Nous présentons ici un protocole permettant de réaliser la fabrication à grande échelle de cellules adhérentes grâce à un système entièrement fermé basé sur des microporteurs solubles de qualité GMP. La culture de cellules souches mésenchymateuses humaines, de cellules HEK293T et de cellules Vero a été validée et a répondu à la fois aux exigences quantitatives et aux critères de qualité de l’industrie de la thérapie cellulaire et génique.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Production de cellules à grande échelle à base de microporteurs poreux solubles de qualité GMP
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les chercheurs de l’industrie de la thérapie cellulaire et génique (CGT) sont depuis longtemps confrontés à un défi de taille dans l’expansion efficace et à grande échelle des cellules. Pour remédier aux principales lacunes du système de culture planaire bidimensionnelle (2D), nous avons développé de manière innovante une plate-forme automatisée de production de cellules à l’échelle industrielle fermée (ACISCP) basée sur un microsupport poreux, soluble et de qualité GMP pour la culture 3D de cellules adhérentes, y compris les cellules souches mésenchymateuses/stromales humaines (CSMh), les cellules HEK293T et les cellules Vero. Pour réaliser une expansion à grande échelle, une expansion en deux étapes a été menée avec des bioréacteurs à cuve agitée de 5 L et 15 L pour produire 1,1 x10 10 hMSC avec une expansion globale de 128 fois en 9 jours. Les cellules ont été récoltées en dissolvant complètement les microtransporteurs, concentrées, lavées et formulées avec un système de traitement cellulaire à flux continu basé sur une centrifugeuse, puis alicitées avec un système de remplissage de cellules. Par rapport à la culture planaire 2D, il n’y a pas de différences significatives dans la qualité des CSMh récoltées à partir de la culture 3D. Nous avons également appliqué ces microporteurs poreux solubles à d’autres types de cellules populaires dans le secteur de la CGT ; plus précisément, les cellules HEK293T et les cellules Vero ont été cultivées à des densités cellulaires maximales de 1,68 x 10 7 cellules/mL et de 1,08 x 107 cellules/mL, respectivement. Cette étude fournit un protocole pour l’utilisation d’une plate-forme d’ingénierie des bioprocédés exploitant les caractéristiques des microporteurs solubles de qualité GMP et des équipements fermés avancés pour réaliser la fabrication à l’échelle industrielle de cellules adhérentes.
Introduction
L’industrie de la CGT a connu une expansion exponentielle au cours des deux dernières décennies. On s’attend à ce que l’évolution des médicaments de nouvelle génération traite et guérisse de nombreuses maladies réfractaires1. Depuis la première approbation par la Food and Drug Administration (FDA) d’un produit CGT, Kymriah, en 2017, la recherche et le développement liés à la CGT dans le monde ont continué de croître à un rythme rapide, la FDA voyant le nombre de demandes actives de nouveaux médicaments expérimentaux pour la CGT augmenter à 500 en 20182. Il avait été prédit que le nombre d’approbations de produits CGT ser....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Le cordon ombilical humain a été obtenu à l’hôpital Tsinghua Changgeng de Pékin. Toutes les procédures et tous les protocoles concernant l’acquisition, l’isolement et la culture des cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical humain (UCMSCs) ont été effectués avec le consentement éclairé et avec l’approbation du Comité d’éthique de l’hôpital Tsinghua Changgeng de Beijing (numéro de dossier 22035-4-02), et les procédures et protocoles étaient conformes à la déclaration d’Helsinki de 1964 et à ses amendements ultérieurs ou à des normes éthiques comparables.
1. Culture monocouche de CSMh, de cellules HEK293T et de cellules Vero....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
La plate-forme ACISCP est un système entièrement fermé qui utilise une série de bioréacteurs à cuve agitée pour l’expansion à grande échelle, un système de traitement cellulaire pour la récolte et la formulation automatisées des cellules, et un système de remplissage cellulaire (Figure 1). Les cellules adhérentes se fixent aux microporteurs poreux, qui peuvent être dispersés dans le bioréacteur, réalisant ainsi la culture en suspension des cellules adhérentes.
Sui.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
L’immunothérapie et la thérapie par cellules souches utilisent toutes deux des cellules vivantes comme médicaments ; Cependant, leurs produits finaux ne doivent pas être purifiés ou stérilisés de la même manière que les petites molécules ou les virus. Par conséquent, le principe de la qualité par la conception (QbD) doit toujours être gardé à l’esprit et appliqué dans la pratique au processus de fabrication et de contrôle des produits chimiques (CMC) lors de la production de cellules23. Un système.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Y.D. est conseiller scientifique, et H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. et X.Y. sont des employés de Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. Les autres auteurs n’ont aucun intérêt commercial, patrimonial ou financier dans les produits ou les entreprises décrits dans cet article. Tous les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu financièrement par la National Science Foundation for Distinguished Young Scholars (82125018).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,25 % de trypsine EDTA | BasalMedia | S310JV | Utilisé pour la récolte de cellules 2D. |
| 3D FloTrix Digest | CytoNiche Biotech | R001-500 | Il s’agit d’un réactif qui dissout spécifiquement les microporteurs 3D TableTrix. |
| Milieu sans sérum 3D FloTrix MSC | CytoNiche Biotech | RMZ112 | Il s’agit d’un milieu sans sérum et sans animaux pour l’expansion et la maintenance des cellules souches mésenchymateuses en culture planaire 2D ainsi que la culture 3D sur des microtransporteurs 3D TableTrix. |
| Module de filtration à usage unique 3D FloTrix | CytoNiche Biotech | R020-00-10 | Ce module contient 0,22 &mu ; Filtres à capsules M utilisés pour la filtration du milieu de culture et de la solution de digestion. |
| Sac de rangement à usage unique 3D FloTrix (10 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-03 | Utilisé comme sac d’alimentation pour le bioréacteur de 5 L. |
| Sac de conservation à usage unique 3D FloTrix (3 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-01 | Utilisé comme sacs d’ensemencement ou de transfert de cellules. |
| Sac de rangement à usage unique 3D FloTrix (50 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-04 | Utilisé comme sac d’alimentation pour le bioréacteur de 15 L. |
| 3D FloTrix vivaPACK Remplissage jetable& Kit de Consommables de Finition | CytoNiche Biotech | PACK-01-01 | Il s’agit d’un kit standard adapté au système de remplissage et de finition 3D vivaPACK. |
| Système de remplissage et de finition 3D FloTrix vivaPACK pour cellules | CytoNiche Biotech | vivaPACK | Ce système est un dispositif fermé de manipulation de liquides, avec des fonctions automatisées de mélange et d’évacuation des gaz. Les cellules remises en suspension dans un tampon de cryoconservation peuvent être rapidement et uniformément alibuées dans 20 sacs par lot. |
| Système de traitement cellulaire 3D FloTrix vivaPREP PLUS | CytoNiche Biotech | vivaPREP PLUS | Ce système est un dispositif basé sur une centrifugeuse à flux continu. Les cellules peuvent être concentrées, lavées et remises en suspension dans le cadre de procédures complètement fermées. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit | CytoNiche Biotech | PREP-PLUS-00 | Il s’agit d’un kit standard adapté au traitement cellulaire 3D vivaPREP PLUS. |
| Bioréacteur 3D FloTrix vivaSPIN ; 15 L | CytoNiche Biotech | FTVS15 | Ce bioréacteur utilise un contrôleur, une cuve à cuve agitée en verre de 15 L et des assesseurs. Un tube de perfusion spécial est disponible. |
| Bioréacteur 3D FloTrix vivaSPIN ; 5 L | CytoNiche Biotech | FTVS05 | Ce bioréacteur utilise un contrôleur, une cuve en verre de 5 L et des assesseurs. Un tube de perfusion spécial est disponible. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L) | CytoNiche Biotech | R020-10-10 | Il s’agit d’un kit de tubulure standard adapté au bioréacteur 3D vivaSPIN 15 L, contenant des sacs de prélèvement. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L) | CytoNiche Biotech | R020-05-10 | Il s’agit d’un kit de tubulure standard adapté au bioréacteur 3D vivaSPIN 5 L, contenant des sacs de prélèvement. |
| 3D TableMicrocarriers Trix G02 | CytoNiche Biotech | G02-10-10g | Ces microsupports poreux et dégradables sont adaptés à la culture cellulaire HEK293T. Ils sont pré-stérilisés en 10 g/bouteille avec des tubes C-Flex pour le soudage sur des tubes sur des bioréacteurs. |
| 3D TableMicrocarriers Trix V01 | CytoNiche Biotech | V01-100-10g | Ces microsupports poreux et dégradables conviennent à la culture cellulaire adhérente, ils se présentent sous forme de microsupports non stérilisés qui doivent être autoclavés dans du PBS avant d’être utilisés. Ils sont particulièrement adaptés à la production de vaccins. |
| 3D TableTrix microcarriers W01 | CytoNiche Biotech | W01-10-10g (emballage à usage unique) ; W01-200 (comprimés) | Ces microsupports poreux et dégradables conviennent à la culture cellulaire adhérente, en particulier aux cellules qui doivent être récoltées comme produits finis. Ils sont pré-stérilisés en 10 g/bouteille avec des tubes C-Flex pour le soudage sur des tubes sur des bioréacteurs. Le produit a obtenu 2 qualifications pour les excipients pharmaceutiques de la CDE, avec les numéros d’enregistrement de [F20200000496 ; F20210000003]. Il a également reçu la qualification DMF pour les excipients pharmaceutiques de la FDA, avec le numéro d’enregistrement de [DMF :35481] |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | Utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité MSC |
| Calcein-AM/PI Double Staining Kit | Dojindo | C542 | Le kit de double coloration Calcein-AM/PI est utilisé pour la coloration par fluorescence simultanée des cellules viables et mortes. Ce kit contient des solutions de Calcein-AM et d’iodure de propidium (PI), qui colorent respectivement les cellules viables et mortes. |
| Bouchon pour EZ Top Fermetures de récipients pour récipients NALGENE (500mL) | Saint-Gobain | CAP-38 | Les marques et les numéros de catalogue ne sont que par exemple, des produits similaires sont disponibles auprès de différents fournisseurs et tant qu’ils ont la même fonctionnalité, les articles peuvent être remplacés par d’autres marques. |
| Tube C-Flex, Formulation 374 (0,25 po x 0,44 po) | Saint-Gobain | 374-250-3 | Utilisé pour le soudage et la déconnexion des tubes. |
| Sac de congélation CryoMACS 50 | Miltenyi Biotec ; | 200-074-400 | Utilisé pour l’extension du 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill& Kit de consommables de finition. |
| Sulfate de diméthyle (DMSO) ; | Sigma | D2650-100mL | Utilisé pour la préparation de la solution de cryoconservation. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | BasalMedia | L120KJ | Utilisé pour la culture de cellules HEK293T et Vero. |
| DURAN Original GL 45 Bouteille de laboratoire (2 L) | DWK life sciences | 218016357 | Utilisée pour la collecte des déchets du bioréacteur de 5 L. |
| DURAN Original GL 45 Bouteille de laboratoire (5 L) | DWK life sciences | 218017353 | Utilisée pour la collecte des déchets du bioréacteur de 15 L. |
| DURAN Original GL 45 Flacon de laboratoire (500 mL) | DWK life sciences | 218014459 | Utilisé pour flacon supplémentaire de 0,1 M NaOH. |
| Fermetures de récipients EZ Top pour conteneurs NALGENE (500mL) | Saint-Gobain | EZ500 ML-38-2 | Les marques et les numéros de catalogue ne sont que par exemple, des produits similaires sont disponibles auprès de différents fournisseurs et tant qu’ils ont les mêmes fonctionnalités, les articles peuvent être remplacés par d’autres marques. |
| Sérum fœtal bovin (FBS) de qualité supérieure | Wisent | 086-150 | Utilisé pour la culture de cellules HEK293T. |
| Anticorps anti-CD14 humain FITC | BioLegend | 301804 | Utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité des CSM. |
| L’anticorps anti-CD34 humain FITC | BioLegend | 343504 | utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité des CSM. |
| L’anticorps anti-CD90 humain (Thy1) FITC | BioLegend | 328108 | utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité des CSM. |
| Cytométrie en flux | Beckman Coulter | CytoFLEX | Utilisé pour l’évaluation de l’identité cellulaire. |
| Analyseur de cellules à fluorescence | Alit life science | Countstar Rigel S2 | Utilisé pour le comptage cellulaire. La viabilité cellulaire peut être calculée par coloration avec des colorants AO/PI. |
| GL 45 Connecteur multiport Bouchon à vis avec 2 ports ; | Les | marques et les numéros de catalogue ne sont que des produits similaires 292632806 différents fournisseurs et, tant qu’ils ont les mêmes fonctionnalités, les articles peuvent être remplacés par d’autres marques. | |
| Glucomètre | Sinocare | 6243578 | Utilisé pour détecter la concentration de glucose dans le milieu de culture cellulaire et le surnageant. |
| La solution saline équilibrée de Hank (HBSS), avec du calcium et du magnésium | Gibco | 14025092 | Utilisée pour la préparation de la solution de digestion. |
| Albumine humaine 20 % Behring (HSA) | CSL Behring | N/A | Utilisé pour la préparation du tampon de lavage. |
| Microscope à fluorescence inversée | OLYMBUS | CKX53SF | Utilisé pour l’observation et l’imagerie de champ de fluorescence et de fluorescence. |
| Cylindre doseur Nalgene (500 mL) | Thermo Scientific | 3662-0500PK | Utilisé pour calibrer la vitesse volumique de manipulation des liquides des pompes péristaltiques. |
| Sérum de veau nouveau-né (NBS) superfin | MINHAI BIO | SC101.02 | Utilisé pour la culture des cellules Vero. |
| Kit de différenciation et de caractérisation adipogénique des cellules souches mésenchymateuses humaines | OriCell Cyagen | HUXUC-90031 | Utilisé pour la différenciation tri-lignée des hUCMSCs. |
| Kit de différenciation et de caractérisation chondrogénique des cellules souches mésenchymateuses humaines | OriCell Cyagen | HUXUC-90041 | Utilisé pour la différenciation tri-lignées des hUCMSCs. |
| Kit de différenciation et de caractérisation ostéogénique des cellules souches mésenchymateuses humaines | OriCell Cyagen | HUXUC-90021 | Utilisé pour la différenciation tri-lignée des hUCMSCs. |
| L’anticorps PE anti-humain CD105 | BioLegend | 800504 | utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité des CSM. |
| Anticorps PE anti-CD19 humain | BioLegend | 302208 | Utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité des CSM. |
| Anticorps CD73 (Ecto-5'-nucléotidase) humain | PE BioLegend | 344004 | utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité des CSM. |
| Anticorps HLA-DR humain anti-PE | BioLegend | 307605 | Utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité des CSM. |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Wisent | 311-010-CL | Utilisé dans l’autoclave des récipients en verre et des microsupports V01, et le remplacement du milieu de culture. |
| Tube sanitaire en silicone durci au platine Sani-Tech (0,13 po x 0,25 po) | Saint-Gobain | ULTRA-C-125-2F | Utilisé pour le transfert de solution entraîné par des pompes péristaltiques. |
| Saline stérile | Hopebiol | HBPP008-500 | Utilisé pour la préparation du tampon de lavage. |
| Trypzyme Recombinant Trypsin | BasalMedia | S342JV | Ce réactif est utilisé pour le transfert de bille à bille des cellules HEK293T et Vero. |
| Scelleuse de tubes | Yingqi Biotech | Scelleuse de tubes I | Cette scelleuse est compatible avec les tubes C-Flex et les tubes en PVC. |
| Soudeuse de tubes pour tubes en PVC | Soudeuse de tubes Chu | Biotech | Utilisé pour le soudage de tubes en PVC. |
| Soudeuse de tubes pour tubes TPE | Yingqi Biotech | I-V2 | Utilisée pour le soudage de tubes TPE. |
| La | Nexcelom | CS2-0106-25mL | , utilisant de l’orange acridine (AO) et de l’iodure de propidium (PI), est la méthode recommandée pour une analyse précise de la viabilité des cellules primaires, telles que les PBMC, et des cellules souches dans les échantillons contenant des débris. |
Références
- Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
- Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
