentration de saccharose est estimée à 2 M au lieu d’être mesurée, il est recommandé de vérifier si la concentration est suffisamment faible après ajustement. Appliquer une petite aliquote de l’échantillon (env. 50 μL) sur 200 μL de saccharose 0,8 M dans un tube à essai. L’échantillon doit rester au-dessus du saccharose de 0,8 M.
8. Chargez les échantillons (environ 1 ml) au-dessus du gradient de saccharose (conservez 10 % pour référence ultérieure). Un pipetage minutieux est important pour éviter de perturber le gradient (Figure 2, étape 5).
9. Séparer les vésicules par centrifugation à 200 000 x g et 4 °C pendant 12 h. Si possible, réglez la centrifugeuse sur une accélération et une décélération lentes pour éviter de perturber le gradient (Figure 2, étape 6).
   REMARQUE : Ici, un rotor à godets oscillants d’un rayon maximal de 153,1 mm a été utilisé. Les conditions de centrifugation dépendent fortement du rotor et devront être adaptées lors de l’utilisation d’un autre rotor.
10. Prélever le gradient de haut en bas par fractions de 700 μL à l’aide d’une pipette de 1 mL. Cela se traduira par 17 fractions, ce qui permet une résolution suffisante.

4. Analyse des vésicules soumissionnochondriales

1. Concentrer les protéines en soumettant chaque fraction à deux précipitations séquentielles de TCA³⁸ pour préparer les échantillons SDS-PAGE.
   1. Ajouter 200 μL de TCA à 72 % aux fractions individuelles et mélanger jusqu’à ce que la solution soit homogène. Incuber les fractions pendant 30 min sur de la glace, et granuler les protéines précipitées par centrifugation à 20 000 x g et 4 °C pendant 20 min. Jeter le surnageant, ajouter 500 μL de solution de TCA à 28 %, bien mélanger et répéter l’étape de centrifugation.
   2. Lavez les granulés avec 1 mL d’acétone (−20 °C) et centrifugez pendant 10 min à 20 000 x g et 4 °C. Jetez le surnageant et laissez les granulés sécher à l’air libre. Remettre les pastilles en suspension dans 60 μL de tampon d’échantillon SDS et incuber les échantillons pendant 5 min à 95 °C.
      REMARQUE : Une grande quantité de saccharose restera, en particulier dans les fractions à haute densité, après les premières précipitations de TCA. Celle-ci sera éliminée par les précipitations supplémentaires de TCA.
2. Analyser 20 μL de chaque fraction par SDS-PAGE³⁹ et immunoblot^40,41,42,43.

Il est relativement facile de séparer les membranes internes et externes des mitochondries. Cependant, la génération et la séparation des vésicules contenant le site de contact sont beaucoup plus difficiles. À notre avis, deux étapes sont critiques et essentielles : les conditions de sonication et le gradient utilisé.

Habituellement, on pense que les dégradés linéaires ont une meilleure résolution que les dégradés par étapes. Cependant, leur production reproductible est fastidieuse et nécessite un équipement spécial. Par conséquent, nous avons établi une méthode pour générer un gradient de pas avec des différences relativement faibles entre les étapes individuelles (voir l’étape 3.5). Nous avons émis l’hypothèse que le gradient de pas serait équilibré lors de la centrifugation, ce qui donnerait un gradient presque linéaire. Il est frappant de constater que la détermination des concentrations de saccharose des différentes fractions après centrifugation à l’aide d’un réfractomètre a révélé que le gradient de pas devenait en effet pratiquement linéaire après 12 h de centrifugation à 200 000 x g (Figure 3).

L’importance d’une sonication douce est évidente dans ces résultats représentatifs. Dans des conditions de sonication modérées (Figure 4A), le marqueur de la membrane externe mitochondriale Tom40 a été enrichi dans les premières fractions de faible densité (fraction n° 4) et était pratiquement absent dans les fractions ultérieures. Le marqueur de la membrane interne mitochondriale Tim17 était concentré dans les fractions de haute densité (fraction n° 17). En revanche, la protéine Mic60 du site de contact s’est accumulée dans des fractions de concentration intermédiaire de saccharose (fraction n° 12-14), ce qui indique la génération réussie et la séparation ultérieure des différentes vésicules membranaires. En revanche, dans des conditions de sonication plus difficiles, le marqueur de membrane externe mitochondriale Tom40 a pu être détecté dans des fractions inférieures du gradient (fraction n° 14 et fraction n° 17, figure 4B). De plus, il y avait une quantité importante de Tim17 dans des fractions de densité intermédiaire (fraction n° 13 et fraction n° 14, figure 4B). L’accumulation non spécifique de marqueurs membranaires externes et internes dans des fractions de densité intermédiaire indique la formation artificielle de membranes mixtes, ce qui inhibe l’identification des protéines candidates.

Figure 1 : Représentation schématique de l’ultrastructure mitochondriale. Représentation schématique d’une mitochondrie pour montrer les différents compartiments, membranes et emplacements des protéines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Flux de travail du fractionnement mitochondrial pour isoler les protéines du site de contact. Une vue d’ensemble schématique du processus décrit dans le protocole. Les (1) mitochondries fraîchement isolées étaient (2) gonflées osmotiquement (3) puis rétrécies. (4) Les mitochondries rétrécies ont été objectées à une sonication légère pour générer des vésicules soumochondriales. (5) Le mélange de vésicules a été concentré et chargé sur un gradient de saccharose. (6) Par centrifugation, les vésicules de la membrane externe mitochondriale ont été enrichies à une faible concentration de saccharose, les vésicules de la membrane interne mitochondriale à une concentration élevée de saccharose et les vésicules contenant le site de contact à une concentration intermédiaire de saccharose. Abréviations : MIM, membrane interne mitochondriale ; MOM, membrane externe mitochondriale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Génération d’un gradient linéaire par centrifugation. Deux gradients (1,3 M, 1,13 M, puis 1,02 M, 0,96 M et 0,8 M dans 20 mM MOPS et 0,5 mM EDTA, pH 7,4) ont été préparés en parallèle, et 1 mL de saccharose 0,6 M dans 20 mM MOPS et 0,5 mM EDTA, pH 7,4, a été chargé sur les deux gradients. Les gradients ont été soumis à une centrifugation à 200 000 x g et 4 °C pendant 12 h et récoltés en 17 fractions chacun. La reproductibilité de la méthode a été testée en déterminant la concentration en saccharose des fractions individuelles des gradients individuels à l’aide d’un réfractomètre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Isolement des protéines du site de contact avec une impulsion ultrasonique bien définie. (A,B) Des mitochondries de levure fraîchement isolées ont été soumises à un traitement osmotique et exposées à une sonication. Les vésicules générées ont été séparées à l’aide d’une centrifugation à gradient de densité flottante de saccharose. Le gradient a été fractionné et les protéines des différentes fractions ont été soumises à une précipitation de TCA. La distribution des protéines marqueurs de la membrane externe mitochondriale (Tom40), de la membrane interne mitochondriale (Tim17) et des sites de contact (Mic60) a été analysée par immunotransfert à l’aide des anticorps indiqués. (A) Une sonication légère (4 x 30 s, amplitude de 10 %) a permis une séparation nette des protéines membranaires externes (fractions de faible densité) et des protéines membranaires internes (fractions de haute densité). De plus, la protéine du site de contact Mic60 a été enrichie avec succès en fractions de densité intermédiaire. (B) Une sonication plus forte (4 x 30 s, 20 % d’amplitude) a entraîné la génération de vésicules hybrides et, par conséquent, n’a pas permis une séparation claire des sites de contact. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.