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Article de méthode

Délimitation du phénotype métabolique des cellules rénales dérivées de la biopsie

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DOI :

10.3791/65457

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17 juin 2025

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1Soham and Shaila Ajmera Family Transplant Centre, University Health Network, 2Division of Nephrology, The Hospital for Sick Children, 3Division of General Surgery, University Health Network, 4Institute of Medical Science, University of Toronto, 5Program in Cell Biology, The Hospital for Sick Children Research Institute, 6Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 7Division of Nephrology, Tallaght University Hospital, 8Trinity Kidney Centre, Trinity College Dublin, 9Department of Immunology, University of Toronto, 10Division of Nephrology, McMaster University and St. Joseph's Healthcare, 11Division of Nephrology, Department of Medicine, University Health Network, 12Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode unique pour effectuer le profilage métabolique des cellules rénales dérivées de la biopsie. L’approche présentée a été optimisée chez des porcs mâles adultes en bonne santé et a le potentiel d’améliorer l’évaluation en temps réel de la viabilité de l’allogreffe rénale. Cette méthode peut également aider à découvrir une nouvelle biologie dans de multiples maladies rénales basées sur le métabolisme.

Résumé

La transplantation rénale est le traitement optimal de l’insuffisance rénale terminale ; Cependant, les reins transplantés sont souvent perdus prématurément, avec jusqu’à 50 % de perte de greffon 10 ans après la greffe. L’une des principales causes de perte prématurée du greffon est la lésion subie par le greffon au moment de la transplantation, connue sous le nom de lésion d’ischémie-reperfusion (IRI). Le retard de fonction du greffon (DGF), défini comme la nécessité d’une dialyse dans la première semaine suivant la greffe, est une manifestation de l’IRI sévère qui présente des caractéristiques fonctionnelles et histologiques de l’insuffisance rénale aiguë (IRA). Bien que les mécanismes à l’origine de l’IRA restent incertains, de plus en plus de preuves suggèrent que l’altération de la fonction métabolique dans l’allogreffe médie l’IRA et pourrait être à l’origine de la DGF. Ainsi, le décryptage et le suivi des fondements métaboliques de l’IRI amélioreront notre capacité à diagnostiquer et à prévenir l’IRA. Cet article décrit une méthode unique pour évaluer la respiration mitochondriale (au moyen du taux de consommation d’oxygène), la glycolyse (taux d’acidification extracellulaire) et les niveaux intracellulaires d’ATP dans des suspensions de cellules rénales dérivées d’une biopsie à l’aiguille. La méthodologie a été optimisée chez des porcs mâles adultes en bonne santé et validée dans un modèle porcin d’auto-transplantation. L’approche présentée a le potentiel d’améliorer l’évaluation en temps réel de la viabilité de l’allogreffe rénale en clinique. Le profilage du métabolisme dans les biopsies dérivées de patients peut également révéler une nouvelle biologie dans d’autres maladies rénales basées sur le métabolisme.

Introduction

La transplantation rénale est le traitement optimal de l’insuffisance rénale terminale 1,2,3,4 ; Cependant, les reins transplantés sont souvent perdus prématurément, avec jusqu’à 50 % de perte de greffon 10 ans après la transplantation5. Les patients touchés ont une morbidité et une mortalité accrues et représentent un fardeau économique majeur pour les systèmes de santé6. L’une des principales causes de perte prématurée du greffon est la lésion subie par le greffon au moment de la transplantation, connue sous le nom de lésion d’ischémie-reperfusion (IRI). L’IRI est une lésion inévitable causée par une diminution du flux sanguin, suivie d’une reperfusion7. L’ischémie est caractérisée par une accumulation de succinate tissulaire, qui entraîne un flux d’électrons inverse dans la chaîne respiratoire mitochondriale, entraînant une production de superoxyde et des lésions ultérieures peu après la reperfusion8. L’IRI dans les organes transplantés augmente le risque de non-fonction primaire, de fonction retardée du greffon (DGF), de rejet et de résultats inférieurs du greffon 8,9. La DGF, définie comme la nécessité d’une dialyse dans la première semaine suivant la greffe9, est une manifestation d’IRIsévère 10. Histologiquement, la DGF associée à l’IRI se manifeste par une nécrose tubulaire aiguë (ATN) et une lésion de la microvascularisation. Sur le plan fonctionnel, il y a une diminution du débit de filtration glomérulaire (DFG) et de la production d’urine, caractéristiques de l’insuffisance rénale aiguë (IRA) dans l’allogreffe11. Malgré son importance, il n’existe actuellement aucun traitement pour l’IRA post-transplantation associée à l’ischémie-reperfusion. L’absence de traitements provient d’une compréhension incomplète des mécanismes de la maladie et d’un manque de marqueurs permettant d’identifier les patients les plus à risque de dysfonctionnement du greffon pendant les moments critiques où les lésions peuvent être réversibles12.

De plus en plus de preuves suggèrent que l’altération du métabolisme énergétique dans l’allogreffe médie l’IRA et pourrait être à l’origine de DGF 13,14,15. Les cellules rénales génèrent de l’énergie via deux mécanismes majeurs : la respiration mitochondriale et la glycolyse16. Dans l’IRI, la reperfusion entraîne un dysfonctionnement mitochondrial17. Par conséquent, la glycolyse devient la principale source d’énergie 13,18,19,20. Le décalage métabolique de l’IRI favorise la mort des cellules endothéliales tubulaires et microvasculaires, conduisant à l’IRA 21,22,23,24. Dans des travaux antérieurs, l’ATN a été associée à une augmentation de l’expression des enzymes glycolytiques et à une altération des niveaux de protéines mitochondriales25, conformément à l’IRI dans le greffon 13,18. De plus, dans un modèle d’autotransplantation rénale porcine, l’ischémie suivie d’un stockage au froid a entraîné une réduction des niveaux de protéines mitochondriales rénales et une augmentation de l’excrétion de lactate26. Dans l’ensemble, ces résultats renforcent l’importance clinique de la surveillance du phénotype métabolique des allogreffes rénales, même avant la greffe, car les caractéristiques métaboliques basales de l’allogreffe peuvent être prédictives d’un dysfonctionnement de l’allogreffe27.

Des modèles de prédiction clinique du risque à court terme de rejet et de perte d’allogreffe ont été développés28,29. Cependant, ces modèles manquent de précision et ne prennent pas en compte les caractéristiques moléculaires du greffon 30,31,32. Des études récentes ont cherché à répondre à ce besoin non satisfait en identifiant des modèles moléculaires au niveau tissulaire associés à des résultats inférieurs de la greffe, tels que le dysfonctionnement et le rejet de l’allogreffe 13,14,15,25,33,34. Ces études reposent sur des mesures moléculaires à l’état stationnaire au niveau du gène33, 34, 35, de la protéine25, 26 et du métabolite13,14, laissant une image incomplète du phénotype métabolique de l’allogreffe. Cette lacune dans les connaissances est en partie due à une incapacité à mesurer la fonction métabolique et l’état énergétique d’échantillons dérivés de reins à un moment donné. L’élaboration d’un protocole normalisé pour déterminer le phénotype métabolique des cellules rénales dérivées de la biopsie, qui pourrait potentiellement être traduit dans l’étude d’échantillons de patients, est justifiée. Cet article décrit un flux de travail unique pour évaluer la respiration mitochondriale (au moyen du taux de consommation d’oxygène), la glycolyse (taux d’acidification extracellulaire) et les niveaux intracellulaires d’ATP dans des suspensions de cellules rénales dérivées de la biopsie. La méthodologie a été optimisée à l’aide de carottes de biopsie rénale provenant de porcs mâles adultes en bonne santé. Pour faciliter la mise en œuvre clinique future, les carottes de biopsie ont été obtenues à l’aide d’une aiguille 18 G, comme dans les protocoles cliniques standard de prélèvement de greffes rénales36,37. Enfin, l’utilité de la mise en œuvre du protocole dans des conditions expérimentales discriminantes a été validée dans un modèle porcin d’auto-transplantation.

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Protocole

Ce protocole a été approuvé par le Comité de protection des animaux de l’Institut général de recherche de Toronto (numéro de protocole d’utilisation des animaux : 3652). Les animaux ont été soignés conformément à la National Society of Medical Research et au Guide pour le soin des animaux de laboratoire, National Institute of Health (NIH), Ontario, Canada. Cinq porcs Yorkshire mâles de 3 mois, pesant environ 30 kg chacun, ont été utilisés dans cette étude. Le protocole de cette méthodologie est subdivisé en les étapes suivantes : (1) Dissociation des carottes de biopsie rénale unique en suspensions cellulaires ; (2) Profilage métabolique des cellules rénales dérivées de la biopsie ; et (3) Mesure de la teneur en ATP dans les cellules rénales dérivées de la biopsie. Tous les échantillons de biopsie prélevés pour mesurer la fonction métabolique ou la teneur en ATP ont été dissociés dans les 3 heures suivant le prélèvement dans une enceinte de biosécurité. Le flux de travail de la méthodologie est illustré à la figure 1. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Dissociation des carottes de biopsie rénale unique en suspensions cellulaires

  1. Prélever trois carottes de tissu de biopsie dans le cortex rénal à l’aide de l’aiguille coaxiale (c.-à-d. une aiguille de guidage externe et une aiguille de biopsie interne)38. Pour l’application clinique, l’utilisation d’un pistolet à aiguille de biopsie de 18 G est recommandée39.
    REMARQUE : Soyez cohérent avec l’angle du pistolet de l’aiguille de biopsie (~45 °C) et la profondeur de la ponction (~20 mm) lors de la réalisation de biopsies du cortex rénal.
  2. Placez soigneusement chaque carotte de biopsie dans un tube de 15 mL contenant 2 mL de RPMI 1640 sur de la glace.
    1. Fragmentez le tissu de la biopsie en petits morceaux (≤2 mm de long) à l’aide d’un scalpel sur une boîte de Pétri de 6 cm posée sur de la glace. À l’aide d’une pince à épiler ultramince à pointe fine incurvée, placez les fragments de tissu de chaque biopsie dans un tube différent de 1,5 mL contenant 1 mL de milieu de dissociation.
      REMARQUE : Le milieu de dissociation est constitué d’un milieu RPMI 1640 contenant 0,1 mg/mL de DNase I, 10 mg/mL de collagénase et 2990 unités/mL de protéase neutre de Bacillus polymyxa. Il a été prouvé que la dissociation des biopsies rénales humaines à l’aide de cette composition de milieux maximise la viabilité cellulaire et préserve la représentation de populations cellulaires rares et fragiles40.
  3. Laisser la dissociation s’opérer pendant 30 min à 37 °C (bloc chauffant) avec agitation intermittente (un tourbillon des tubes toutes les 5 min est recommandé).
  4. Après dissociation, filtrez les suspensions cellulaires à travers des tubes à capuchon pression de crépine de 35 μm.
  5. Rincez la passoire avec un volume de 1:1 de sérum de veau fœtal à 100 %.
  6. Regroupez les trois suspensions de cellules rénales dérivées d’une biopsie dans un tube de 15 ml.
  7. Granulez les cellules par centrifugation (400 x g, 5 min, 4 °C) et mettez-les en suspension dans 1 mL de RPMI 1640 contenant 10 % de FBS. Cette suspension cellulaire produit normalement 0,8-1,2 × 106 cellules.

2. Profilage métabolique des cellules rénales dérivées de la biopsie

REMARQUE : L’étape de profilage métabolique intègre la mesure de la glycolyse (ECAR) et du taux de consommation d’oxygène (OCR) dans un analyseur de fonction métabolique, ainsi que les niveaux d’ATP intracellulaires à l’aide d’un kit commercial.

  1. Hydratation et étalonnage de la plaque utilitaire de la cartouche
    1. Un jour avant le prélèvement de l’échantillon, ajoutez 200 μL de ddH2O dans chaque puits de la plaque utilitaire de la cartouche de l’analyseur de fonction métabolique.
    2. Incuber la plaque utilitaire de la cartouche dans un incubateur sans CO2 à 37 °C pendant la nuit.
    3. Le jour du prélèvement de l’échantillon, prélever le ddH2O par aspiration à l’aide d’une pipette Pasteur reliée à un système de vide, et ajouter 200 μL de solution d’étalonnage (pH = 7,4) dans chaque puits de la plaque utilitaire de la cartouche.
    4. Incuber la plaque utilitaire de la cartouche dans un incubateur sans CO2 à 37 °C pendant la nuit.
  2. Placage cellulaire et préparation de milieux de test et de composés stressants pour les mesures de la fonction métabolique
    1. Ajouter 100 μL de RPMI avec 10 % de FBS dans chaque puits d’une plaque de dosage de la fonction métabolique à 96 puits.
    2. Séparez une petite aliquote (p. ex., 10 μL) de la suspension cellulaire (obtenue à l’étape 1) dans un tube différent et colorez les cellules à l’aide d’un colorant d’exclusion de viabilité au bleu trypan.
    3. À l’aide d’une chambre de comptage, déterminer la concentration de cellules vivantes (bleu trypan négatif)41 dans la suspension d’origine.
    4. Ensemencer les cellules dans chacun des puits d’étude de la plaque de test de la fonction métabolique, à une densité de 1,0 x 105 cellules vivantes/puits. Ce numéro de cellule a été déterminé après optimisation (voir la section Résultats représentatifs).
      REMARQUE : N’ensemencez pas de cellules dans l’un des quatre coins de la plaque de test de la fonction métabolique, car elles sont utilisées comme des blancs.
    5. Laissez les cellules adhérer en incubant la plaque de test de la fonction métabolique dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant la nuit (~16 h).
    6. Le lendemain, confirmez au microscope que les cellules se trouvent à une confluence minimale de 70 % à 80 % (une monocouche cellulaire saine est importante pour la détermination optimale des paramètres de la fonction métabolique).
    7. Décongeler une aliquote (40-50 mL) de milieu de base sans rouge de phénol à 37 °C, pendant au moins 15 min.
    8. Préparez 35 mL de milieu de dosage en ajoutant 2 mM de glutamine (350 μL), 1 mM de pyruvate (350 μL) et 5,55 mM de glucose (385 μL) dans 33,915 mL de milieu de base prédécongelé.
    9. À l’aide d’une pipette monocanal ou multicanaux, retirer délicatement le milieu RPMI de chaque puits d’étude de la plaque de dosage de la fonction métabolique. Ensuite, ajoutez 100 μL de milieu basal pour laver les cellules.
    10. Retirez délicatement le milieu basal et ajoutez 150 μL de milieu de test dans chaque puits, y compris les puits sans cellules.
      REMARQUE : Le fait de laisser les puits sans milieu de dosage peut affecter les conditions d’humidité dans l’environnement de la plaque et entraîner des mesures incohérentes de la fonction métabolique (figure supplémentaire 1).
    11. Placer la plaque de dosage de la fonction métabolique dans un incubateur sans CO2 à 37 °C pendant ~1 h (étape d’acclimatation). Ramenez la plaque utilitaire de la cartouche (préalablement incubée dans une solution d’étalonnage) dans l’enceinte de biosécurité.
    12. Au cours de l’acclimatation, préparer les quatre solutions suivantes de composés stressants, dans un milieu d’essai : 7 μM d’oligomycine (7x, pour une concentration finale de 1 μM d’oligomycine) ; 2,4 μM de cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) (8x, pour une concentration finale de 0,3 μM FCCP) ; 450 mM 2-désoxy-glucose (2-DG) (9x, pour une concentration finale 50 mM 2-DG) ; 10 μM de roténone et 10 μM d’antimycine A (Rot + AA) (10x, pour une concentration finale 1 μM Rot + 1 μM AA).
      REMARQUE : L’oligomycine inhibe l’activité de l’ATP synthase et interrompt donc la chaîne de transport d’électrons (ETC). Cela réduit l’OCR et l’afflux de protons induit par l’ATP synthase dans les mitochondries. En conséquence, la glycolyse devient la principale source de production d’ATP42. Le FCCP est un médicament cyanure (charge négative) qui agit comme un découpleur de la phosphorylation oxydative, en attirant les protons (charge positive) et en induisant un afflux continu de protons dans les mitochondries, ce qui permet la consommation d’oxygène par l’ETC indépendamment de l’activité de l’ATP synthase43. Le 2-DG est un analogue structurel synthétique du glucose dans lequel le groupe 2-hydroxyle est remplacé par l’hydrogène, et agit comme un inhibiteur compétitif de la glycolyse44. La pourriture et l’AA sont des médicaments inhibiteurs des complexes I et III de la chaîne de transport d’électrons, respectivement45. Les effets de l’injection de chaque médicament à différentes étapes de l’essai de la fonction métabolique sont illustrés à la figure supplémentaire 2.
    13. Chargez 25 μL de chaque médicament dans l’orifice correspondant situé au-dessus de chaque puits de la plaque utilitaire de la cartouche, y compris les puits sans cellules. Chargez les médicaments selon l’ordre suivant : 7x oligomycine (port A), 8x FCCP (port B), 9x 2-DG (port C), 10x Rot + AA (port D).
    14. Incuber la plaque utilitaire de la cartouche dans l’incubateur sans CO2 jusqu’à ce qu’il soit nécessaire de mettre en place le test de fonction métabolique.
  3. Détermination de la consommation d’oxygène et des taux de glycolyse dans les cellules rénales dérivées de la biopsie
    1. Vérifiez que l’analyseur de fonctions métaboliques est allumé et connecté au logiciel du contrôleur dans un ordinateur accessoire.
    2. Lancez le logiciel.
    3. Cliquez sur le bouton Modèle > Vide.
    4. Dans le premier onglet, cliquez sur le bouton Stratégie d’injection. Cliquez sur chaque bouton avec les lettres A, B, C ou D qui correspondent aux quatre ports d’injection. Notez le nom du médicament qui sera injecté par chaque port : oligomycine (port A), FCCP (port B), 2-DG (port C), Rot + AA (port D).
    5. Dans le deuxième onglet, définissez toutes les conditions expérimentales. Cliquez sur le bouton Ajouter une condition pour introduire une nouvelle condition. Le logiciel attribuera automatiquement une couleur à chaque condition. Cliquez sur le bouton Carte de plaque et attribuez la condition expérimentale correspondante à chaque puits, qui sera coloré en conséquence.
      REMARQUE : Les quatre puits d’angle doivent rester affectés comme vides (couleur noire), car ils sont utilisés pour soustraire le signal de fond.
    6. Dans le troisième onglet, cliquez quatre fois sur le bouton Injection, de sorte que les quatre injections (ports A, B, C et D) soient ajoutées à la séquence. Le test peut être exécuté en utilisant la séquence d’injection par défaut (A, B, C, D), le nombre de mesures (3 mesures basales + 3 mesures après chaque injection) et le temps entre les mesures (3 min).
    7. Dans le quatrième onglet, remplissez les cases avec les informations essentielles de l’étude, puis cliquez sur Exécuter. Le plateau s’ouvrira et le logiciel demandera à l’utilisateur de monter la plaque utilitaire de la cartouche. Assurez-vous de retirer le couvercle vert avant de placer l’assiette sur le plateau.
    8. Après l’étalonnage (~15 min), le plateau s’ouvrira à nouveau et le logiciel demandera à l’utilisateur de retirer la plaque utilitaire de la cartouche et de placer la plaque de test de la fonction métabolique sur le plateau. Encore une fois, retirez le couvercle de la plaque avant de monter la plaque sur le plateau. La plaque utilitaire de la cartouche peut être jetée.
    9. Le test se terminera dans environ 2 heures. Après ce délai, enregistrez le fichier '.asyr' correspondant. Analysez les fichiers .asyr par calcul pour examiner les courbes ECAR et OCR. Exportez les données dans le format de votre choix.
  4. Mesure de la teneur en ADN pour la normalisation des données de fonction métabolique
    1. Déterminez la quantité d’ADN dans les cellules de chaque puits après l’essai de fonction métabolique à l’aide du kit d’essai de prolifération cellulaire spécifié (voir le tableau des matériaux).
    2. Préparez le volume requis de 1 tampon de lyse cellulaire en diluant 20 tampons de lyse cellulaire dans de l’eau désionisée.
    3. Pour préparer une courbe standard, préparez des échantillons de 100 μL d’ADN de bactériophage λ (inclus dans la trousse de dosage de la prolifération cellulaire) dilués en série dans un tampon de lyse cellulaire à des concentrations comprises entre 0 ng/mL, 12,5 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 200 ng/mL, 400 ng/mL, 800 ng/mL. Chargez chaque dilution dans un puits différent d’une microplaque noire de 96 puits.
    4. Préparez 1x solution de liaison de colorant en diluant 400x réactif de colorant dans 1x tampon de lyse cellulaire. Pour chaque puits de courbe standard et chaque puits de fonction métabolique bien étudié, 100 μL seront nécessaires.
    5. Répartissez 100 μL de solution de colorant 1x dans la première colonne, qui contient déjà les étalons. REMARQUE : Le processus jusqu’à ce point peut être commencé 30 minutes avant la fin du test de la fonction métabolique.
    6. Retirez le milieu de dosage de la plaque de dosage de la fonction métabolique à l’aide d’une pipette monocanal ou multicanaux.
    7. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 100 μL de 1x solution de liaison de colorant dans chaque puits d’étude de la plaque de dosage de la fonction métabolique. Pipetez de haut en bas plusieurs fois pour lyser les cellules et transférez le contenu sur la plaque noire.
    8. Protégez la microplaque de la lumière et incubez à 37 °C pendant 2 à 5 min.
    9. Mesurez l’intensité de fluorescence de chaque échantillon à l’aide d’un lecteur de microplaques à fluorescence avec excitation à 480 nm et détection d’émission à 520 nm.

3. Mesure de la teneur en ATP dans les cellules rénales dérivées de la biopsie

REMARQUE : Mesurez la quantité d’ATP dans les cellules rénales dérivées d’une biopsie à l’aide du réactif de détection ATP spécifié et de l’étalon ATP recombinant (rATP) (voir le tableau des matériaux).

  1. S’il est congelé, décongeler le réactif de détection de l’ATP à 4 °C pendant la nuit.
  2. Après l’acquisition de suspensions cellulaires dérivées de la biopsie et le comptage des cellules, plaquez 1,0 x 104 cellules vivantes/puits dans chaque puits d’une microplaque blanche de 96 puits contenant 100 μL de milieu RPMI 1640 avec 10 % de FBS. Laissez la première colonne de la microplaque vide, car elle sera utilisée pour charger une courbe standard rATP le lendemain.
  3. Incuber la microplaque à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant la nuit.
  4. Le lendemain, préchauffez le réactif de détection de l’ATP à température ambiante.
  5. Générez la courbe standard rATP. Préparer des échantillons de 100 μL d’étalon de rATP dilués en série dans du PBS aux concentrations suivantes : 0 nM, 0,001 nM, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM.
  6. Chargez 50 μL de chaque échantillon étalon rATP dans la première colonne de la microplaque.
  7. Retirez le support RPMI 1640 contenant 10 % de FBS de chaque puits d’étude de microplaques, à l’aide d’une pipette monocanal ou multicanaux.
  8. Bien laver chaque étude avec 100 μL de PBS (préchauffé dans un bain-marie à 37 °C).
  9. Retirez le PBS et ajoutez 50 μL de nouveau PBS dans chaque puits d’étude.
  10. Ajouter 50 μL de réactif de détection ATP dans le puits standard et dans le puits d’étude.
  11. Mélanger, incuber à 37 °C pendant 2 min, puis à RT pendant 10 min.
  12. Lire et enregistrer la luminescence dans un lecteur de microplaques.

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Résultats

Le flux de travail a été testé sur des cellules rénales dérivées de biopsies provenant de porcs Yorkshire mâles sains âgés de 3 mois. Le protocole de dissociation des tissus et de placage cellulaire a été suivi comme indiqué ci-dessus. Après avoir laissé les cellules adhérer pendant 16 h, l’OCR et l’ECAR ont été mesurés en temps réel dans les cellules rénales porcines dérivées de la biopsie à l’aide d’un analyseur de fonction métabolique, en tant que marqueurs de la respiration mitochondriale et de la glycolyse, respecti...

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Discussion

Cet article décrit une méthode unique pour évaluer la fonction métabolique des cellules rénales obtenues à partir de biopsies. Un protocole permettant d’obtenir des suspensions unicellulaires à partir de biopsies rénales par forage frais a été couplé à une analyse de la fonction métabolique et des niveaux intracellulaires d’ATP. La glycolyse est évaluée en mesurant l’ECAR, et la respiration mitochondriale en mesurant l’OCR. Des biopsies rénales à base de porine ont été utilisées pour opt...

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Déclarations de divulgation

Aucun des co-auteurs n’a d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts à divulguer.

Remerciements

AK a été soutenu par la Fondation du Réseau universitaire de santé (prix 579067450776, 579072310776 et 579068260776). SC-F a été soutenu par le programme KRESCENT (2019KPPDF637713 et 24KNIA-1291062).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-Déoxy-D-glucoseSigmaD6134Inhibiteur compétitif de la glycolyse
5 mL Tube à essai en polystyrène
à fond rond, avec crépine cellulaire Snap Cap		Falcon352235Tubes de dissociation
Antimycine A à partir de  ; Streptomyces » nbsp ; sp.SigmaA8674Inhibiteur du complexe III de la chaîne respiratoire
AOF BP ProtéaseVitaCyte003-1000Enzyme de dissociation
Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)
phénylhydrazone (FCCP)		SigmaC2920Découpleur de la phosphorylation oxydative
CellTiter-Glo 2.0 Assay, 100mLPromegaG9242Mesure de l’ATP
Collagénase MAVitaCyte001-2030Enzyme de dissociation
CyQUANT Essai de prolifération cellulaire, pour cellules en cultureInvitrogenC7026Mesure de l’ADN intracellulaire
D-glucose, anhydre, réactifBioshopGLU501Substrat métabolique
DNase IStemcell07469Enzyme
de dissociationSérum fœtal de bovin, Premium,
Origine américaine, Inactivé par la chaleur, 500 mL		Wisent080-450Supplément de milieu de dissociation
L-Glutamine-200 mM (100x) liquide (100 mL)Gibco25030081Substrat métabolique
Oligomycine ASigma75351Inhibiteur de l’ATP synthase
PBS, -/-, 500 mLWisent311-010-CLLavage cellulaire
rATP,  10 mM,  ; 0?5 mLPromegaP1132Mesure de l’ATP intracellulaire
RotenoneSigmaR8875Inhibiteur du complexe I de la chaîne respiratoire
RPMI 1640Gibco11875119Milieu de dissociation
Logiciel Seahorse Wave Controller 2.6AgilentN/AMise en place des mesures de la fonction métabolique
Seahorse Wave Desktop Software 2.6AgilentN/AAnalyse des données de fonction métabolique
Milieu de base Seahorse XF, sans rouge de phénol, 500 mLAgilent103335-100Mesure de la fonction métabolique
Seahorse XFe96 FluxPak  ; (20 plaques, 18 cartouches,
et 500 ml de solution d’étalonnage)		Agilent102416-100Mesure de la fonction métabolique
Analyseur de fonction métabolique Seahorse XFe96Agilent101991-100Mesure de la fonction métabolique
Pyruvate de sodium Solution 100 mM (100X), liquide 100 mLGibco11360070Substrat métabolique
intracellulaire

Références

  1. Tonelli, M., Wiebe, N., Knoll, G. Systematic review: Kidney transplantation compared with dialysis in clinically relevant outcomes. Am J Transplant. 11 (10), 2093-2109 (2011).
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