Essai validable de réaction en chaîne de polymérase numérique par gouttelettes pour la détection de vecteurs viraux adéno-associés dans des études de bioexcrétion de larmes

Les définitions de la thérapie génique varient, mais induisent généralement une alternance permanente intentionnelle et souvent attendue d’une séquence d’ADN spécifique du génome cellulaire pour modifier ou manipuler l’expression d’un gène ou pour altérer les propriétés biologiques d’une cellule vivante dans un but clinique ^1,2. Les vecteurs viraux sont de plus en plus utilisés comme véhicules pour la thérapie génique en raison de leur efficacité de transduction, un rapport suggérant que plus de 70% des essais cliniques actuels de thérapie génique utilisent des vecteurs viraux³. L’intérêt pour les vecteurs viraux pour la thérapie génique n’a cessé de croître. Le rapport trimestriel sur les données trimestrielles du trimestre 4 2022 sur le paysage de la thérapie génique, cellulaire et ARN de l’American Society of Gene and Cell Therapy a indiqué qu’en 2022, le pipeline de thérapies géniques, cellulaires et ARN de la préclinique à la pré-inscription a augmenté de 7%, portant le nombre total de thérapies en développement à 3 726, dont 2 053 (55%) étaient des thérapies géniques⁴. La Food and Drug Administration des États-Unis (FDA) a actuellement approuvé 27 thérapies cellulaires et géniques à usage clinique chez l’homme, dont cinq utilisent spécifiquement des vecteurs viraux⁵.

Les virus adéno-associés (AAV) ont acquis un intérêt particulier en tant que véhicules de thérapie génique. Une méta-analyse récente a révélé qu’il y a eu environ 136 essais cliniques portant sur l’utilisation des AAV au cours des deux dernières décennies⁶. De plus, trois des cinq thérapies géniques approuvées par la FDA des États-Unis sont basées sur l’AAV. Cela est dû à leur nature hautement modifiable, à leur large gamme d’hôtes qui peut être ajustée en fonction de l’utilisation de vecteurs naturels spécifiques ou artificiels, à leur faible pathogénicité et toxicité chez l’homme et à leur faible immunogénicité^{générale 7,8}. Les AAV ont également été utilisés avec succès pour traiter des maladies oculaires dans un cadre clinique approuvé. Voretigene neparvovec-rzyl est un traitement à base d’AAV2 qui a été approuvé par la FDA des États-Unis en 2017 et par l’Agence européenne des médicaments (EMA) en 2018 pour traiter la dystrophie rétinienne biallélique associée à la mutation RPE65 ⁹.

L’intérêt croissant pour le développement de thérapies à base d’AAV s’accompagne de la nécessité d’une orientation réglementaire sur les essais. La détection et la quantification précises de tout vecteur viral font partie intégrante des phases de découverte, de fabrication et de tests précliniques / cliniques du développement du produit. La FDA des États-Unis a commencé à publier des lignes directrices pour les thérapies géniques, notamment sur la chimie, la fabrication et le contrôle des demandes de nouveaux médicaments expérimentaux en thérapie génique humaine 10, le suivi à long terme après l’administration de la thérapie génique 11, les tests de rétrovirus compétents en matière de réplication¹² et les recommandations pour les vecteurs microbiens utilisés dans les thérapies géniques ¹³. L’EMA a également publié une série de lignes directrices concernant le développement de produits de thérapie génique qui s’alignent généralement sur les recommandations de la FDA, bien que certaines différences existent¹⁴. Il est important de noter que, bien que ces lignes directrices n’établissent pas de responsabilités juridiquement exécutoires, sauf lorsque des règlements spécifiques sont mentionnés, elles clarifient la pensée actuelle des organismes de réglementation sur le sujet et leurs attentes en matière d’essais requis pour les dépôts de médicaments et l’approbation réglementaire.

La FDA recommande spécifiquement que des études soient menées pour évaluer la distribution, la persistance et la clairance d’un vecteur du site d’administration pour cibler les tissus oculaires et non oculaires, les liquides intraoculaires et le sang¹⁵. Celles-ci prennent la forme d’études de biodistribution et d’excrétion. Les études de biodistribution évaluent l’exposition en étudiant comment un produit est répandu dans le corps d’un patient à partir du site d’administration. L’excrétion évalue spécifiquement la libération du produit du patient dans l’environnement et soulève la possibilité de transmission du vecteur à des individus non traités¹⁶. La FDA formule des recommandations pour la conception d’études de biodistribution et d’excrétion en ce qui concerne la fréquence de prélèvement des échantillons, la durée du prélèvement des échantillons, les types d’échantillons prélevés et les conditions d’entreposage.

En outre, la FDA recommande l’utilisation de la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR, ou PCR en temps réel) pour la détection quantitative des génomes de vecteurs en raison de sa facilité de performance, de son format à haut débit, de ses délais d’exécution rapides et de sa sensibilité au test. Cependant, il y a un manque relatif de recommandations pour la conception et l’évaluation de la performance des méthodes moléculaires par rapport à celles qui existent pour les petites et grandes molécules. Bon nombre des lignes directrices pour de telles études sont difficiles à appliquer aux méthodes moléculaires en raison de la conception unique et complexe des produits et des essais eux-mêmes, ce qui soulève des questions quant à la pertinence des plateformes disponibles pour les évaluations recommandées et les méthodes appropriées pour la validation des essais. À ce jour, la FDA n’a pas exigé la validation formelle des tests basés sur la PCR, bien que l’EMA ait imposé cette exigence¹⁷. À la lumière de ce vide, différents groupes et ateliers ont publié des livres blancs et des recommandations que les fabricants et les organismes de recherche sous contrat ont cherché à suivre 18,19,20,21,22,23,24,25. La plupart de ces recommandations sont rédigées spécifiquement avec les tests qPCR à l’esprit, avec des suggestions ou des modifications pour les plateformes émergentes, telles que la PCR numérique par gouttelettes (ddPCR), incluses uniquement lorsque cela est jugé pertinent. Des recommandations plus récentes se sont concentrées sur les considérations pour les tests de ddPCR, mais se sont largement concentrées sur leurs applications à la quantification du génome vectoriel dans un contexte de fabrication plutôt que dans les matrices biologiques complexes rencontrées dans les études de bioexcrétion.

Selon l’application clinique et les objectifs, la ddPCR peut être préférée à la qPCR à l’appui des études de biodistribution et d’excrétion en raison de la sensibilité accrue de la ddPCR et de sa capacité à gérer l’interférence matricielle par rapport à la qPCR. En outre, grâce à la répartition des échantillons en environ 20 000 gouttelettes, une quantification précise du nombre de copies peut être obtenue sans utiliser de courbe standard utilisant les statistiques de Poisson, ce qui simplifie le développement et la validation de la méthode. L’objectif de ce protocole est de décrire une approche normalisée pour le développement et la validation d’une méthode basée sur la ddPCR pour la détection des vecteurs AAV dans les larmes prélevées sur la surface oculaire à l’appui des études cliniques de bioexcrétion.

1. Préparation d’un fragment d’ADN synthétique

1. Concevoir et commander un fragment d’ADN synthétique contenant la région d’amplification cible pour une utilisation comme contrôle de la qualité.
   1. Assurez-vous que la séquence contient toute la séquence d’amplicon de l’amorce avant à l’amorce inverse du gène cible d’intérêt, avec une extension de quatre à six paires de bases de séquence aux extrémités 5' de chaque séquence de liaison à l’amorce.
   2. Évitez les homopolymères d’adénine et de thymine supérieurs à 12 paires de bases ou les paires de bases guanine et cytosine supérieures à huit paires de bases, car les homopolymères longs peuvent interférer avec la synthèse du fragment de gène.
      NOTE: Si les amplicons contiennent de telles séquences, des substitutions de bases peuvent être effectuées tant que les sites de recuit des amorces et des sondes sont maintenus.
   3. Vous pouvez également préparer un plasmide linéarisé contenant l’amplicon en utilisant des stratégies de clonage typiques.
2. Centrifuger le tube contenant le fragment d’ADN synthétique dans une microcentrifugeuse pendant ~10 s pour s’assurer que le matériau est recueilli au fond du tube.
3. Resuspendre le fragment d’ADN synthétique à l’aide d’un tampon tris-EDTA (TE) à une concentration de 1,0 × 10^{à 10} copies/μL, ou selon le cas, en fonction de la plage d’essai cible.
4. Vortex brièvement, puis incuber à 50 °C pendant 20 ± 5 min. Refroidir sur la glace.
5. Préparer des aliquotes multiples, idéalement à usage unique, et conserver entre -70 et -90 °C jusqu’à utilisation.
   REMARQUE : Les fragments d’ADN synthétique préparés de cette manière sont généralement stables pendant au moins 24 mois à compter de la date de remise en suspension.
6. Si vous le souhaitez, déterminer la concentration exacte du stock d’ADN synthétique préparé avant de l’utiliser comme contrôle de la qualité, ou estimer la concentration nominale en fonction de la remise en suspension utilisée.

2. Préparation des amorces et de la sonde

1. Concevoir et commander des amorces et une sonde d’hydrolyse pour cibler la région d’amplification souhaitée en utilisant des stratégies de conception typiques^26,27.
   1. Utilisez un colorant rapporteur fluorescent de 5' (par exemple, FAM) et un quencher 3' (par exemple, Iowa Black Dark Quencher) compatibles avec le système ddPCR.
      REMARQUE: Il existe de nombreux logiciels de conception de tests PCR et tous peuvent être utilisés. Par exemple, Primer-BLAST du National Center for Biotechnology Information²⁸ est largement utilisé en raison des options robustes pour la conception des essais et de la facilité avec laquelle la spécificité peut être évaluée bio-informatique pour identifier les effets possibles hors cible. Il convient de noter que la préparation des amorces et des sondes peut varier des étapes énumérées ici en fonction du format dans lequel elles sont fournies.
2. Centrifuger les tubes contenant l’amorce avant, l’amorce inverse et la sonde dans une microcentrifugeuse pendant ~10 s pour faire passer le matériau en granulés au fond du tube.
3. Remettez les amorces en suspension à 20 μM à l’aide du tampon TE. Vortex brièvement.
4. Resuspendre la sonde à 10 μM à l’aide du tampon TE. Vortex brièvement.
5. Préparer plusieurs aliquotes, idéalement à usage unique, et conserver à une température minimale de -20 °C jusqu’à utilisation.
   REMARQUE : Les amorces et les sondes préparées de cette manière sont généralement stables pendant au moins 24 mois à compter de la date de remise en suspension.

3. Préparation du tampon de dilution de l’échantillon

1. Décongeler le tampon PCR et cisailler l’ADN des spermatozoïdes de saumon à température ambiante. Vortex soigneusement pour mélanger.
2. Préparer un tampon de dilution de l’échantillon, conformément au tableau 1.
3. Vortex à fond. Conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à 1 mois après la préparation.

Tableau 1: Préparation du tampon de dilution de l’échantillon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

4. Préparation du mélange maître

1. Décongeler le mélange maître ddPCR pour les sondes, l’amorce avant, l’amorce inverse et la sonde à température ambiante et laisser chauffer pendant au moins 10 minutes après la décongélation avant utilisation. Conserver à température ambiante jusqu’à utilisation.
   NOTE: Ces réactifs doivent être complètement amenés à température ambiante pour assurer une formation efficace de gouttelettes. Ne pas tenir les réactifs sur la glace pendant la préparation.
   1. Vortex centrifuger complètement et brièvement dans une mini-centrifugeuse avant utilisation.
      NOTE: Les enzymes de restriction sont généralement fournies dans le glycérol et doivent être retirées de l’entreposage immédiatement avant utilisation. Mélanger délicatement. Ne pas vortex.
2. Préparez un mélange maître PCR pour chaque cible d’amplification. Voir le tableau 2 pour une composition de mélange principal de PCR suggérée et modifier les concentrations des amorces et des sondes au besoin.
   1. Vortex complet et centrifuger brièvement avant l’ajout de l’enzyme de restriction. Ajouter l’enzyme de restriction et retourner pour mélanger.
      REMARQUE : Dans cette étape, 22 μL de réaction PCR sont nécessaires pour obtenir un volume final de 40 μL de réaction PCR après formation de gouttelettes (composé de 15 μL de mélange maître de PCR, 5,0 μL de matrice et 20 μL d’huile de génération de gouttelettes).
3. Ajouter 16,5 μL de mélange maître à chaque puits selon la carte des plaques. Voir la figure 1 pour un exemple de carte de plaque pour une précision de validation et un exécution de précision.
   1. S’assurer qu’une plaque contient trois préparations indépendantes de la série de contrôle de la qualité (CQ), trois aliquotes lacrymales endogènes testées de manière indépendante, dopées à un niveau élevé et bas et non enrichies, et trois témoins indépendants sans gabarit (CTN).
   2. Variez la disposition de ces puits dans la plaque, où l’ensemble 1 est chargé par ordre décroissant de concentration, l’ensemble 2 est chargé par ordre de concentration croissante et l’ensemble 3 est chargé dans un ordre aléatoire pour évaluer s’il existe des effets spécifiques à l’emplacement de la plaque.
   3. Rangez les échantillons pour remplir autant de colonne que possible et remplissez les puits inutilisés dans une colonne avec un tampon de contrôle. Inclure plusieurs lots témoins endogènes (p. ex. plus de flaques de larmes ou de larmes recueillies sur des individus) dans les puits restants, si désiré.
   4. Scellez la plaque avec un film adhésif transparent. Tenez la plaque à température ambiante pendant la préparation du gabarit. Vous pouvez également maintenir la plaque jusqu’à 4 h à une température de 2 à 8 °C, mais la ramener à température ambiante pendant au moins 10 minutes avant l’ajout du gabarit.

Tableau 2 : Exemple de préparation du mélange maître PCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure 1 : Exemple de carte de plaque pour la précision de validation et l’exécution de précision. Abréviations : AQLQ = limite supérieure de contrôle de la qualité; HQC = contrôle de haute qualité; MQC = contrôle de qualité moyenne; LQC = faible contrôle de la qualité; LLQC = contrôle de la qualité limite inférieure; NTC = pas de contrôle de modèle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Préparation des CQ

1. Décongeler des fragments d’ADN synthétique ou des plasmides linéarisés à température ambiante et laisser chauffer pendant au moins 10 minutes après la décongélation avant utilisation. Amenez les gabarits à température ambiante pour assurer une formation efficace de gouttelettes.
   1. Conserver à température ambiante jusqu’à utilisation. Vortex centrifuger complètement et brièvement dans une mini-centrifugeuse avant utilisation.
2. Préparer les dilutions de CQ en utilisant le tampon de dilution de l’échantillon comme diluant. Un exemple des concentrations recommandées pour se préparer à une validation de l’exactitude et de la précision est présenté dans le tableau 3.
   REMARQUE : Une fois les essais d’exactitude et de précision terminés avec succès, seuls le contrôle de haute qualité (HQC), le contrôle de qualité moyenne (MQC) et le contrôle de faible qualité (LQC) doivent être exécutés sur chaque plaque. Pour les cycles d’exactitude et de précision, au moins trois dilutions indépendantes des CQ sont incluses pour l’évaluation de l’exactitude et de la précision intra-essai. Après des essais d’exactitude et de précision, une seule série de dilution doit être incluse.
3. Après la préparation, conserver les dilutions à température ambiante jusqu’à ce qu’elles soient ajoutées à la plaque.
4. Conserver les dilutions sur de la glace ou à une température de 2 à 8 °C si nécessaire. Avant une utilisation ultérieure, laisser les dilutions chauffer à température ambiante pendant au moins 10 minutes avant utilisation. Jetez les QC à la fin de la journée.

Tableau 3 : Exemple de préparation au contrôle de la qualité (CQ) à l’aide de fragments d’ADN synthétiques double brin. Abréviations : AQLQ = limite supérieure de contrôle de la qualité; HQC = contrôle de haute qualité; MQC = contrôle de qualité moyenne; LQC = faible contrôle de la qualité; LLQC = contrôle de la qualité limite inférieure; NTC = pas de contrôle de modèle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

6. Préparation des échantillons

1. Décongeler les échantillons de larmes prélevés lors d’un essai clinique à température ambiante jusqu’à décongélation et laisser chauffer pendant au moins 10 minutes après la décongélation avant utilisation.
   1. Conserver à température ambiante jusqu’à utilisation. Vortex centrifuger soigneusement et brièvement dans une microcentrifugeuse avant utilisation.
2. Diluer les échantillons lacrymaux 1:10 (ou plus) en utilisant un tampon de dilution de l’échantillon comme diluant dans des tubes de PCR de 0,2 mL ou des bandes de PCR à 8 puits. Scellez les tubes.
   NOTA: Selon la concentration prévue de la cible dans les larmes, il peut être nécessaire de diluer davantage les échantillons ou d’analyser plusieurs dilutions de chaque échantillon.
3. Chauffer les échantillons dans un thermocycleur à 95 °C pendant 10 min, puis les maintenir à 4 °C pendant au moins 5 min pour refroidir. Utiliser une vitesse de rampe de 3 °C/s.
   NOTA : Les échantillons peuvent rester dans le thermocycleur à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient utilisés le même jour ou peuvent être congelés entre -70 et -90 °C pour un stockage plus long. Cette étape sert à dénaturer la capside vectorielle, libérant le génome. Comme les fragments d’ADN synthétique QC ou les plasmides linéarisés sont double brin, ils ne devraient pas subir cette étape de chauffage.
4. Remettre les échantillons après refroidissement à température ambiante (ou, s’ils sont congelés, décongeler à température ambiante) et laisser chauffer pendant au moins 10 min.
   REMARQUE : Les échantillons doivent être complètement portés à température ambiante pour assurer une formation efficace de gouttelettes.

7. Ajout de modèle

1. Récupérez la plaque ddPCR contenant le mélange principal. Vortex chaque échantillon ou tube de dilution QC centrifuge soigneusement et brièvement pour recueillir le matériau.
2. Retirez le film adhésif et ajoutez 5,5 μL de CQ ou d’échantillons aux puits appropriés de la plaque de 96 puits, conformément à la carte de la plaque.
   REMARQUE : Reportez-vous à l’étape 4.2.1 pour obtenir une explication des volumes requis.
3. Ajouter 5,5 μL de tampon de dilution de l’échantillon aux puits NTC.
4. La génération de gouttelettes nécessite que tous les puits d’une colonne aient un contrôle de réaction ou de tampon. Si l’un des puits d’une colonne ne contient pas de réactions d’échantillonnage, diluer 2x contrôle tampon ddPCR 1:2 en utilisant de l’eau exempte de nucléase. Ajouter 22 μL de 1x contrôle tampon ddPCR à tous les puits vides d’une colonne.
   Remarque : Si une colonne entière n’est pas utilisée, il n’est pas nécessaire d’ajouter un contrôle tampon à ces puits.
5. Ajoutez un joint en aluminium perçable à la plaque. Placer la plaque dans le scellant et sceller pendant 5 s à 180 °C.
   1. Vous pouvez également sceller la plaque conformément aux recommandations du fabricant du système ddPCR.
6. Tourbillonner la plaque à la vitesse maximale pendant au moins 30 s (en utilisant le réglage de tourbillon continu; ne pas utiliser le tourbillon tactile) et centrifuger brièvement dans un spinner à plaques.
   REMARQUE: Un mélange complet et complet de la plaque à cette étape est essentiel pour un bon partage de la réaction PCR en gouttelettes. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles visibles dans les puits. Si nécessaire, la plaque peut être maintenue à 2-8 °C avant la génération de gouttelettes pendant un maximum de 4 h. Si elle est maintenue, laisser la plaque atteindre la température ambiante pendant au moins 10 minutes avant la génération de gouttelettes.

8. Génération automatisée de gouttelettes, cyclage thermique et lecture de gouttelettes

1. Générez des gouttelettes dans le générateur de gouttelettes automatisé comme suit.
   1. Sur l’écran tactile, sélectionnez les colonnes de la carte de plaque contenant des échantillons. Le pont de l’instrument s’allume pour indiquer quels consommables (cartouches DG32, pointes, conteneur à déchets, huile de génération de gouttelettes) sont nécessaires. Les voyants jaunes indiquent qu’il est nécessaire d’ajouter un consommable, tandis que les voyants verts indiquent que suffisamment de consommables sont disponibles.
   2. Chargez le générateur de gouttelettes de l’arrière vers l’avant.
   3. Pour les sondes d’hydrolyse, s’assurer que l’huile de génération de gouttelettes pour les sondes est installée et qu’il reste suffisamment d’huile pour le nombre de puits. Si d’autres chimies PCR sont utilisées, assurez-vous qu’une huile de génération de gouttelettes compatible est installée.
   4. Placez un bloc froid dans le porte-plaque de gouttelettes. Assurez-vous que le bloc est entièrement de couleur bleue et qu’aucun rose n’est visible. Placez une nouvelle plaque de ddPCR à 96 puits dans le bloc froid.
   5. Placez la plaque PCR préparée dans le porte-plaque d’échantillonnage. Fermez le couvercle de la machine. Appuyez sur Démarrer pour la génération de gouttelettes.
2. Après la formation de gouttelettes, un total de 40 μL par réaction est transféré automatiquement sur la nouvelle plaque PCR.
3. Dans les 30 minutes suivant la fin de la génération de gouttelettes, retirer la plaque contenant les gouttelettes du bloc froid. Travaillez doucement car les gouttelettes sont les plus fragiles à ce stade.
4. Ajoutez un joint en aluminium perçable à la plaque. Placer la plaque dans le scellant et sceller pendant 5 s à 180 °C.
   1. Vous pouvez également sceller la plaque conformément aux recommandations du fabricant du système ddPCR.
5. Placez la plaque dans un cycleur thermique compatible. Entrez les conditions de cyclisme (voir tableau 4).
6. Après la fin du cycle thermique, maintenez la plaque dans le cycleur thermique, transférée à 2-8 °C, ou lisez-la immédiatement.
   REMARQUE : Tenir la plaque pendant 12 h à une température de 4 à 12 °C peut améliorer le nombre de gouttelettes, mais ce n’est pas obligatoire. Des gouttelettes suffisantes doivent être obtenues sans la prise.
7. Chargez la plaque dans le lecteur de gouttelettes, en vous assurant qu’il reste suffisamment d’huile de lecture et que le conteneur à déchets dispose de suffisamment d’espace. Lisez les gouttelettes. Effectuer la lecture des gouttelettes dans les 24 heures suivant le début du cycle thermique.

Tableau 4 : Conditions typiques de cyclage thermique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

9. Analyse des données

REMARQUE : Un minimum de 10 000 gouttelettes par puits est nécessaire pour calculer correctement la concentration à l’aide des statistiques de Poisson. Ne tentez pas d’analyser les puits contenant moins de 10 000 gouttelettes.

1. Un seuil est nécessaire pour définir les gouttelettes comme positives ou négatives. Le logiciel d’analyse ddPCR applique automatiquement un seuil qui peut varier d’un puits à l’autre. Cependant, réglez manuellement un seuil pour tous les puits de la plaque légèrement au-dessus de l’intensité fluorescente des puits NTC pour des résultats plus cohérents, précis et précis.
   REMARQUE : L’emplacement approprié du seuil peut nécessiter une optimisation en fonction de la séparation des gouttelettes positives et négatives et de la quantité de gouttelettes de pluie (voir la figure 2). Dans cet exemple, le graphique d’amplitude des gouttelettes montre des exemples de puits à chaque niveau de CQ et le NTC. La ligne violette indique un seuil de 1 000, fixé légèrement au-dessus de la population de gouttelettes négatives.
2. La modélisation statistique de Poisson nécessite au moins trois gouttelettes positives pour calculer la concentration avec un niveau de confiance de 95%. Considérez que tous les puits contenant zéro, une ou deux gouttelettes positives sont négatifs et fixés à une concentration de^{zéro 27}.
3. Rétrocalculer le numéro de copie dans chaque échantillon de déchirure.
   1. La concentration, en copies/μL, est indiquée dans le rapport de données. Utilisez cette valeur pour déterminer la concentration en copies/μL de l’échantillon original (c.-à-d. dans l’échantillon lacrymal).
   2. Pour calculer la dilution de la réaction ddPCR, diviser le volume de réaction PCR initial avant la formation de gouttelettes par le volume de gabarit ajouté. Lorsque les volumes présentés dans cette méthode sont utilisés, cela donne une valeur de 4.
      
   3. Déterminer le facteur de dilution en série à partir de l’échantillon original (étape 6.2).
   4. Pour déterminer les copies/μL dans l’échantillon, multiplier les copies/μL par la dilution de la réaction ddPCR, puis par le facteur de dilution sériel. Par exemple, la concentration en copies/μL générée dans le rapport de données était de 966; 5,5 μL de gabarit ont été ajoutés par 22 μL de réaction. Une dilution en série de l’échantillon de 1:50 000 a été utilisée.
      
      
   5. Si plusieurs dilutions du même échantillon ont été testées, analyser toutes les dilutions valides dans l’intervalle et calculer la moyenne.
4. Pour chaque CQ, calculer les copies attendues/μL de réaction PCR en divisant la concentration de la dilution de CQ donnée (en copies/μL) par le volume de réaction ddPCR (20 μL). Cela permet une comparaison directe de cette valeur nominale avec la valeur des copies/μL fournie dans le rapport de données sans autres calculs.
   REMARQUE : Cette approche a également été utilisée pour l’analyse des échantillons de larmes enrichies utilisés dans les résultats représentatifs.
5. Déterminer la valeur moyenne, l’écart type, le coefficient de variation (% CV) et le pourcentage d’erreur relative par rapport à la concentration nominale (%RE) de l’échantillon ou la valeur de CQ à l’aide des puits répliqués (inclure les dilutions multiples, le cas échéant).
   1. Pour l’évaluation de la précision entre puits, déterminez-le pour chacun des doublons de puits, le cas échéant.
   2. Pour l’évaluation de l’exactitude et de la précision intra-essai, déterminez-le pour chaque série de dilution ou aliquote utilisée dans un lot.
   3. Pour l’évaluation de l’exactitude et de la précision entre les essais, déterminez-les à l’aide des moyennes intra-essais de chacun des lots inclus.

Figure 2 : Exemple de définition du seuil. Abréviations : AQLQ = limite supérieure de contrôle de la qualité; HQC = contrôle de haute qualité; MQC = contrôle de qualité moyenne; LQC = faible contrôle de la qualité; LLQC = contrôle de la qualité limite inférieure; NTC = pas de contrôle de modèle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

10. Critères d’acceptation des essais

1. Utilisez les spécifications suivantes pour les données calculées pour chaque lot afin de déterminer si le lot est acceptable. Si ces conditions ne sont pas remplies, invalidez et répétez le lot.
   REMARQUE : Ces critères ont été déterminés par consensus à partir de livres blancs publiés sur la validation des tests par PCR 18,19,20,21,22,23,24,25. Il peut être nécessaire de modifier les critères cibles en fonction de l’application clinique.
2. Aucun contrôle de modèle (NTC)
   1. Assurez-vous que chaque puits NTC contient au moins 10 000 gouttelettes.
   2. Assurez-vous que chaque puits NTC contient moins de 3 gouttelettes positives.
3. CQ et gamme de dosage
   1. Assurez-vous que chaque puits de CQ contient au moins 10 000 gouttelettes.
   2. Assurez-vous que la précision des puits répliqués d’une concentration de CQ est de ≤25,0 % CV, sauf aux limites supérieure et inférieure de quantification, où ≤30,0 % est acceptable. Évaluez cela indépendamment pour chaque ensemble de CQ et niveau de concentration.
   3. S’assurer que l’erreur relative de la concentration calculée rétrospectivement à chaque niveau moyen de CQ se situe à moins de ±25,0 % d’ER de la concentration nominale (copies/réaction PCR), sauf aux limites supérieure et inférieure de quantification, où ±30,0 % d’ER est acceptable. Évaluez cela indépendamment pour chaque ensemble de CQ et niveau de concentration.
   4. Assurez-vous qu’au moins les 2/3 des échantillons de CQ (p. ex., quatre résultats sur six) et 50 % des échantillons de CQ à chaque niveau (faible, moyen, élevé) respectent ces lignes directrices.
4. Échantillons
   1. Assurez-vous que les puits d’échantillonnage à analyser contiennent au moins 10 000 gouttelettes.
   2. Assurez-vous que la précision des puits de réplication d’un échantillon de dilution à analyser est de ≤25,0% CV.
   3. S’assurer qu’au moins une dilution incluse de l’échantillon donné se situe dans la plage de quantification définie de l’essai, telle que définie ci-dessus en fonction des CQ limites supérieure et inférieure.
   4. Si toutes les dilutions comprenaient des résultats de rendement supérieurs à la limite supérieure de quantification définie, et s’il reste un volume d’échantillon suffisant, répéter l’essai en utilisant une dilution plus élevée de l’échantillon.
   5. Si toutes les dilutions incluses donnent un résultat inférieur à la limite inférieure de quantification, et s’il reste un volume d’échantillon suffisant, répéter l’essai en utilisant une dilution inférieure de l’échantillon.
      REMARQUE : Les échantillons contenant plus de trois gouttelettes positives, mais dont la concentration est inférieure à la limite inférieure de quantification, peuvent être décrits comme détectables, mais non quantifiables.

À des fins de démonstration, un essai conçu pour détecter un vecteur AAV2 exprimant une protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) disponible dans le commerce, avec un fragment d’ADN synthétique double brin contenant eGFP comme contrôle de la qualité, a été développé. Actuellement, il y a un débat en cours pour savoir si le vecteur lui-même ou un fragment d’ADN synthétique ou un plasmide linéarisé est le plus approprié pour une utilisation comme CQ. En général, un fragment d’ADN synthétique ou un plasmide linéarisé peut être utilisé si l’équivalence avec le vecteur est démontrée dans l’élaboration de la méthode (données non présentées). Des amorces et des sondes ont été conçues et optimisées pour détecter le transgène eGFP. Se reporter au tableau supplémentaire S1 pour les séquences utilisées dans ce travail. La concentration du stock de fragments de CQ a été déterminée empiriquement à l’aide de la ddPCR. Tous les tests ont été effectués en utilisant les concentrations et les conditions PCR données à titre d’exemples dans la section du protocole.

Pour les tests qPCR, il est recommandé d’évaluer la linéarité, la sensibilité, la plage dynamique, l’exactitude et la précision de la courbe standard. Étant donné que la ddPCR ne repose pas sur une courbe standard pour la quantification cible, ces recommandations doivent être modifiées. Au lieu de cela, des CQ constitués de fragments d’ADN synthétiques double brin dilués à diverses concentrations pour couvrir la plage quantifiable attendue d’une réaction ddPCR basée sur la modélisation statistique de Poisson ont été utilisés 29,30,31,32 pour définir la plage dynamique et la sensibilité et pour évaluer l’exactitude et la précision. Le choix des concentrations de CQ était fondé principalement sur le rapport attendu entre les gouttelettes positives et totales dans un puits à une concentration donnée. Mathématiquement, la ddPCR est théoriquement plus précise lorsqu’environ 80% des partitions s’amplifient positivement. Lorsque le rapport gouttelettes positives / totales augmente au-dessus de 0,8, la précision diminue en raison de la saturation des partitions, la quantification n’étant pas possible une fois que 100% des gouttelettes sont positives. À l’extrémité inférieure, théoriquement, aussi peu qu’une gouttelette positive peut être détectée et quantifiée, bien que la précision soit plus faible et que le test soit sujet à des faux positifs de faible niveau. En règle générale, au moins trois gouttelettes doivent être positives pour qu’un résultat soit calculé avec un niveau de confiance de 95%, ce qui est le seuil pour calculer une concentration que nous avons utilisée ici.

Une série de cinq concentrations différentes de CQ a été préparée, et le nombre cible de copies/volumes de réaction PCR en μL calculés devrait donner des rapports positifs par rapport aux gouttelettes totales couvrant la plage quantifiable de ddPCR, comme le montre le tableau 5. Ceux-ci ont été utilisés pour évaluer l’exactitude et la précision du test. Dans l’évaluation ici, les limites supérieure et inférieure de quantification n’ont pas été poussées au maximum théorique possible en ddPCR. Une quantification précise peut être possible à des niveaux plus élevés et plus bas que ceux démontrés ici. La gamme devrait être développée en fonction des applications en aval de cette méthode.

Au total, trois séries de dilution préparées indépendamment de ces CQ ont été préparées dans un tampon de dilution d’échantillon pour chaque lot afin d’évaluer l’exactitude et la précision intra-essai. Les puits en double de chaque dilution du CQ ont été inclus. Pour simuler un protocole de validation réel, un total de six lots d’exactitude et de précision ont été effectués par plusieurs analystes sur plusieurs jours. Les résultats de ces six lots ont été analysés pour définir l’exactitude et la précision intra-essai et inter-essais de la méthode et pour définir la plage dynamique du test.

La performance intra-essai a été évaluée pour chaque lot à chaque niveau de CQ. Nous nous attendions à ce que tous les puits du Québec et du CNT contiennent au moins 10 000 gouttelettes. Cet objectif a été atteint dans 216 des 216 puits testés dans les six lots, avec un nombre moyen de gouttelettes de 19 748 gouttelettes/puits (tableau 6). Ensuite, on s’attendait à ce que le pourcentage de CV inter-puits de chaque ensemble de puits en double de chaque CQ soit de ≤25,0 %, sauf pour les limites supérieure et inférieure du CQ, où ≤30,0 % était prévu. Cet objectif a été atteint dans des ensembles de 90 puits sur 90 testés dans les six lots pour les CQ, avec un pourcentage CV inter-puits moyen de 3,9 % pour tous les niveaux de CQ (tableau 7). Tous les CQ ont donné des rapports moyens positifs/totaux de gouttelettes dans les fourchettes prévues décrites ci-dessus (tableau 6).

Dans chaque lot, la moyenne intra-essai et l’écart-type ont été calculés pour chacun des points de la série de dilution préparés indépendamment, et ils ont été utilisés pour calculer une moyenne intra-essai pour chaque concentration dans chaque essai. Cela a été utilisé pour évaluer l’exactitude et la précision de l’essai (tableau 8). La précision fait référence à la variabilité des données provenant de répliques du même échantillon homogène dans des conditions normales de dosage et est évaluée en calculant le %CV des multiples aliquotes incluses. Nous nous attendions à ce que les trois aliquotes testées dans chaque lot donnent un %CV intra-essai ≤25,0 %, sauf pour les limites supérieure et inférieure de CQ où ≤30,0 % était attendu. Cet objectif a été atteint pour les cinq niveaux de CQ dans chacun des 60 lots (30 performances totales sur 30). En général, une plus grande précision intra-essai que les critères cibles a pu être atteinte, avec un % CVC intra-essai moyen de 7,7 % pour tous les niveaux de CQ. La précision fait référence à la proximité de l’accord entre la valeur déterminée expérimentalement et la valeur nominale. Ceci est évalué en calculant le pourcentage d’erreur relative (%RE, ou %Biais) entre les concentrations calculées de chaque CQ et leurs concentrations nominales théoriquement attendues. On s’attendait à ce que la moyenne intra-essai des trois aliquotes soit de ±25,0 % d’ER de la concentration nominale, sauf pour les limites supérieure et inférieure de QC où ±30,0 % était prévu. Cet objectif a été atteint pour les cinq niveaux de CQ dans chacun des 60 lots (30 performances totales sur 30). En général, une plus grande précision intra-essai que notre objectif a pu être atteinte, avec un %RE intra-essai absolu moyen de 4,2% pour tous les niveaux de CQ. Dans toutes les performances du CNT (30 au total), aucune gouttelette positive n’était détectable.

L’exactitude et la précision entre les essais ont également été calculées à l’aide de la moyenne intra-essai de chaque niveau de CQ dans chaque lot. La précision inter-essais devait être de ≤25,0 % CV, sauf pour les limites supérieure et inférieure de QC où ≤30,0 % était attendue. De même, pour la précision entre les essais, ±25,0 % d’ER était attendu, sauf pour les limites supérieure et inférieure du CQ où ±30,0 % était attendu. Une exactitude et une précision inter-essais significativement supérieures à celles de ces cibles ont été observées (tableau 9), avec une précision inter-essais allant de 4,0 % à 8,5 % et une précision absolue inter-essais allant de 1,0 % à 3,2 %. Collectivement, ces résultats démontrent que cette méthode peut atteindre une exactitude et une précision intra et inter-essais suffisantes, bien en deçà des objectifs actuels de l’industrie. Une plage dynamique de ce test de 2 500 à 2,5 copies par μL de réaction PCR peut être définie sur la base de ces résultats, avec une sensibilité globale du test de 2,5 copies par μL de réaction PCR. Comme mentionné précédemment, il peut être possible de valider des plages dynamiques plus larges.

Ensuite, il était nécessaire d’évaluer l’exactitude et la précision du test dans la matrice cible - dans ce cas, les déchirures. En règle générale, les tests sont validés avant le début des études cliniques, ce qui signifie qu’il est peu probable que les larmes prélevées chez des patients traités par vecteurs soient disponibles à des fins de validation. Cela peut être créé artificiellement en ajoutant au vecteur AAV cible des larmes recueillies auprès de donneurs volontaires pour créer des CQ à matrice. Les larmes humaines regroupées ont été collectées par un tiers (BioIVT). Pour la preuve de principe, un vecteur AAV2 exprimant eGFP acquis d’une source commerciale a été utilisé. La concentration du stock de vecteurs AAV2 a été déterminée empiriquement à l’aide de la ddPCR, sans l’utilisation d’une étape d’isolement de l’ADN, comme décrit dans ce protocole. À chaque essai, l’AAV2 a été indépendamment dopé dans les trois aliquotes lacrymales à un niveau élevé (1,41 x 103 copies/μL de réaction PCR) et faible (réaction PCR de 28,2 copies/μL). Des aliquotes non enrichies ont été incluses comme témoin pour démontrer la spécificité de la méthode.

La performance intra-essai a été évaluée pour chaque lot à chaque niveau de pointe. On s’attendait à ce que tous les échantillons de larmes contiennent au moins 10 000 gouttelettes. Cet objectif a été atteint dans 108 des 108 puits testés dans les six lots, avec un nombre total moyen de gouttelettes de 20 208 gouttelettes/puits (tableau 10). Ensuite, on s’attendait à ce que le pourcentage de CV inter-puits de chaque ensemble de puits en double de chaque CQ soit de ≤25,0 % pour les niveaux de pointe élevés et faibles. Cet objectif a été atteint dans 36 des 36 ensembles de puits testés dans les six lots pour les CQ, avec un pourcentage moyen entre puits de 3,2 % (tableau 11).

Au sein de chaque lot, la moyenne intra-essai et l’écart-type ont été calculés pour chacun des pics lacrymaux préparés indépendamment, et ils ont été utilisés pour calculer une moyenne intra-essai pour chaque concentration dans chaque essai. Cela a été utilisé pour évaluer l’exactitude et la précision de l’essai dans la matrice (tableau 12). Nous nous attendions à ce que le pourcentage CV intra-essai soit de ≤25,0% et à des niveaux de pointe élevés et faibles. Cela a été atteint dans six des six lots pour chaque niveau. En général, une plus grande précision intra-essai dans la matrice que la cible a pu être atteinte, avec un % CV intra-essai moyen de 3,7 % au niveau élevé et de 12,2 % au niveau bas (8,0 % dans l’ensemble). On s’attendait également à ce que le %RE intra-essai soit de ±25,0 % aux deux niveaux de pointe. Cela a été atteint dans six des six lots pour chaque niveau. De même, il a généralement été constaté qu’une plus grande précision intra-essai dans la matrice que la cible pouvait être atteinte, avec un %RE absolu intra-essai moyen de 8,1% au niveau bas et de 11,3% au niveau élevé (global 9,7%). Pour le témoin non dopé, aucun signal eGFP n’était détectable dans aucune des aliquotes (tableau 12), ce qui démontre la spécificité de la méthode dans la matrice lacrymale humaine.

L’exactitude et la précision inter-essais dans la matrice lacrymale ont également été calculées en utilisant la moyenne intra-essai de chaque niveau de pointe dans chaque lot. On s’attendait à ce que la précision inter-essais soit de ≤25,0% CV, et pour la précision inter-essais, nous nous attendions à ±25,0% RE. Une exactitude et une précision inter-essais significativement supérieures à celles de ces cibles ont été observées (tableau 13), avec une précision inter-essais de 5,5 % au niveau élevé et de 7,1 % au niveau bas, et avec une précision inter-essais absolue de 11,3 % au niveau élevé et de 8,1 % au niveau bas. Collectivement, ces résultats démontrent l’exactitude, la précision et la spécificité de la méthode dans la matrice lacrymale.

Tableau 5 : Contrôles de qualité utilisés pour définir la plage dynamique de l’essai. Abréviations : AQLQ = limite supérieure de contrôle de la qualité; HQC = contrôle de haute qualité; MQC = contrôle de qualité moyenne; LQC = faible contrôle de la qualité; LLQC = contrôle de la qualité limite inférieure; NTC = pas de contrôle de modèle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 6 : Nombre total de gouttelettes et rapports positifs/totaux de contrôle de la qualité de l’ADN double brin synthétique et de CNT. Abréviations : AQLQ = limite supérieure de contrôle de la qualité; HQC = contrôle de haute qualité; MQC = contrôle de qualité moyenne; LQC = faible contrôle de la qualité; LLQC = contrôle de la qualité limite inférieure; NTC = pas de contrôle de modèle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 7 : Statistiques inter-puits du CQ (cibles de copie/réaction PCR μL). Abréviations : AQLQ = limite supérieure de contrôle de la qualité; HQC = contrôle de haute qualité; MQC = contrôle de qualité moyenne; LQC = faible contrôle de la qualité; LLQC = contrôle de la qualité limite inférieure; NTC = pas de contrôle de modèle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 8 : Exactitude intra-essai et précision des CQ (copies cibles/réaction PCR μL). Abréviations : AQLQ = limite supérieure de contrôle de la qualité; HQC = contrôle de haute qualité; MQC = contrôle de qualité moyenne; LQC = faible contrôle de la qualité; LLQC = contrôle de la qualité limite inférieure; NTC = pas de contrôle de modèle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 9 : Exactitude inter-essais et précision des CQ (cibles de copie/réaction PCR μL). Abréviations : AQLQ = limite supérieure de contrôle de la qualité; HQC = contrôle de haute qualité; MQC = contrôle de qualité moyenne; LQC = faible contrôle de la qualité; LLQC = contrôle de la qualité limite inférieure; NTC = pas de contrôle de modèle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 10 : Nombre total de gouttelettes d’échantillons de larmes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 11 : Statistiques interpuits de l’échantillon de déchirure (cibles de copie/réaction PCR en μL). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 12 : Exactitude intra-essai et précision des échantillons lacrymaux (cibles de copie/réaction PCR en μL). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 13 : Exactitude inter-essais et précision des échantillons lacrymaux (cibles de copie/réaction PCR μL). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S1 : Séquences d’amorces, de sondes et de contrôle de la qualité de l’ADN double brin synthétique utilisées dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tous les auteurs sont des employés de KCAS Bioanalytical and Biomarker Services, un organisme de recherche sous contrat fournissant des services complets de développement conformes aux bonnes pratiques de laboratoire et aux bonnes pratiques cliniques, du soutien à la découverte précoce à l’enregistrement du produit, y compris le soutien aux tests basés sur AAV, comme décrit dans ce protocole. Le KCAS a financé ce projet et la publication de ce protocole. Bien qu’il n’y ait pas de directives actuelles de la FDA pour la conception et la validation des expériences présentées dans ce document, les experts et les leaders d’opinion qui développent de telles études au KCAS ont adopté cette approche comme approche de base. D’autres critères et paramètres sont discutés projet par projet et peuvent être inclus en fonction de l’utilisation prévue.