Double immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 dans les lymphocytes périphériques humains

Summary

Ce protocole présente une méthode pour évaluer la formation et la réparation des cassures double brin d’ADN par la détection simultanée des foyers γH2AX et 53BP1 dans les noyaux interphasiques des lymphocytes périphériques humains traités à la bléomycine.

Abstract

Les cassures double brin (DSB) sont l’une des lésions les plus graves qui peuvent survenir dans les noyaux cellulaires et, si elles ne sont pas réparées, elles peuvent entraîner des conséquences graves, y compris le cancer. La cellule est donc dotée de mécanismes complexes pour réparer les DSB, et ces voies impliquent l’histone H2AX sous sa forme phosphorylée à Ser-139 (à savoir γH2AX) et la protéine de liaison p53 1 (53BP1). Comme les deux protéines peuvent former des foyers sur les sites des DSB, l’identification de ces marqueurs est considérée comme une méthode appropriée pour étudier à la fois les DSB et leur cinétique de réparation. Selon les processus moléculaires qui conduisent à la formation des foyers γH2AX et 53BP1, il pourrait être plus utile d’étudier leur co-localisation à proximité des DSB afin de mettre en place une approche alternative permettant de quantifier les DSB par la détection simultanée de deux marqueurs de dommages à l’ADN. Ainsi, ce protocole vise à évaluer les dommages génomiques induits dans les lymphocytes humains par l’agent radiomimétique bléomycine par la présence de foyers γH2AX et 53BP1 dans une double immunofluorescence. En utilisant cette méthodologie, nous avons également délimité la variation du nombre de foyers γH2AX et 53BP1 au fil du temps, comme tentative préliminaire d’étudier la cinétique de réparation des DSB induits par la bléomycine.

Introduction

Les dommages à l’ADN sont continuellement induits par des agents qui peuvent être endogènes, tels que les ROS générés par le métabolisme oxydatif cellulaire, ou exogènes, à la fois chimiques et physiques¹. Parmi les lésions les plus nocives, les cassures double brin (DSB) jouent un rôle fondamental en contribuant à l’instabilité génomique, car elles provoquent des aberrations chromosomiques qui peuvent à leur tour initier le processus de cancérogenèse. Ainsi, les cellules sont pourvues de mécanismes complexes et efficaces de réparation^{DSBs 2}.

Lorsqu’un DSB se produit, la cellule déclenche la r....

Protocol

L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université de Pise, et le consentement éclairé et signé a été obtenu de chaque donneur.

1. Formation des foyers γH2AX et 53BP1

1. Préparation des échantillons et traitement mutagène
   1. Prélever des échantillons de sang total par ponction veineuse chez des adultes en bonne santé dans des tubes de prélèvement sanguin (p. ex. Vacutainer) contenant de l’héparine de lithium comme anticoagulant.
   2. Afin de garantir une bonne conservation des échantillons de sang, commencez la procédure dans les 24 heures suivant le prélèvement.
   3. Ajouter 300....

Results

Les données obtenues par l’analyse au microscope à fluorescence des lymphocytes périphériques nous permettent d’évaluer trois aspects principaux: l’efficacité du traitement à la bléomycine pour augmenter le nombre de foyers γH2AX et 53BP1 (et donc de DSB) en raison de son effet mutagénique, dans quelle mesure les deux foyers co-localisés sur le site des DSB, et l’évolution temporelle des foyers γH2AX et 53BP1 pour délimiter la cinétique de réparation des DSB induits par la bléomycine. Comme prévu, une fréquence très élev.......

Discussion

L’analyse par immunofluorescence des foyers γH2AX et 53BP1 est une méthode appropriée pour évaluer les dommages génomiques dans les noyaux interphasiques d’un système cellulaire. Cette procédure comporte plusieurs points critiques qui peuvent affecter le résultat des expériences, principalement les agents utilisés dans la fixation et la perméabilisation, le type d’anticorps et leurs facteurs de dilution, ainsi que la concentration du mutagène.

Le maintien de l’intégrité des protéines est fonda.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlexaFluor 568 chèvre anti-souris IgG (&gamma ; 1)	Invitrogen	A21124	53BP1 anticorps secondaire
Bleoprim	Sanofi		bléomycine sulfate (mutagène)
Solution de pénicilline-streptomycine 100X	Euroclone	ECB3001D	antibiotiques pour milieu de culture
PBS 10X	Termofisher	14200075	Saline tamponnée au phosphate
FBS	Euroclone	EC20180L	Sérum fœtal bovin pour immunofluorescence
Chèvre anti-lapin IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated	Termofisher	#35552	&gamma ; Anticorps secondaire H2AX
Anticorps monoclonal anti-53BP1 de souris	Merck	MAB 3802	53BP1 Anticorps primaire
Labophot 2			Nikon Microscope à fluorescence
Histone P H2AX (Ser139) Anticorps de lapin	Signalisation cellulaire	#2577	&gamma ; Anticorps primaire H2AX
Phytohémoagglutinine	Termofisher	R30852801	composant du milieu de culture
Réactif anti-décoloration Prolong Gold avec DAPI	Cell Signaling	#8961	Solution anti-décoloration avec DAPI pour contre-coloration
RPMI 1640	Euroclone	ECB9006L	Milieu de culture
Triton-X100	Sigma	T9284	Détergent non ionique pour perméabilisation