Un modèle de cryoblessure pour étudier la régénération des muscles squelettiques du pédoncule caudal chez le poisson-zèbre adulte

Chez les vertébrés, les parties endommagées de divers tissus subissent un renouvellement homéostatique et une restauration au cours de la vie. Cette capacité de renouvellement et de restauration dépend typiquement de la présence de cellules souches compétentes ou de la capacité de prolifération des cellules matures ^1,2. Le muscle squelettique comprend des myofibres post-mitotiques, qui sont associées à des cellules souches locales, appelées cellules satellites 3,4,5,6. Ainsi, ce tissu contient des sources cellulaires pour l’étanchéité efficace des zones de continuité interrompue ou pour la réparation de plaies mineures. Cependant, des pertes volumétriques plus importantes dans le muscle squelettique des mammifères sont souvent suivies d’une réparation non régénérative, telle que la fibrose⁷. Les modèles animaux pourraient fournir de nouvelles informations sur les mécanismes biologiques qui favorisent la régénération des organes gravement endommagés.

Le poisson zèbre est un organisme modèle bien établi doté d’une grande capacité de régénération. Le poisson-zèbre adulte peut régénérer une partie amputée de sa nageoire caudale ou l’apex réséqué du ventricule cardiaque 8,9,10,11. En outre, une méthode de cryolésion a déjà été appliquée pour étudier la régénération des nageoires et du cœur chez le poisson zèbre^12,13,14,15. Dans le cas des organes internes, la méthode de cryolésion a l’avantage d’induire la mort cellulaire sans perturber l’intégrité de l’organe, imitant ainsi les conditions physiologiques^16,17. Les débris tissulaires sont désintégrés par clairance naturelle pendant la cicatrisation de la plaie, suivie des processus de réparation. Cependant, il reste à déterminer si cette méthode pourrait être appliquée au muscle squelettique.

Chez les poissons, la musculature latérale permet la flexion latérale du tronc pendant la nage¹⁸. Les muscles squelettiques sont organisés en unités métamères, appelées myomères, qui sont séparées par le tissu conjonctif ^5,19. Le poisson zèbre peut régénérer son muscle après des perturbations tissulaires mineures, telles que celles causées par l’ablation au laser ou une blessure par arme blanche 20,21,22,23,24^, mais on ne sait pas si des myomères entiers peuvent se régénérer après une blessure importante. Cette lacune dans les connaissances est probablement due à l’absence d’un modèle de blessure approprié. Ce protocole établit une nouvelle approche pour induire une lésion étendue du muscle squelettique, couvrant plusieurs myomères. La méthode de cryolésion décrite est basée sur la congélation et la décongélation rapides des myofibres avec un instrument en acier inoxydable prérefroidi. Malgré les dégâts importants, le bien-être du poisson n’a pas été gravement altéré. Des myomères entiers pourraient être restaurés et, ainsi, ce travail fournit un nouveau système modèle pour étudier les mécanismes de régénération musculaire chez le poisson zèbre adulte.

Cette étude a été menée en accord avec toutes les réglementations éthiques pertinentes. Les poissons-zèbres ont été élevés, élevés et entretenus conformément aux directives²⁵ de la Fédération européenne des associations européennes de science des animaux de laboratoire (FELASA). Le logement des animaux et toutes les procédures expérimentales ont été approuvés par l’office vétérinaire cantonal de Fribourg, en Suisse.

1. Équipement et configuration

1. Organiser la production d’une cryosonde en acier inoxydable dans un atelier technique pouvant fabriquer des instruments de recherche.
   REMARQUE : Fournissez une conception de l’instrument avec les dimensions spécifiques (Figure 1A).
2. Pour éviter les engelures lors de la manipulation de la sonde pendant la procédure, insérez la poignée dans l’embout d’une pipette et enveloppez-la avec du ruban adhésif.
3. Préparez un bécher pour la solution de travail d’anesthésie, une cuillère pour manipuler le poisson, une éponge humide et un réservoir avec de l’eau du système pour permettre au poisson de récupérer après la procédure.
4. Préparez la solution de travail fraîchement avant chaque expérience. Pour préparer la solution de travail, ajouter 4 mL de solution mère de Tricaïne à 100 mL d’eau du système dans un bécher.
   REMARQUE : La solution mère d’anesthésie consiste en 4 g de tricaïne dissous dans 980 mL d’eau distillée. Après avoir ajusté le pH à 7 avec 1 M Tris-HCl, pH 9, remplir la solution à 1 L avec de l’eau distillée. La solution mère est sensible à la lumière et doit être conservée à 4 °C dans une bouteille ambrée.

2. Procédure de cryolésion musculaire

1. Commencez la procédure en immergeant la sonde dans de l’azote liquide pendant au moins 3 minutes. Mouillez l’éponge dans l’eau du système et placez-la sur une surface plane.
2. Transférer un seul poisson zèbre adulte dans la solution de travail Tricaine et confirmer son absence de réponse en touchant doucement le poisson avec la cuillère après 1 min ou 2 min. Si le poisson est toujours réactif, attendez un peu plus longtemps.
3. Placez le poisson anesthésié sur l’éponge humide. Localisez le pédoncule caudale postérieur à la nageoire anale et antérieur à la nageoire caudale.
4. Retirez la cryosonde de l’azote liquide. Secouez doucement la sonde pour vous assurer qu’il ne reste pas d’azote liquide résiduel sur l’extrémité.
5. Placer le bord de la spatule perpendiculairement au corps sur le pédoncule caudale (figure 1C). Maintenez la sonde dans cette position pendant 6 s sans appliquer de pression (figure 1D).
   NOTE: Le poids de la cryosonde est suffisant pour assurer le contact entre l’instrument et le tissu.
6. Libérez la cryosonde du tissu et transférez le poisson dans le réservoir avec de l’eau du système.
7. Surveillez le poisson pendant qu’il reprend sa respiration et sa natation après s’être réveillé de l’anesthésie. Si aucun mouvement operculaire ne se produit après 30 s, stimuler le poisson en pipetant l’eau du système dans les branchies jusqu’à ce que l’animal commence à respirer par lui-même.
   NOTE: Le poisson devrait reprendre la nage dans quelques minutes dans le bassin de récupération.
   NOTE: Dans les jours suivants, les poissons peuvent être filmés pour surveiller leur activité de nage (Vidéo 1 et Vidéo 2). Avant l’enregistrement vidéo, transférez le contrôle et les poissons blessés dans un bassin d’accouplement translucide et laissez-les s’habituer pendant au moins 1 min.

3. Collection et fixation du pédoncule caudale

1. Préparer 2 ml de formol à 4 % ou un autre fixateur qui convient aux essais suivants, une boîte de Pétri, des pinces et des ciseaux chirurgicaux.
2. Euthanasier le poisson à un moment donné après la cryoblessure conformément à l’autorisation légale donnée par le bureau vétérinaire régional.
   REMARQUE : L’euthanasie est réalisée par surdosage de solution de tricaïne (300 mg/L) pendant environ 10 minutes. La perte du mouvement des branchies et le réflexe de pincement de la nageoire caudale confirment la mort. Les points temporels de l’euthanasie doivent être choisis en fonction de la phase de régénération : par exemple, de 1 jour post-cryolésion (dpci) à 3 dpci pour le nettoyage de la plaie ; de 3 dpci à 10 dpci pour l’initiation de la régénération musculaire; de 10 dpci à 30 dpci pour la régénération progressive; et après 30 DPCI pour l’achèvement de la restauration tissulaire. Ainsi, pour évaluer les différentes étapes et processus biologiques de la dégénérescence et de la régénération musculaires, des groupes de poissons doivent être euthanasiés à différents moments après la cryoblessure.
3. Placez le poisson euthanasié dans une boîte de Petri contenant de l’eau désionisée. Utilisez des ciseaux pour effectuer une coupure à travers le corps antérieur et postérieur au pédoncule caudale (Figure 1E). Laissez le tissu saigner dans l’eau désionisée de la boîte de Pétri.
4. Recueillir le pédoncule caudale et le transférer avec une pince dans la solution fixatrice préparée dans un tube microcentrifugeux.
   NOTE: Retourner soigneusement les tubes plusieurs fois et les conserver toute la nuit à 4 ° C.

4. Montage du pédoncule caudale

1. Lavez le tissu fixe dans 1x PBS pendant 10 min sur une bascule. Ensuite, transférez-le dans un tube microcentrifuge de 2 ml avec du saccharose pré-refroidi à 30% dans de l’eau désionisée à 4 ° C et inversez doucement le tube plusieurs fois. Laisser les tubes de microcentrifugation pendant au moins 24 h à 4 °C en position verticale.
   REMARQUE: Le pédoncule caudale flottera sur la solution de saccharose et commencera à couler à mesure que le tissu se déshydrate.
2. Remplissez un moule d’encastrement avec une couche de 5 mm de support de montage O.C.T. Utilisez une pince pour ajuster le pédoncule caudale dans le milieu. Placez-le au bas du moule et ajustez son orientation pour les sections transversales ou coronales (Figure 1F).
3. Laissez le milieu geler dans une boîte de glace sèche. Dès que le tissu est stabilisé dans la position désirée, remplissez le reste du moule avant que l’O.C.T. ne gèle complètement. Conservez le moule pendant au moins 1 h à −80 °C.
   REMARQUE: Dans ces conditions, les tissus peuvent être conservés pendant plusieurs mois.

5. Découper les sections avec un cryostat

1. Installez un cryostat d’une épaisseur de coupe de 25 μm. Régler la température de la chambre à −26 °C, la température de l’échantillon à −24 °C et l’angle de coupe à 12 °C.
2. Placez le bloc congelé avec l’échantillon dans le cryostat et fixez son orientation afin de couper parallèlement au fond du bloc. Couper jusqu’à ce que vous atteigniez l’échantillon, puis couper le bloc pour faciliter le prélèvement de l’échantillon.
3. Préparez six lames d’adhérence. Étiquetez les lames avec des numéros consécutifs afin de préparer des répétitions de l’échantillon.
4. Commencez à couper et collectez les sections de tissu sur les lames d’adhérence étiquetées. Organisez les sections sur les diapositives selon les demandes expérimentales ultérieures.
5. Laissez sécher les lames pendant 1 h à température ambiante. Conservez-les dans des boîtes fermées à −20 °C.
   REMARQUE: Les lames peuvent être stockées en toute sécurité dans cet état jusqu’à 1 an.

Surveillance des poissons après cryoblessure
Pour déterminer l’effet de la cryolésion myomère sur les animaux, un enregistrement vidéo des poissons témoins et cryoblessés 1 jours après la cryoblessure (dpci) et 5 dpci a été réalisé. Chaque groupe contenait cinq poissons. À 1 dpci, les poissons cryoblessés nageaient moins activement, mais ils ne présentaient aucun mouvement anormal, tel que tourbillonnement, convolution ou équilibre réduit (vidéo 1). Dans le système d’élevage, leur position dans l’aquarium et leur apport alimentaire étaient similaires à ceux des poissons non blessés. Le comportement normal a persisté tout au long des jours suivants, comme en témoigne la vidéo à 5 dpci (vidéo 2). En conclusion, la procédure de cryoblessure du pédoncule caudale n’a pas gravement affecté le bien-être des animaux.

Analyse histologique des coupes du pédoncule caudal
Pour évaluer l’étendue de la blessure, le point temporel de 4 dpci a été sélectionné, car c’est à ce moment que les débris de myofibres ont été complètement résorbés dans la plaie. Pour analyser les effets de la cryolésion le long des axes dorso-ventral et antéro-postérieur du corps, deux groupes de poissons ont été utilisés (c.-à-d. les sections coronales et transversales du pédoncule caudal, respectivement) (figure 1F).

Les coupes ont été analysées par coloration trichrome composée de bleu d’aniline, de fuchsine acide et d’orange G (AFOG). En utilisant cette combinaison de réactifs, les muscles intacts ont été montrés en orange, la moelle épinière en rouge foncé et la matrice collagène en bleu. Pour déterminer le nombre de myomères endommagés, qui sont les unités métamères de la musculature du poisson, une série de sections a été analysée (Figure 2). Les limites des myomères, appelées myocommata, ont été identifiées par dépôt de collagène, détectées par coloration bleue. Les zones endommagées ont été déterminées par l’absence de coloration orange. Un examen plus approfondi des échantillons présentant des myocommata évidents a révélé qu’environ quatre myomères consécutifs étaient endommagés, comme le déduit l’absence de coloration orange (n, nombre de poissons = 4; Figure 3A,A'). Le côté indemne du même poisson a servi de référence interne.

Pour examiner la profondeur de la plaie perpendiculaire à l’axe du corps, des coupes transversales ont été préparées à l’aide de poisson-zèbre à 4 dpci et 7 dpci. Ce dernier point de temps correspond à l’activation du programme myogénique et, par conséquent, au début de la régénération musculaire. La coloration AFOG de ces spécimens a montré une absence importante de coloration orange dans le flanc cryoblessé du corps, délimitant la zone de muscle squelettique dégénéré (Figure 3B, C). À 4 dpci et 7 dpci, la zone de la plaie s’étendait des tissus de la peau vers le septum vertical. Cela démontre que la méthode de cryolésion ciblait profondément une moitié latérale du pédoncule caudal, qui est resté dépourvu de muscle fonctionnel pendant 7 jours après la procédure. Pris ensemble, quatre myomères ont été profondément endommagés d’un côté du pédoncule caudal.

Analyse d’immunofluorescence des sections transversales
Pour évaluer la dynamique de la régénération musculaire, des groupes expérimentaux de poissons ont été euthanasiés à 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci et 30 dpci. Les sections transversales du pédoncule caudale ont été marquées par coloration par fluorescence multicolore à l’aide de phalloïdine (qui se lie à l’actine filamenteuse [F-actine]), d’anticorps Tropomyosin-1, qui détecte une protéine sarcomère, et de DAPI, qui marque les noyaux. À tous les moments, la moitié non blessée du corps assurait un contrôle interne; la F-actine et la tropomyosine 1 ont été fortement détectées dans les parties témoins non blessées, indiquant que les tissus n’étaient pas endommagés (figure 4).

À 4 dpci, le côté blessé du pédoncule caudal contenait d’abondantes cellules DAPI positives, mais peu ou pas d’immunofluorescence F-actine et Tropomyosine 1 a été observée, indiquant la zone de la plaie avec des muscles dégénérés (Figure 4A-B'). À 7 dpci, la tropomyosine 1 et la F-actine ont pu être détectées dans une partie de la plaie proche de la ligne médiane verticale du corps (Figure 4C-D'). Ce modèle d’expression délimite la position où la formation de nouvelles myofibres commence dans le pédoncule caudal. À 10 dpci, les deux marqueurs musculaires se sont dilatés vers la surface du corps, suggérant une régénération progressive du muscle squelettique (Figure 4E-F'). À 30 dpci, les deux côtés du corps présentaient une distribution similaire de la coloration F-actine (Figure 4G-H'). Cette découverte indique que le muscle squelettique a été efficacement restauré après la cryoblessure du pédoncule caudal.

Figure 1 : Configuration expérimentale pour la cryolésion myomère. (A) Dimensions de la cryosonde fabriquée sur mesure en acier inoxydable. La partie distale de l’instrument consiste en une spatule avec un bord concave à la profondeur de 1 mm pour tenir compte de la courbure du corps du poisson zèbre. La partie centrale de l’outil comprend un cylindre qui fonctionne comme un poids et un réservoir pour maintenir la basse température de la spatule pendant la procédure. L’extrémité proximale de l’instrument se présente sous la forme d’une fine poignée métallique. (B,C) Poisson adulte anesthésié sur une éponge humide avec la cryosonde sur le pédoncule caudal. La sonde était à température ambiante. (B) La marge de la sonde est placée horizontalement à proximité du pédoncule caudale pour indiquer la taille relative entre le poisson et l’outil. (C) En cas de cryolésion, la pointe de l’outil est positionnée perpendiculairement au poisson. (D) Illustration schématique de la procédure de cryolésion du côté ventral du poisson pour montrer les manipulations de manière globale. La cryosonde a été prérefroidie dans de l’azote liquide et immédiatement placée sur un côté du poisson pendant 6 s. (E) À un moment précis après la cryoblessure, les poissons ont été euthanasiés et leurs pédoncules caudales ont été prélevés pour la fixation. (F) Le matériau fixé a été traité histologiquement et sectionné le long des plans coronal ou transversal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse histologique des myomères endommagés dans le pédoncule caudal, de la position dorsale à la position ventrale du corps. Coloration AFOG d’une série de coupes coronales 4 jours après la cryolésion (dpci). Les sections vont de la face dorsale vers le côté ventral, comme indiqué sur le dessus du premier et du dernier panneau. Les sections ne sont pas adjacentes, avec un intervalle d’environ 150 μm entre elles. Le muscle non blessé est détecté par une coloration orange du muscle, tandis que le tissu blessé n’a pas cette coloration et apparaît grisâtre (zone entourée d’une ligne pointillée). Les tissus contenant du collagène, tels que la peau, sont colorés en bleu. La moelle épinière apparaît comme une structure en forme de bâtonnet et est colorée en rouge. Nombre de poissons, n = 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Évaluation de la profondeur de la blessure dans le pédoncule caudal à l’aide de la coloration AFOG. (A,A') La section coronale est au niveau de la moelle épinière (une tige horizontale colorée en rouge). L’image du bas montre une zone agrandie entourée d’un cadre dans l’image supérieure. Les limites myomères séquentielles apparaissent sous forme de bandes collagènes (bleues) positionnées obliquement par rapport à la moelle épinière (flèches rouges dans l’image agrandie A'). (B,C) Les coupes transversales montrent le flanc non blessé avec des muscles colorés en orange et le flanc cryoblessé avec une coloration grisâtre. La zone endommagée est entourée d’une ligne pointillée noire. Le septum vertical (représenté par une ligne pointillée rouge) subdivise le corps en côtés témoins et cryoblessés. Nombre de poissons, n = 4 par point temporel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Détection immunofluorescente des protéines musculaires après cryolésion. Coloration par fluorescence de sections transversales à 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci et 30 dpci, comme indiqué sur le côté gauche et le haut des panneaux (A-B'). À 4 dpci, le tissu blessé (entouré de la ligne pointillée) est DAPI-positif (bleu) mais dépourvu de coloration à la phalloïdine (vert) ou d’immunoréactivité de la tropomyosine-1 (rouge), suggérant une dégénérescence des fibres musculaires après cryolésion. (C-D') À 7 dpci, les deux marqueurs musculaires émergent progressivement dans la zone blessée, indiquant le processus de régénération. La tropomyosine-1 semble plus intense que la F-actine dans les fibres nouvellement formées. (E-F') À 10 dpci, la zone de lésion est remplie de nouvelles myofibres qui présentent une intensité plus élevée d’immunoréactivité de la tropomyosine-1 par rapport à la F-actine. (G-H') À 30 dpci, un motif similaire de myofibres est détecté des deux côtés du corps. Les cadres des panneaux A, C, E et H englobent les zones qui sont agrandies dans les images adjacentes à droite. Les écailles dermiques, émanant de fluorescence à l’extérieur du myomère, ont été effacées des images à l’aide d’Adobe Photoshop. Nombre de poissons, n = 4 par point temporel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.