Cartographie de la distribution cellulaire d’une protéine optogénétique à l’aide d’une grille de stimulation lumineuse

Résumé

Ce protocole implique la transfection de capteurs d’AMPc et de bPAC-nLuc, une protéine optogénétique, pour suivre avec précision sa distribution cellulaire et sa réponse à la stimulation lumineuse. L’approche novatrice consistant à créer une carte de réponse à l’AMPc à l’aide d’un système de balayage ponctuel offre le potentiel de faire progresser la recherche sur les protéines optogénétiques dans différents domaines.

Résumé

Notre objectif était de suivre avec précision la distribution cellulaire d’une protéine optogénétique et d’évaluer sa fonctionnalité à un endroit cytoplasmique spécifique. Pour y parvenir, nous avons co-transfecté des cellules avec des capteurs d’AMPc à cible nucléaire et notre protéine optogénétique développée en laboratoire, l’adénylyl cyclase-nanoluciférase photoactivable bactérienne (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, lorsqu'il est stimulé avec de la lumière de 445 nm ou des substrats de luciférase, génère de l'adénosine 3',5'-monophosphate cyclique (AMPc). Nous avons utilisé un illuminateur laser à semi-conducteurs connecté à un système de balayage ponctuel qui nous a permis de créer un motif de grille/matrice de petits points éclairés (~1 μm²) dans tout le cytoplasme des cellules HC-1. Ce faisant, nous avons été en mesure de suivre efficacement la distribution des bPAC-nLuc à visée nucléaire et de générer une carte d’intervention complète du cAMP. Cette carte représentait avec précision la distribution cellulaire de bPAC-nLuc, et sa réponse à la stimulation lumineuse variait en fonction de la quantité de protéines dans le spot éclairé. Cette approche novatrice contribue à l’élargissement de la gamme de techniques disponibles pour l’étude des protéines optogénétiques cellulaires. La capacité de cartographier sa distribution et sa réponse avec une grande précision a un potentiel considérable et pourrait faire progresser divers domaines de recherche.

Introduction

L’optogénétique, née comme un outil qui a révolutionné les neurosciences, est aujourd’hui un domaine de recherche en plein essor et une technologie en plein essor couramment utilisée par de nombreux laboratoires dans le monde entier et dans divers domaines de recherche en biologie. Nous avons développé bPAC-nLuc, une protéine optogénétique polyvalente, en fusionnant une adénylyl cyclase (AC) sensible à la lumière de Beggiatoa sp. (adénylyl cyclase photoactivable bactérienne ; bPAC) à la nanoluciférase (nLuc)^1,2,3. Lorsqu'il est stimulé par la lumière bleue, le bPAC produit le deuxième messager, l'adénosine monophosphate cyclique 3',5' (AMPc). nLuc est une petite luciférase récemment développée qui, en présence de l’un de ses substrats, peut générer une bioluminescence et activer la production d’AMPc⁴. Ainsi, cette protéine optogénétique peut être activée transitoirement en utilisant de brèves impulsions lumineuses ou régulièrement avec de la furimazine ou d’autres substrats de la luciférase, ce qui nous permet d’imiter différents modèles de signalisation de l’AMPc et d’évaluer les réponses cellulaires (activation des facteurs de transcription, expression des gènes, prolifération cellulaire, migration, etc.). Les progrès récents dans la signalisation du 2e messager ont souligné l’importance des événements se produisant dans des régions cytosoliques très restreintes (par exemple, la production endosomale d’AMPc pour la phosphorylation de la protéine de liaison à l’élément de réponse à l’AMPc (CREB) ou les microdomaines Ca²⁺ pour la translocation du facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) vers le noyau)^5,6. Par conséquent, il est important de développer des stratégies cohérentes et systématiques pour évaluer, imiter et bloquer la signalisation de ces compartiments dans les cellules vivantes. Pour montrer la capacité de bPAC-nLuc à être spécifiquement activé dans différents compartiments cellulaires, nous avons co-transfecté une lignée cellulaire dérivée de l’hépatome (HC-1) avec le bPAC-nLuc à cible nucléaire et H208, un capteur cAMP de transfert d’énergie de résonance (FRET) de Förster (NLS-bPAC-nLuc ; NLS-H208). Les cellules HC-1 qui dérivent de la gamme HTC sont dépourvues d’activité AC dosable, ce qui se traduit par de très faibles niveaux basaux d’AMPc, ce qui la rend idéale pour mesurer la production présumée d’AMPc tout en tirant parti de la plage dynamique complète des capteurs FRET^7,8. À l’aide d’un laser à semi-conducteurs (445 nm, LDI-7, 89 North) connecté à un système de balayage ponctuel (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), nous décrivons un protocole permettant de stimuler systématiquement de très petites zones circulaires ou taches (~1 μm²) à l’intérieur de cellules individuelles. Le système de balayage ponctuel était connecté à l’un des ports arrière d’un microscope à deux étages, ce qui nous a permis de stimuler les cellules et d’effectuer des mesures FRET simultanément via un trajet lumineux indépendant. Nous présentons une méthode dans ce protocole où le logiciel SysCon Geo, fourni avec le système de stimulation par Rapp OptoElectronic, est utilisé pour effectuer un balayage complet du cytoplasme des cellules. L’approche consiste à générer une carte de réponse à l’AMPc en mettant en place une séquence d’illuminations qui stimulent les cellules dans un motif de grille (Figure 1).

Protocole

1. Culture cellulaire HC-1 et préparation pour l’imagerie

1. Maintenir les cellules HC-1 dans du DMEM complétées par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), de la pénicilline (100 UI/L), de la streptomycine (100 mg/L) et de la L-glutamine dans des boîtes de 10 cm et incubées à 37 °C, 5 % de CO₂, dans de l’air humidifié à 95 %.
2. Passez les cellules tous les 2 à 4 jours une fois que les cellules sont confluentes à ~90 % en utilisant des dilutions de 1:5 ou 1:10.
3. Cellules germes pour la transfection sur lamelles de verre 2 jours avant l’expérience.
   1. En travaillant dans des conditions stériles dans une hotte de culture tissulaire avec un milieu préchauffé et du PBS, aspirez le milieu d’une boîte de cellules presque confluente et lavez-le délicatement avec 5 ml de PBS.
   2. Aspirez le PBS et ajoutez 1 mL de trypsine. Incuber à 37 °C pendant 3 à 5 minutes jusqu’à ce que les cellules se soient détachées.
   3. Remettre les cellules en suspension dans 4 mL de milieu et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL.
   4. Utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules et calculer la densité cellulaire.
   5. Diluer les cellules à une densité de 1,5 x 10⁴ cellules/mL.
   6. Pipeter 2 mL de la suspension cellulaire sur des lamelles en verre de 25 mm avec revêtement en poly-D-lysine dans une boîte à 6 puits.
   7. Incuber les cellules pendant environ 24 h dans un incubateur jusqu’à 70 % de confluence.
4. Transfectez les cellules à l'aide d'un kit de transfection en suivant les instructions du fabricant en utilisant un rapport de 0,25 μg d'ADN NLS-bPAC-nLuc / 0,75 μg d'ADN NLS-H208 par 3 μL de réactif de transfection et 2 μL de réactif P3000 dilué dans un milieu Opti-MEM dépourvu de rouge de phénol.
5. Placez les cellules dans l’incubateur pendant ~48 h pour permettre une expression suffisante de bPAC-nLuc, essentielle pour produire des niveaux détectables d’AMPc.
   REMARQUE : Le niveau minimum requis d’expression de bPAC-nLuc variera en fonction de la puissance du système de stimulation et des paramètres de la stimulation.
6. Préparer les cellules sur des lamelles pour l’imagerie.
   1. Aspirez le support d’un puits et lavez-le deux fois avec 2 ml de PBS.
   2. Soulevez délicatement la lamelle à l’aide d’une pince et placez-la dans la chambre d’imagerie.
   3. Ajouter 1 mL d’Opti-MEM sans rouge de phénol dans la chambre d’imagerie. Les cellules peuvent également être imagées en HBSS ou dans toute autre solution physiologique compatible avec la fluorescence.

2. Simulation de lumière et imagerie de cellules vivantes

1. Effectuer la culture cellulaire et la manipulation de cellules exprimant NLS-bPAC-nLuc dans un environnement sombre. Pour éviter l’exposition à des longueurs d’onde <500 nm, utilisez une lampe rouge (Table des matériaux) avec une ampoule à fluorescence compacte ambrée de 13 W (Table des matériaux).
2. Réalisez des expériences dans un microscope motorisé à deux étages (Table des matériaux) équipé d’un moteur lumineux multi-LED à 6 lignes (Table des matériaux), d’une roue à filtres d’émission (Table des matériaux), d’une platine XY (Table des matériaux), d’une caméra numérique CMOS ORCA-Fusion (Table des matériaux) et d’un objectif à huile 100x/1.4 NA (∞/0.17/FN26.5). Capturer des images à l’aide d’un logiciel de microscopie numérique (Table des matières). Cette configuration est capable de stimuler les cellules et d’effectuer simultanément des mesures FRET en utilisant un trajet optique indépendant équipé d’un filtre dichroïque ZT458rdc (Table des matériaux).
   REMARQUE : Toute configuration d’acquisition peut être utilisée si elle permet une stimulation optogénétique simultanée et une imagerie FRET/intensiométrique avec un capteur compatible.
3. Activez le géosystème UGA - 42. Allumez le microscope et configurez-le avec les paramètres appropriés pour l’acquisition avec le capteur FRET H208. La configuration de l’acquisition dépendra des niveaux d’expression du capteur FRET. Les paramètres typiques sont un temps de simulation de 40 ms pour YFP/mScarletI, une puissance LED de 15 % et 0,5 Hz.
4. Ouvrez le logiciel SysCon et le logiciel d’imagerie qui contrôle le microscope.
5. Dans la fenêtre Caméra, sélectionnez l’onglet Étalonnage et choisissez la longueur d’onde laser compatible avec la protéine optogénétique. Pour stimuler bPAC-nLuc, utilisez une longueur d’onde de 445 nm.
6. Calibrez le système avant chaque utilisation. Ceci est important car de petites variations dans la configuration, ou même des changements de température ambiante (RT), peuvent altérer la précision de la stimulation.
7. Dans la fenêtre de l’appareil photo, sélectionnez l’onglet Appareil photo et cliquez sur < Démarrer l’acquisition > pour démarrer l’acquisition à partir du logiciel d’imagination.
8. Dans la fenêtre Image Viewer, visualisez une acquisition en direct ou antérieure de la fluorescence des cellules prélevées à partir du logiciel d’imagerie, qui guidera le positionnement des objets de stimulation.
9. Utilisez le mode Click and Fire pour évaluer rapidement la réactivité d’une cellule individuelle avant de commencer l’expérience.
10. À l’aide de la fenêtre du gestionnaire de séquences, sélectionnez pour créer un nouveau sequence.
    REMARQUE : pour vérifier le bon calibrage du système, dessinez différentes formes et tailles dans la fenêtre du visualiseur d’images. Ceux-ci doivent correspondre précisément aux modèles de stimulation projetés sur les cellules, assurant un alignement précis avec le design prévu.
11. Dans la fenêtre du visualiseur d’images , sélectionnez l’icône Rond dans la barre d’outils de gauche pour dessiner des objets de stimulation circulaires.
12. Créez plusieurs petits cercles identiques et répartissez-les uniformément pour assurer la couverture homogène de l’ensemble du cytoplasme des cellules à stimuler.
13. Faites un clic droit sur chacun d’eux pour vérifier l’homogénéité des objets de stimulation circulaires. Une fenêtre apparaîtra ; Utilisez-le pour examiner leur rayon, leur position, etc.
14. Réglez le rayon entre 1 et 5, en fonction de l’objectif utilisé et de la taille de la cellule.
15. Pour faciliter l’espacement et l’alignement réguliers des cercles, utilisez le bouton dans la sous-fenêtre Affichage. De plus, définissez les propriétés de la grille à l’aide du bouton .
16. Assurez-vous que la grille ou la matrice d’objets de stimulation circulaires régulièrement espacés recouvre entièrement la cellule et que sa taille (par exemple, 6 x 6 ou 10 x 10) est déterminée par la taille de la cellule. Pour contrôler la stimulation nulle qui ne devrait pas déclencher d’événements cellulaires, incluez des cercles positionnés à l’extérieur de la cellule.
17. Chaque objet créé dans la fenêtre du visualiseur d’images apparaît dans la fenêtre Chronologie.
    1. Dans la sous-fenêtre Synchronisation des objets, configurez les propriétés temporelles de chaque objet de stimulation (heure de début, durée, délai).
    2. Dans la sous-fenêtre Lightsource, configurez la longueur d’onde et l’intensité de chaque objet. Pour ce protocole, assurez-vous que chaque objet utilise la même longueur d’onde et qu’il est identique en durée et en intensité. L’heure de début sera différente pour chaque objet, et le délai entre eux peut être variable en fonction du résultat attendu pour éviter de superposer l’effet de différentes stimulations.
18. Dans la fenêtre Chronologie, modifiez l’ordre dans lequel chaque objet de stimulation sera activé si nécessaire. Configurez les stimulations selon un schéma régulier (par exemple, de gauche à droite, de haut en bas) ou selon un modèle aléatoire, en fonction de l’expérience particulière.
19. Téléchargez la séquence dans le système et configurez le nombre de cycles de séquence (exécutions) que le système effectuera.
20. Placez les régions d’intérêt (ROI) dans le logiciel d’imagerie aux positions souhaitées.
21. Commencez à acquérir des images de fluorescence avec le microscope et appuyez sur < Play > sur la fenêtre UGA-42.

3. Analyse des données

1. Bien que le logiciel fourni par le système de stimulation permette d’enregistrer des séquences pour une utilisation ultérieure, il n’enregistre pas les informations réelles de l’expérience. Par conséquent, documentez méticuleusement tous les détails liés aux points de stimulation et aux séquences utilisés pendant l’expérience, y compris les paramètres tels que la position, l’intensité, la durée, le nombre de courses, etc. Documenter toute autre condition expérimentale pertinente, comme des agents pharmacologiques ou des solutions spécifiques.
2. Au cours de l’expérience, positionnez les zones d’intérêt désignées sur le logiciel d’imagerie pour capturer les changements d’intensité de fluorescence de l’ensemble de la cellule ou d’emplacements spécifiques à l’intérieur des cellules.
3. Portez une attention particulière au positionnement des zones d’intérêt par rapport aux points de stimulation. Mesurez les changements d’intensité de fluorescence à l’intérieur ou à l’extérieur des zones stimulées. Ajustez les positions des ROI après l’expérience, en fournissant le logiciel d’imagerie pour permettre d’enregistrer les images acquises pendant l’expérience et pas seulement les valeurs d’intensité du ROI.

Résultats

Les résultats présentés dans la Figure 1 montrent que seules les stimulations dirigées vers le noyau cellulaire ont permis de générer des augmentations mesurables du taux de CAMP. Ceci confirme que NLS-bPAC-nLuc est exprimé exclusivement dans le compartiment nucléaire des cellules HC-1. Il est possible de stimuler précisément une protéine optogénétique en utilisant ce motif de grille/matrice afin de cartographier sa distribution intracellulaire. De plus, les ...

Discussion

L’objectif de cette étude était de suivre précisément la distribution intracellulaire d’une protéine optogénétique et d’évaluer ses performances au sein d’un compartiment cytoplasmique particulier. Nous avons également montré les capacités de stimulation précises d’un système de balayage ponctuel sur des cellules exprimant une protéine optogénétique. Pour y parvenir, nous avons utilisé un bPAC-nLuc à cible nucléaire avec des niveaux d’expression élevés mais une distribution très confinée limitée au noyau. Les résultats o...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ampoule à fluorescence compacte ambrée 13 W - Faibles lumières bleues	Développements photoniques  ;
3-Isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX)	Sigma	I7018
6-lignes multi-LED Lumencor Spectra X	Lumencor  ;		Moteur d’éclairage multi-LED à 6 lignes  ;
Corning - DMEM  ;	Thermo Fischer	MT10013CMEA
Corning - Sérum bovin fœtal régulier	Thermo Fischer	MT35011CV
Lunettes de protection : cercles	Thermo Fischer	12545102P
GBX-2 dark red safelight filter 5.5"  ;	Kodak	1416827	Lampe de sécurité rouge   ;
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) 10x	Thermo Fischer	14185052	Dilué à 1x, pH ajusté
LDI-7	89 North
L-Glutamine	Thermo Fischer	BW17605E
Lipofectamine 3000  ;	Thermo Fischer	L3000001	Kit de transfection
Olympus IX83 motorisé à deux étages  ; microscope  ;	Olympus		;
Opti-MEM, sans rouge de phénol	Thermo Fischer	11058021
caméra CMOS numérique ORCA-fusion.	Hamamatsu	C14440-20UP
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)	Thermo Fischer	15140122
Solution tamponnée au phosphate (1x)	Lonza	17516F
Roue à filtres à émission préalable et jeux de filtres	Prior Scientific, Inc.		Roue à filtres d’émissions  ;
Préalable  ; Proscan XY stage	Prior Scientific, Inc.		Stade XY  ;
Diaporama 6	Innovations en imagerie intelligente Logiciel		microscopie numérique
Logiciel SysCon	Logiciel		Logiciel fourni par le système de stimulation  ;
UGA-42  ; Géo  ;	Rapp OptoElectronic
UPlanSApo 100x	Olympus		100x/1.4 NA objectif à huile (&infin ;/0.17/FN26.5)
ZT458rdc dichroic  ;	Chroma Technology Corp		BS, Longueur d’onde (CWL) :  ; 498 milles marins

Microscope motorisé à deux étages de