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Article de méthode

Double immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 dans les lymphocytes périphériques humains

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DOI :

10.3791/65472

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14 juillet 2023

 ,  ,  , 
1Unità di Genetica, Dipartimento di Biologia, University of Pisa, 2Department of Women-Child-Newborn Obstetrics and Gynaecology, Foundation IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente une méthode pour évaluer la formation et la réparation des cassures double brin d’ADN par la détection simultanée des foyers γH2AX et 53BP1 dans les noyaux interphasiques des lymphocytes périphériques humains traités à la bléomycine.

Résumé

Les cassures double brin (DSB) sont l’une des lésions les plus graves qui peuvent survenir dans les noyaux cellulaires et, si elles ne sont pas réparées, elles peuvent entraîner des conséquences graves, y compris le cancer. La cellule est donc dotée de mécanismes complexes pour réparer les DSB, et ces voies impliquent l’histone H2AX sous sa forme phosphorylée à Ser-139 (à savoir γH2AX) et la protéine de liaison p53 1 (53BP1). Comme les deux protéines peuvent former des foyers sur les sites des DSB, l’identification de ces marqueurs est considérée comme une méthode appropriée pour étudier à la fois les DSB et leur cinétique de réparation. Selon les processus moléculaires qui conduisent à la formation des foyers γH2AX et 53BP1, il pourrait être plus utile d’étudier leur co-localisation à proximité des DSB afin de mettre en place une approche alternative permettant de quantifier les DSB par la détection simultanée de deux marqueurs de dommages à l’ADN. Ainsi, ce protocole vise à évaluer les dommages génomiques induits dans les lymphocytes humains par l’agent radiomimétique bléomycine par la présence de foyers γH2AX et 53BP1 dans une double immunofluorescence. En utilisant cette méthodologie, nous avons également délimité la variation du nombre de foyers γH2AX et 53BP1 au fil du temps, comme tentative préliminaire d’étudier la cinétique de réparation des DSB induits par la bléomycine.

Introduction

Les dommages à l’ADN sont continuellement induits par des agents qui peuvent être endogènes, tels que les ROS générés par le métabolisme oxydatif cellulaire, ou exogènes, à la fois chimiques et physiques1. Parmi les lésions les plus nocives, les cassures double brin (DSB) jouent un rôle fondamental en contribuant à l’instabilité génomique, car elles provoquent des aberrations chromosomiques qui peuvent à leur tour initier le processus de cancérogenèse. Ainsi, les cellules sont pourvues de mécanismes complexes et efficaces de réparationDSBs 2.

Lorsqu’un DSB se produit, la cellule déclenche la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) où, avec le complexe MRE11 / RAD50 / NBS1, les kinases ATM ou ATR sont recrutées pour activer d’autres protéines qui ralentissent ou arrêtent le cycle cellulaire3. Une cible essentielle de ces kinases est l’histone H2AX, qui est phosphorylée sur Ser-139 au sein de quelques mégabases issues des DSB (à savoir γH2AX), permettant ainsi le recrutement de plusieurs facteurs de réparation tels que, entre autres, BRCA1 et p53 binding protein 1 (53BP1)3. Plus tard, une voie entre la recombinaison homologue (HR), l’assemblage d’extrémité non homologue (NHEJ) ou le recuit simple brin (SSA) est déclenchée pour réparer les DSB 4,5. Par conséquent, 53BP1 est impliqué dans la dictée du choix entre HR ou NHEJ, favorisant principalement l’activation de NHEJ plutôt que HR6. De plus, la forme phosphorylée de l’histone H2AX et du 53BP1 peut former des foyers sur les sites des DSB. Comme ces foyers persistent jusqu’à ce que l’intégrité du double brin soit restaurée, l’évaluation de l’apparition/disparition des foyers γH2AX ou 53BP1 dans un intervalle de temps est considérée comme une méthode utile pour évaluer l’apparition et la réparation des DSB dans un système cellulaire 6,7. Cependant, selon les processus moléculaires décrits ci-dessus, étant donné que les foyers γH2AX et 53BP1 devraient co-localiser près des DSB au cours de la DDR8,9, il peut être utile de détecter simultanément la présence de ces marqueurs dans une double immunofluorescence.

Ainsi, le but de ce manuscrit était d’évaluer la pertinence de la quantification simultanée des foyers γH2AX et 53BP1 pour évaluer les dommages génomiques induits dans les lymphocytes périphériques humains par l’agent radiomimétique bléomycine. En utilisant la même méthodologie, nous avons également tenté de délimiter la cinétique de réparation des DSB induites par la bléomycine selon une procédure expérimentale précédemment mise en place10.

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Protocole

L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université de Pise, et le consentement éclairé et signé a été obtenu de chaque donneur.

1. Formation des foyers γH2AX et 53BP1

  1. Préparation des échantillons et traitement mutagène
    1. Prélever des échantillons de sang total par ponction veineuse chez des adultes en bonne santé dans des tubes de prélèvement sanguin (p. ex. Vacutainer) contenant de l’héparine de lithium comme anticoagulant.
    2. Afin de garantir une bonne conservation des échantillons de sang, commencez la procédure dans les 24 heures suivant le prélèvement.
    3. Ajouter 300 μL de l’échantillon dans un tube contenant 4,7 mL de milieu complet (0,5 % pénicilline-streptomycine, 0,75 % phytohémagglutinine, 10 % FBS précédemment inactivé, 88,75 % RPMI 1640).
    4. Ajouter ensuite le sulfate de bléomycine à une concentration finale de 5 μg/mL.
      ATTENTION : Le sulfate de bléomycine est un mutagène. Éviter le contact cutané et l’inhalation. Préparer la solution et ajouter l’échantillon sous une hotte.
    5. Pour chaque échantillon, mettre en place un contrôle négatif (absence de mutagène).
    6. Placer le tube dans un thermostat à 37 °C pendant 2 h.
  2. Fixation
    1. Centrifuger les échantillons à 540 x g pendant 5 min à température ambiante.
    2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille avec du vortex.
    3. Ajouter 5 mL de solution hypotonique (2,87 g de KCl dissous dans 500 mL d’eau désionisée) et 400 μL de solution préfixatrice (acide acétique 5:3 : méthanol) pour provoquer l’hémolyse des globules rouges.
    4. Centrifuger les échantillons à 540 x g pendant 5 min à température ambiante.
    5. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 5 mL de méthanol à température ambiante pendant au moins 30 minutes pour fixer les cellules.
    6. Vous pouvez également conserver les cellules à -20 °C jusqu’à utilisation.
  3. Préparation des diapositives
    1. Centrifuger les échantillons à 540 x g pendant 5 min à température ambiante.
    2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 5 mL d’une solution d’acide acétique de méthanol 3:1. Répétez ces étapes une fois de plus.
    3. À la fin, centrifuger à nouveau la solution à 540 x g pendant 5 min à température ambiante.
    4. Aspirer à nouveau le surnageant en laissant suffisamment de solution (0,5 mL) pour remettre en suspension la pastille, pipeter vigoureusement, laisser tomber la pastille de cellule remise en suspension sur les lames et sécher à l’air. Conserver les lames à 4 °C.
  4. Immunofluorescence
    NOTE: L’immunofluorescence est une méthode immunologique d’identification de cibles cellulaires spécifiques à l’aide d’un anticorps primaire liant la cible elle-même et d’un anticorps secondaire fluorescent liant la cible primaire qui permet de localiser la cible11. Dans ce cas, un anti-53BP1 monoclonal de souris (1:50) et un anti-γH2AX polyclonal de lapin (1:50) sont utilisés comme anticorps primaires, tandis que l’anti-souris AlexaFluor568 (1:400) et l’anti-lapin DyLight488 (1:200) sont utilisés comme anticorps secondaires, respectivement.
    1. Lavez les lames deux fois dans 50 ml de 1x PBS pendant 5 min dans un pot de couplin (16 lames dos à dos).
    2. Ensuite, conservez-les pendant 30 min dans une solution de blocage (10 mL de FBS, 10 mL de PBS 10x, 80 mL d’eau désionisée, 300 μL de Triton-X).
    3. Ajouter à chaque lame 10 μL de chacune des deux solutions contenant les anticorps primaires dissous dans la solution bloquante. Couvrir les lames avec du ruban de paraffine et incuber à 4 °C pendant la nuit.
    4. Après l’incubation, effectuer trois lavages en 1x PBS pendant 5 min.
    5. Ajouter à chaque lame 10 μL de chacune des deux solutions contenant les anticorps secondaires dissous dans la solution bloquante. Couvrir les lames avec du ruban de paraffine et incuber à température ambiante pendant 2 h.
    6. Effectuer trois lavages en 1x PBS pendant 5 min.
    7. Ajouter 2,5 μL de solution antidécoloration avec DAPI sur les lamelles de couverture avant l’assemblage pour contre-colorer les noyaux.
      NOTE: Afin d’évaluer la cinétique des foyers, la procédure est la même que celle décrite de 1.1 à 1.4, notant que le prélèvement cellulaire et la double immunofluorescence sont effectués à 0 h, après 2 h de traitement post-bléomycine puis, après avoir retiré le mutagène, à 4 h, 6 h et 24 h après le traitement.

2. Analyse au microscope à fluorescence

REMARQUE: « Microscope à fluorescence » fait référence à tout microscope qui utilise la fluorescence pour générer une image. L’échantillon est éclairé par de la lumière d’une longueur d’onde spécifique (ou de longueurs d’onde) qui est absorbée par les fluorophores, ce qui les amène à émettre de la lumière de longueurs d’onde plus longues12. AlexaFluor568 et DyLight 488 absorbent une lumière d’environ 568 et 488 nm et émettent une lumière de 603 et 520 nm, respectivement. Ainsi, ils sont visibles sous forme de fluorescence rouge ou verte à l’aide d’un filtre TRITC ou FITC, respectivement.

  1. Noter la présence de foyers dans chaque diapositive sous un objectif d’immersion 100x (Figure 1).
  2. Marquez 200 noyaux par lame et comptez le nombre de foyers γH2AX/53BP1 dans chaque noyau.
  3. Exprimer les résultats en termes de nombre moyen de foyers par noyau total marqué. Ceux-ci incluent à la fois les noyaux γH2AX/53BP1 positifs (montrant au moins un signal de fluorescence) et négatifs (ne montrant aucun signal de fluorescence).

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Résultats

Les données obtenues par l’analyse au microscope à fluorescence des lymphocytes périphériques nous permettent d’évaluer trois aspects principaux: l’efficacité du traitement à la bléomycine pour augmenter le nombre de foyers γH2AX et 53BP1 (et donc de DSB) en raison de son effet mutagénique, dans quelle mesure les deux foyers co-localisés sur le site des DSB, et l’évolution temporelle des foyers γH2AX et 53BP1 pour délimiter la cinétique de réparation des DSB induits par la bléomycine. Comme prévu, une fréquence très élev...

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Discussion

L’analyse par immunofluorescence des foyers γH2AX et 53BP1 est une méthode appropriée pour évaluer les dommages génomiques dans les noyaux interphasiques d’un système cellulaire. Cette procédure comporte plusieurs points critiques qui peuvent affecter le résultat des expériences, principalement les agents utilisés dans la fixation et la perméabilisation, le type d’anticorps et leurs facteurs de dilution, ainsi que la concentration du mutagène.

Le maintien de l’intégrité des protéines est fonda...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants aux donneurs de sang total et à tout le personnel de santé qui a prélevé les échantillons de sang.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AlexaFluor 568 chèvre anti-souris IgG (&gamma ; 1)InvitrogenA2112453BP1 anticorps secondaire
BleoprimSanofibléomycine sulfate (mutagène)
Solution de pénicilline-streptomycine 100XEurocloneECB3001Dantibiotiques pour milieu de culture
PBS 10XTermofisher14200075Saline tamponnée au phosphate
FBSEurocloneEC20180LSérum fœtal bovin pour immunofluorescence
Chèvre anti-lapin IgG (H+L) DyLight 488 ConiugatedTermofisher#35552&gamma ; Anticorps secondaire H2AX
Anticorps monoclonal anti-53BP1 de sourisMerckMAB 380253BP1 Anticorps primaire
Labophot 2Nikon Microscope à fluorescence
Histone P H2AX (Ser139) Anticorps de lapinSignalisation cellulaire#2577&gamma ; Anticorps primaire H2AX
PhytohémoagglutinineTermofisherR30852801composant du milieu de culture
Réactif anti-décoloration Prolong Gold avec DAPICell Signaling#8961Solution anti-décoloration avec DAPI pour contre-coloration
RPMI 1640EurocloneECB9006LMilieu de culture
Triton-X100SigmaT9284Détergent non ionique pour perméabilisation

Références

  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853(2020).
  3. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  4. Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
  6. Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
  7. Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
  8. Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617(2017).
  9. Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
  10. Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
  11. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  12. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  15. Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
  16. Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
  17. Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
  18. Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931(2017).
  19. Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
  20. Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
  21. Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77(2019).
  22. Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  23. Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516(2021).
  24. Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
  25. Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).

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