Méthodes d’électroporation et de confirmation de transformation chez Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Résumé

Ici, nous présentons des protocoles pour travailler avec Limosilactobacillus reuteri DSM20016, détaillant la croissance, la transformation plasmidique, la PCR de colonie, la mesure de protéines rapporteures fluorescentes et la mini-préparation plasmidique limitée, ainsi que les problèmes courants et le dépannage. Ces protocoles permettent la mesure des protéines rapporteures dans DSM20016, ou la confirmation par PCR de colonie si aucun rapporteur n’est impliqué.

Résumé

Lactobacillus était un genre incroyablement grand et diversifié de bactéries comprenant 261 espèces, dont plusieurs étaient des souches commensales avec le potentiel d’être utilisé comme châssis pour des activités biologiques synthétiques dans le tractus gastro-intestinal. La grande variation phénotypique et génotypique observée au sein du genre a conduit à une reclassification récente et à l’introduction de 23 nouveaux genres.

En raison de l’ampleur des variations au sein des anciens genres, les protocoles démontrés chez un membre peuvent ne pas fonctionner comme annoncé avec d’autres membres. Un manque d’informations centralisées sur la façon exacte de manipuler des souches spécifiques a conduit à une gamme d’approches ad hoc , souvent adaptées à partir d’autres familles bactériennes. Cela peut compliquer les choses pour les chercheurs qui débutent dans le domaine, qui peuvent ne pas savoir quelle information s’applique ou non à la souche choisie.

Dans cet article, nous visons à centraliser un ensemble de protocoles dont le succès a été démontré, en particulier dans la désignation de la souche Limosilactobacillus reuteri F275 (autres numéros de collection: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), ainsi que des conseils de dépannage et des problèmes courants que l’on peut rencontrer. Ces protocoles devraient permettre à un chercheur ayant peu ou pas d’expérience de travail avec L. reuteri DSM20016 de transformer un plasmide, de confirmer la transformation et de mesurer la rétroaction du système dans un lecteur de plaques via une protéine rapporteur.

Introduction

Le genre Lactobacillus a été historiquement classé comme gram-positif, en forme de bâtonnet, non sporulé, anaérobie facultatif ou microaérophiles qui décomposent les sucres pour produire principalement de l’acide lactique¹. Ces critères vagues ont conduit à Lactobacillus étant, phénotypiquement et génotypiquement, un genre extrêmement diversifié. Cette vaste catégorisation a entraîné la reclassification du genre, introduisant 23 nouveaux genres en 2020².

L’ancien genre, plus large, comprenait les principales espèces commensales et probiotiques généralement considérées comme s....

Protocole

1. Préparation de cellules électrocompétentes DSM20016 L. reuteri

NOTE: Ceci est basé sur un protocole de Berthier et ^al.17, avec des vitesses de centrifugation informées par Rattanachaikunsopon et al.¹⁸.

1. Dans un tube à centrifuger de 50 mL, inoculer L. reuteri à partir d’un stock de glycérol dans 6 mL de bouillon deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incuber en aérobiose pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur statique.
2. Le lendemain matin, inoculer 4 mL de la culture de nuit dans 200 mL de bouillon MRS (dilution de 1:50).
3. Lais....

Résultats

Efficacité de la transformation
L. reuteri ne nécessite pas de plasmide non méthylé dcm-/dam^-, comme observé pour d’autres Lactobacillaceae^19,20 (voir Figure 1). L’électroporation de L. reuteri DSM20016 avec 10 μL du plasmide de 8,5 kb pTRKH3_mCherry2 (pAMβ1 origine thêta de la réplication) devrait donner des efficacités de transformation d’environ 80 unités formant.......

Discussion

L’étape la plus critique pour la transformation de L. reuteri DSM20016 est la génération de conditions de croissance anaérobie après que les transformations ont été plaquées; Les colonies acquises dans des conditions aérobies ne sont que très occasionnelles et ne se développent généralement pas lorsqu’elles sont inoculées dans du bouillon MRS. Le placage de l’ensemble du volume de récupération doit également être pratiqué pour maximiser la probabilité de croissance de la colonie. Même avec ces deux étapes critiq.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 kb Plus Échelle d’ADN	NEB	N3200L
1mL Spectrophotomètre cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose  ;	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (centrifugeuse réfrigérée)	Beckman Allegra  ;	N/A N’est	plus en production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 Système d’électroporation	VWR	58017-984
Tubes à centrifuger (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
Gel d’ADN x6 colorant de chargement	NEB	B7024S
Cuvette d’électroporation	Fisherbrand	FB101
Erythromycine	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel électroporation bain/dock	VWR	76314-748
Glycérol  ;	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Institut Leibniz DSMZ	DSM20016	Désignation de la souche F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Tubes à microcentrifuger (1,7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP remplacé par un rapporteur mCherry2 constitutif optimisé pour les codons protéines  ;
Bouillon MRS (déshydraté)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH  ;	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
tubes PCR	FroggaBio	STF-A120S
Microcentrifugeuse de paillasse personnelle	Genlantis	E200100
Boîtes de Pétri	VWR	25384-088
PTC-150 Thermocycleur	MJ Research	N/A N/A N’est	plus en production
pTRKH3_slpGFP (modifié)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotomètre	Thermo Scientific	840-281700
Microplaque de stockage	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	N’est plus en production
VWR 1500E incubateur	VWR	N/A N° n’est	plus en production