Observation de la fonction systolique d’oreillettes droites isolées chez des cobayes

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode efficace de dépistage de médicaments qui améliorent la contractilité myocardique en utilisant des oreillettes droites isolées de cobayes.

Résumé

L’insuffisance cardiaque chronique (ICC) fréquente se caractérise par une altération du remplissage ventriculaire et/ou de la fonction d’éjection, ce qui entraîne un débit cardiaque insatiable et une incidence accrue. Le déclin de la fonction systolique cardiaque est un facteur clé de la pathogenèse de l’ICC. La fonction systolique est simplement le remplissage du sang oxygéné dans le ventricule gauche, suivi du pompage du sang dans tout le corps pendant un battement cardiaque. Un cœur faible et l’incapacité du ventricule gauche à se contracter correctement pendant les battements cardiaques indiquent une mauvaise fonction systolique. De nombreuses herbes traditionnelles ont été suggérées pour renforcer la fonction systolique du cœur chez les patients. Cependant, il n’existe toujours pas de méthodes expérimentales stables et efficaces pour le dépistage des composés qui améliorent la contractilité myocardique dans le processus de recherche en médecine ethnique. Ici, en prenant l’exemple de la digoxine, un protocole systématique et standardisé est fourni pour le dépistage des composés qui améliorent la contractilité myocardique en utilisant des oreillettes droites isolées de cobayes. Les résultats ont montré que la digoxine pouvait améliorer considérablement la contractilité de l’oreillette droite. Ce protocole systématique et standardisé est destiné à servir de référence méthodologique pour le dépistage des principes actifs des médicaments ethniques dans le traitement de l’ICC.

Introduction

L’insuffisance cardiaque est causée par un infarctus du myocarde, une myocardiopathie, une surcharge hémodynamique, une inflammation et d’autres causes de lésions myocardiques, qui modifient l’anatomie et l’activité du myocarde et, finalement, entraînent une défaillance du pompage ou du remplissage ventriculaire. Les palpitations, la fatigue et la rétention d’eau sont les principaux symptômes cliniques^{primaires 1}. L’ICC est une insuffisance cardiaque chronique qui peut se maintenir, se détériorer ou présenter une décompensation au fil du temps, et son incidence et sa prévalence augmentent avec l’âge^{de 2} ans. Le déclin de la fonction systolique cardiaque est un facteur clé dans la pathogenèse de la CHF³. Le traitement médical actuel de la maladie implique principalement l’utilisation de médicaments antihypertenseurs tels que les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine, les β-récepteurs adrénergiques (qui inhibent l’activation excessive du système neurohormonal, à savoir le système sympathique et le système rénine-angiotensine-aldostérone), ou les diurétiques (qui réduisent la congestion⁾⁴. Cependant, les signes cliniques de l’insuffisance cardiaque causée par une réduction du débit et de la réserve cardiaques ne sont pas souvent abordés dans les études examinant l’impact de ces traitements médicaux⁵.

Les médicaments inotropes positifs sont conçus pour augmenter la contractilité myocardique. Les glycosides cardiaques, les inhibiteurs de la phosphodiestérase et les agonistes des récepteurs β-adrénergiques sont utilisés comme médicaments inotropes positifs pour traiter l’insuffisance cardiaque. Les glycosides cardiaques sont principalement des dérivés de la digitaline ; par exemple, la digoxine, qui est le dérivé de la Digitalis le plus utilisé et qui est dérivé de la Digitalis lanata (digitale blanche)⁶. Ils se lient sélectivement à la Na⁺/K⁺-ATPase sur la membrane cellulaire pour augmenter la concentration intracellulaire de calcium et, ainsi, améliorer la contractilité cardiaque et le volume systolique sans augmenter l’apport en oxygène, améliorant ainsi l’efficacité cardiaque⁷. Mis à part les glycosides cardiaques, la plupart des médicaments inotropes positifs, tels que les inhibiteurs de la phosphodiestérase et les agonistes des récepteurs β-adrénergiques, augmentent la fréquence cardiaque et la consommation d’oxygène myocardique tout en augmentant la charge de calcium dans les cellules myocardiques pour améliorer la contractilité myocardique, ce qui peut entraîner des arythmies et une hypotension cliniquement graves et, par conséquent, une augmentation de la mortalité⁸. Par conséquent, l’application clinique de ces médicaments inotropes est limitée. Afin d’éviter les complications causées par des taux élevés de calcium intracellulaire, il est nécessaire de développer des modulateurs inotropes plus sûrs et très efficaces pour le traitement de l’ICC (Figure 1).

Au cours des dernières décennies, de nombreuses études ont été menées pour générer et analyser des composés capables de soutenir les propriétés inotropes positives de l’hémodynamique cardiaque. De nombreuses médecines traditionnelles chinoises (MTC), telles que Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth., Apocynum venetum L. et Sophora alopecuroides L., entre autres, peuvent améliorer la contractilité myocardique ^9,10,11. Des études ont prouvé que la MTC et ses monomères actifs peuvent exercer des effets inotropes positifs par des mécanismes différents de ceux des médicaments inotropes. Par exemple, le liguzinediol, une forme de ligustrazine méthylée en_C2 et_C5 (un ingrédient actif du rhizome de livèche du Sichuan), qui améliore considérablement la contractilité des cœurs de rat isolés en augmentant les transitoires calciques du réticulum sarcoplasmique sans augmenter la fréquence cardiaque, peut avoir moins d’effets secondaires et constituer un meilleur traitement pour^{CHF 12}. De plus, la matrine est un alcaloïde extrait de la plante MTC Sophora flavescens Ait. Matrine peut inhiber la régulation positive de l’expression de la protéine_3-AR β et diminuer l’expression d’eNOS chez les rats modèles d’insuffisance cardiaque, améliorant ainsi leur contractilité myocardique¹³. Cependant, dans la recherche en médecine ethnique, il y a un manque de méthodes expérimentales stables et efficaces pour cribler les composés qui peuvent améliorer la contractilité myocardique.

Il est bien connu que, par rapport à d’autres rongeurs, les cochons d’Inde ont des caractéristiques d’électrophysiologie et de manipulation du calcium qui sont plus similaires à celles des humains¹⁴. D’une part, l’électrocardiogramme des cobayes est suffisamment similaire à celui des humains, et leur manipulation battement à battement Ca²⁺ est plus proche de la physiologie humaine que celle des rats ou des souris^15,16. D’autre part, les modèles informatiques de cardiomyocytes de cobaye ont fait l’objet de recherches approfondies et incluent des sous-systèmes cellulaires cruciaux, notamment l’énergie et le métabolisme des espèces réactives de l’oxygène¹⁷. Par conséquent, les oreillettes droites isolées des cobayes sont largement utilisées pour cribler les composés qui améliorent la contractilité myocardique. Ici, nous prenons l’exemple de la digoxine pour fournir un protocole systématique et standardisé pour le dépistage de composés qui améliorent la contractilité myocardique en utilisant des oreillettes droites isolées de cobayes. Par conséquent, ce travail fournit une référence méthodologique pour le criblage des principes actifs des médicaments ethniques dans le traitement de l’ICC.

Protocole

Le protocole expérimental a été mené conformément aux exigences du Comité d’utilisation des animaux de laboratoire et du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine du Ningxia. Des cobayes Dunkin-Hartley mâles pesant 300 à 450 g ont été utilisés pour la présente étude. L’effet de la digoxine sur la contractilité a été observé dans des oreillettes droites isolées de cobayes (Figure 2).

1. Préparation à l’oxygénation pour les oreillettes droites isolées des cobayes

1. Préparez les instruments expérimentaux, y compris un système d’acquisition et de traitement du signal biologique, un transducteur de force musculaire JH-2, un bain Magnus, un crochet de ventilation en forme de L, des ciseaux épais, une boîte de Pétri, de la paraffine, etc. (voir Tableau des matériaux).
2. Préparez 1 000 ml de solution de Krebs-Henseleit (solution K-H) en ajoutant 7,02 g de NaCl (120,0 mM), 2,10 g de NaHCO₃ (25,0 mM), 0,30 g de KCl (4,0 mM), 0,07 g de MgSO₄ (0,6 mM), 0,07 g de NaH₂PO₄ (0,6 mM), 0,28 g de CaCl₂ (2,5 mM) et 1,98 g de glucose (11,0 mM) dans 1 000 mL d’eau bidistillée, et rincez le bain Magnus deux à trois fois (voir le tableau 1 et le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Maintenez la température de la solution K-H à 37 °C ± 1 °C.
3. Préparez 100 ml de solution K-H à faible teneur en calcium en ajoutant 0,70 g de NaCl (120,0 mM), 0,21 g de NaHCO₃ (25,0 mM), 0,03 g de KCl (4,0 mM), 0,01 g de MgSO₄ (0,6 mM), 0,01 g de NaH₂PO₄ (0,6 mM), 0,01 g de CaCl₂ (0,8 mM) et 0,20 g de glucose (11,0 mM) dans 100 mL d’eau bidistillée (voir le Tableau 1 et le Tableau des matériaux).
4. Placer environ 20 mL de la solution K-H à 37 °C dans le bassin de fonctionnement (voir le tableau des matériaux).
5. Étalez 5 mm de paraffine épaisse sur le fond de la boîte de Pétri, puis remplissez la boîte de Pétri avec la solution K-H à 37 °C (voir tableau des matériaux).
6. Installez le crochet de ventilation en forme de L à l’extrémité du tube en latex de la vessie, placez-le dans la boîte de Pétri et ajustez-le à 1-2 bulles/s (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Ajustez lentement les bulles ; Si l’action est trop rapide, l’oxygène peut rapidement s’épuiser.

2. Préparation d’oreillettes droites isolées de cobayes

1. Pesez les cochons d’Inde sur une balance (voir le tableau des matériaux).
2. Induisez l’anesthésie à l’aide d’une boîte d’induction avec 5 % d’isoflurane dans 100 % d’oxygène, puis passez à un cône nasal avec 1,5 % à 3 % d’isoflurane pour l’entretien (voir le tableau des matériaux).
3. Coupez l’artère carotide avec des ciseaux grossiers, et induisez l’exsanguination avant de la placer sur une assiette. Ensuite, à l’aide de ciseaux, ouvrez le thorax (en commençant par le processus xiphoïde et en séparant complètement les côtés pour exposer le cœur) et décollez le péricarde.
   1. Tenez le cœur avec la main gauche, utilisez la main droite pour couper le cœur à partir de la racine de l’aorte et placez-le rapidement dans le bassin de fonctionnement avec la solution K-H. Enfin, appuyez doucement sur le ventricule avec la main deux à trois fois, pressez le sang ventriculaire et placez le cœur dans la boîte de Pétri.
      REMARQUE : L’action doit être rapide et terminée en 2 à 5 minutes, et la température doit être contrôlée à 35 °C. La température de la solution K-H doit être contrôlée à 37 °C.
4. Fixez l’extrémité du cœur à la boîte de Pétri enrobée de paraffine à l’aide d’une aiguille tout en apportant de l’oxygène (60 bulles/min).
5. Identifiez l’oreillette droite.
   REMARQUE : Chez les cobayes, les oreillettes sont séparées sur leur face ventrale par l’artère pulmonaire et dorsalement par l’aorte. Les oreillettes gauche et droite sont attachées aux ventricules comme un « triangle inversé », et l’oreillette droite est légèrement plus petite que l’oreillette gauche et a des bords inégaux. Le myocarde du ventricule droit est mince et l’extrémité supérieure du collapsus est l’oreillette droite ; le ventricule gauche est plus gonflé et la distribution des vaisseaux coronaires est riche¹⁸ (Figure 3).
6. Soulevez doucement le bord de l’oreillette droite à l’aide d’une pince ophtalmique et coupez le long de la jonction auriculo-ventriculaire (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Évitez d’endommager le nœud sino-auriculaire et essayez de couper plus près du ventricule tout en coupant le long de la jonction auriculo-ventriculaire. Une contraction rythmique automatique de l’oreillette droite peut être observée dans cette étape.
7. Utilisez des sutures chirurgicales 4-0 (voir le tableau des matériaux) pour ligaturer le haut et le bas de l’oreillette droite, respectivement (les deux extrémités de la « ligne diagonale »), avec une extrémité bouclée et l’autre extrémité laissée avec une longue extrémité de fil qui est également bouclée.
   REMARQUE : Essayez de ligaturer autant de tissus que possible lorsque vous ligaturez les deux extrémités de la « ligne diagonale » des oreillettes.

3. Mesure et enregistrement de la fonction systolique d’oreillettes droites isolées de cobayes

1. Allumez l’ordinateur et entrez dans le système d’acquisition et de traitement du signal biologique (voir le tableau des matériaux). Ajustez le gain (50 mV), la constante de temps (DC), le filtre (20 Hz) et la vitesse de balayage (1,00 s/div) après avoir déterminé le canal de connexion (premier canal, tension).
2. Accrochez une extrémité de l’échantillon sur le crochet de ventilation en forme de L avec la boîte de Pétri et l’oxygène à côté du bain Magnus. Accrochez l’autre extrémité de l’échantillon sur le transducteur de force musculaire JH-2 (voir le tableau des matériaux).
3. Observez la courbe systolique auriculaire, ajustez la précharge à 0,5-1,0 g et attendez qu’elle se stabilise (environ 30 min).
   REMARQUE : Changez la solution K-H toutes les 20 min. Lorsqu’elle est normale, prendre la courbe observée comme norme et marquer « normal ». Si l’écran est scanné un peu rapidement, cela doit être ralenti.
4. Administrer 0,2 mL de solution K-H à faible teneur en calcium et observer pendant 5 minutes jusqu’à ce que la courbe ne diminue plus.
5. Administrer 0,2 mL de digoxine à 5 % (voir le tableau des matériaux), observer pendant 5 min, laver trois fois, puis revenir à la normale.
   REMARQUE : Marquez l’administration. Lorsque l’effet est évident, balayez l’écran plus rapidement. Lorsque la courbe ne monte plus, c’est-à-dire lorsque l’amplitude de contraction n’augmente plus, laver trois fois rapidement ; Sinon, une arythmie se produira, ce qui affectera les résultats des expériences de drogue ultérieures.
6. Collectez les données et enregistrez-les sur une disquette.

Résultats

Une diminution de la contractilité myocardique entraîne un débit cardiaque insuffisant, ce qui conduit à une ICC (Figure 1). Ce protocole a permis d’enregistrer les effets de différents médicaments sur la fonction systolique d’oreillettes droites isolées de cobayes, puis de cribler rapidement des composés de médicaments ethniques qui améliorent la contractilité myocardique. Après avoir connecté l’oreillette droite, le transducteur de force musculaire JH-2 et le système d’acquisition et de tr...

Discussion

L’activité rythmique normale du cœur nécessite un environnement physique et chimique approprié, tout comme l’activité des oreillettes droites isolées. Les oreillettes droites isolées sont isolées de l’innervation du corps et de l’influence directe des facteurs humoraux systémiques, ce qui signifie que des changements dans l’activité des oreillettes droites lors du changement des médicaments auxquels ils sont exposés peuvent être observés. Les causes fondamentales de l’activité bioélectri...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Suture chirurgicale 4-0	Yangzhou  ; Fuda  ; Médical  ; Dispositifs  ;Co.,  ;
5 % Digoxine (soluble dans le sulfoxyde de diméthyle)	TCI Shanghai	D1828	CAS : 20830-75-5 ; Pureté : >96.0 %
BL-420N système d’acquisition et de traitement du signal biologique	Chengdu Tai Meng Software Co., Ltd	1700142S
CaCl2	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24110	CAS : 10043-52-4 ; Pureté : 96 %
Glucose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S11022	CAS : 50-99-7 ; Purité : 99 %
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22-16
JH-2 transducteur de force musculaire	Institut de génie médical aérospatial, Pékin, Chine
KCl  ;	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24120	CAS : 7447-40-7 ; Pureté : 99.5 %
Bain Magnus	Shanghai Future Experimental Equipment Co., Ltd	L046525
MgSO4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24253	CAS : 7487-88-9 ; Pureté : 98 %
NaCl  ;	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24119	CAS : 7647-14-5 ; Pureté : 99.5 %
NaH2PO4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24161	CAS : 7558-80-7 ; Pureté : 99 %
NaHCO3	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24153	CAS : 144-55-8 ; Pureté : 99,8 %
Bassin de fonctionnement	Guangzhou Telekuan Medical Instrument Co., Ltd		305 mm x 230 mm
Pince ophtalmique	Suzhou  ; Shuanglu  ; Médical  ; Instrument  ;Co.,  ;
Ciseaux opératoires ophtalmiques	; Suzhou  ; Shuanglu  ; Médical  ; Instrument  ;Co.,  ;
Paraffine	, Leica Biosystems  ;
Boîte de Pétri	Corning	430167	100 mm x 20 mm
Appareil d’anesthésie pour rongeurs	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd		Type ABS (monocanal)
Échelle	Shanghai Yueping Scientific Instrument Co., Ltd	YP1002
Plaque chirurgicale	; Zhengzhou  ; Ketai  ; Expérience  ; Équipement  ;Co.,  ;		21 cm x 31 cm
Ciseaux à tissus	Suzhou  ; Shuanglu  ; Médical  ; Instrument  ;Co.,  ; Ltd	SL0023