Bioanalyse de diffusion Raman sans marquage à surface améliorée basée sur des nanosondes à Au@Carbon points

Résumé

Dans cette étude, nous avons développé une nanosonde d’empreintes digitales basée sur la diffusion Raman améliorée en surface (SERS) à faible coût avec une biocompatibilité favorable pour montrer la bioimagerie de cellules vivantes sans marquage et détecter deux souches bactériennes, montrant en détail comment obtenir des spectres SERS de cellules vivantes dans une méthode non destructive.

Résumé

La technologie de diffusion Raman améliorée en surface (SERS) attire de plus en plus l’attention dans le domaine biomédical en raison de sa capacité à fournir des informations moléculaires sur les empreintes digitales d’échantillons biologiques, ainsi que de son potentiel dans l’analyse de cellules uniques. Ce travail vise à établir une stratégie simple de bioanalyse SERS sans marquage basée sur Au@carbon nanosondes à points (Au@CDs). Ici, les CD dérivés de polyphénols sont utilisés comme réducteur pour synthétiser rapidement des nanostructures de noyau et de coquille Au@CD, ce qui permet de puissantes performances SERS même lorsque la concentration de bleu de méthylène (MB) est aussi faible que ^10-9 M, en raison du mécanisme coopératif d’amélioration Raman. Pour la bioanalyse, Au@CDs peut servir de nanocapteur SERS unique pour identifier les composants cellulaires des échantillons biologiques (par exemple, les cellules cancéreuses et les bactéries). Les empreintes moléculaires de différentes espèces peuvent être distinguées après combinaison avec l’analyse en composantes principales. En outre, Au@CDs permettent également l’imagerie SERS sans marquage pour analyser les profils de composition intracellulaire. Cette stratégie offre une bioanalyse SERS réalisable et sans marque, ouvrant de nouvelles perspectives pour le nanodiagnostic.

Introduction

L’analyse unicellulaire est essentielle pour l’étude de la révélation de l’hétérogénéité cellulaire et l’évaluation de l’état global de la cellule. La réponse instantanée de la cellule au microenvironnement justifie également une analyse unicellulaire¹. Cependant, il y a certaines limites aux techniques actuelles. La détection de fluorescence peut être appliquée à l’analyse d’une seule cellule, mais elle est limitée par une faible sensibilité. D’autres défis découlent du fond de fluorescence complexe des cellules et du photoblanchiment en fluorescence sous irradiation à long terme². La diffusion Raman améliorée en surface (SERS) peut être qualifiée en termes d’analyse unicellulaire en raison de ses avantages, notamment (1) reflétant les informations moléculaires intrinsèques de l’empreinte digitale et la situation instantanée, (2) sensibilité de surface ultra-élevée, (3) détection multiplex pratique, (4) photostabilité élevée, (5) détection peut être quantifiée pour une analyse comparative, (6) éviter l’autofluorescence cellulaire avec l’excitation de longueur d’onde NIR, (7) la détection peut être effectuée dans un aqueux cellulaire environnement, et (8) la détection peut être dirigée vers une région spécifique de la cellule ^3,4,5.

Il existe deux mécanismes largement reconnus pour comprendre le SERS comme un phénomène fondamental : l’amélioration électromagnétique (EM) comme raison dominante et l’amélioration chimique (CM). EM se réfère, dans une fréquence donnée du champ excitant, à l’oscillation d’électrons collectifs entraînés par des ondes électromagnétiques lorsque la fréquence de la lumière incidente correspond à la fréquence des électrons libres oscillant dans le métal, donnant lieu à la résonance plasmonique de surface (SPR). Lorsque la SPR localisée (LSPR) se produit par le laser incident qui frappe les nanoparticules métalliques (NP), elle conduit à l’absorption ou à la diffusion par résonance de la lumière incidente. Par conséquent, l’intensité du champ électromagnétique de surface des NP métalliques peut être augmentée de deux à cinq ordres⁴. Cependant, la clé de l’énorme amélioration du SERS n’est pas un seul NP métallique, mais l’écart entre deux NP, ce qui crée des points chauds. La CM est générée de deux côtés, y compris (1) les interactions entre les molécules cibles et les NP métalliques et (2) les molécules cibles capables de transférer des électrons vers/depuis les NP métalliques ^4,5. Des détails plus exhaustifs peuvent être trouvés dans ces articles ^4,5. Plusieurs méthodes prometteuses de biodétection et d’imagerie SERS dans les cellules vivantes ont été présentées dans la littérature antérieure, par exemple, la détection des cellules apoptotiques⁶, des protéines dans les organites⁷, des miARN intracellulaires⁸, des membranes lipidiques ^{cellulaires9,}des cytokines¹⁰ et des métabolites¹¹ dans les cellules vivantes, ainsi que l’identification et la surveillance des cellules par imagerie confocale SERS^{2, 11,12,13}. Fait intéressant, le SERS sans marquage présente l’avantage unique du SERS, qui peut décrire les spectres moléculaires internes⁵.

Un problème majeur pour le SERS sans étiquette est un substrat rationnel et fiable. Les substrats SERS typiques sont des NP de métaux nobles en raison de leur excellente capacité à diffuser beaucoup de lumière¹⁴. De nos jours, de plus en plus d’attention est accordée aux nanocomposites en raison de leurs propriétés physiques et chimiques remarquables et de leur biocompatibilité. Plus important encore, les nanocomposites peuvent présenter une meilleure activité SERS en raison de l’intense EM induite par les points chauds sur les nanohybrides et de l’amélioration chimique supplémentaire provenant d’autres matériaux non métalliques¹⁵. Par exemple, Fei et coll. ont utilisé des pointsquantiques MoS 2 (QD) comme réducteurs pour synthétiser des nanocomposites Au_{NP@MoS 2} QD pour l’imagerie SERS dans le proche infrarouge (NIR) sans marquage de cellules cancéreuses du sein 4T1 de souris (cellules 4T1)¹⁶. En outre, Li et al. ont fabriqué un substrat SERS 2D composé de NP Au et de nanofeuilles de ditellurure de hafnium 2D pour des mesures SERS sans marquage de bactéries pathogènes d’origine alimentaire¹⁷. Récemment, les points de carbone (CD), bons donneurs d’électrons, ont été utilisés comme réducteurs sans autres réducteurs ni irradiation pour synthétiser Au@carbon nanosondes à points (Au@CDs)¹⁸, qui ont été signalées comme des matériaux efficaces pour améliorer l’activité SERS basée sur l’effet de transfert de charge (CT) entre les noyaux Au et les coquilles CD^19,20. De plus, les CD sont reconnus comme l’agent de coiffage et un stabilisateur pour empêcher les NP Au d’agréger²¹. En outre, il ouvre plus de possibilités de réactions avec les analytes, car il peut fournir un grand nombre de sites de liaison et actifs²⁰. Tirant parti de ce qui précède, Jin et al. ont développé une méthode rapide et contrôlable pour fabriquer des NP Ag@CD dotés de propriétés SERS uniques et d’excellentes activités catalytiques pour surveiller des réactions catalytiques hétérogènes en temps réel¹⁸.

Ici, une méthode facile et peu coûteuse pour fabriquer des substrats de base Au@CD de SERS afin d’identifier les composants cellulaires et la bioimagerie de cellules vivantes SERS sans marque, ainsi que de détecter et de différencier Escherichia coli (E. coli) et Staphylococcus aureus (S. aureus) a été démontrée, ce qui est prometteur pour le diagnostic précoce de la maladie et une meilleure compréhension des processus cellulaires.

Protocole

1. Fabrication de Au@CDs

REMARQUE : La figure 1 illustre une procédure de fabrication pour Au@CDs.

1. Préparer la solution CD en utilisant de l’acide citrique (CA) et de l’acide gallique (AG) par un traitement hydrothermal typique¹⁸. Ajouter 100 μL de 3,0 mg ^mL-1 de la solution CD préparée dans 200 μL d’acide chloroaurique 10 mM (HAuCl₄) (voir le tableau des matières) à température ambiante pendant 10 s jusqu’à ce qu’une suspension violette soit produite.
2. Centrifuger la suspension pourpre à 4 000 × g pendant 10 min à température ambiante et retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette si l’élimination des colloïdes Au@CD est difficile.
3. Remettez le Au@CDs en suspension avec 200 μL d’eau désionisée (résistivité de 18,2 MΩcm) pour laver les CD en excès.
4. Répéter l’étape 1.2 et obtenir les NP noyau-enveloppe, redispersés dans 100 μL d’eau désionisée, et stocker à 4 °C. Les NP peuvent être stockés pendant 1 mois.

2. Caractérisation des Au@CDs

1. Microscopie électronique à transmission (MET)
   1. Laisser les échantillons CD et Au@CD toute la nuit à -80 °C pour les lyophiliser à partir d’une solution congelée et les écraser après lyophilisation en poudre.
   2. Disperser les échantillons de poudre obtenus dans l’eau désionisée de manière adéquate par sonication, à 100% de puissance, pendant 5 min.
   3. Déposer quelques gouttes de la suspension de l’échantillon sur une grille TEM recouverte d’un film de carbone laceté et capturer des images après séchage à l’aide d’un microscope électronique à transmission à une tension d’accélération de 200 kV (voir le tableau des matériaux).
2. Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR)
   1. Répétez l’étape 2.1.1 pour obtenir des échantillons de puissance, broyez quelques particules de KBr préséchées en poudres dans un mortier, ajoutez une pincée de l’échantillon et mélangez simultanément avec les poudres KBr pour la caractérisation IR¹⁶.
3. Spectroscopie d’absorbance ultraviolet-visible-proche infrarouge (UV-vis-NIR)
   1. Préparer la suspension des CD et des Au@CDs avec une concentration appropriée pour s’assurer que l’absorbance est inférieure à un et effectuer la caractérisation UV-vis-NIR¹⁶.
4. Spectres Raman
   1. Allumez le laser à semi-conducteurs 785 nm, avec une puissance laser de 10 mW et un grossissement d’objection de 20x. Réglez la durée d’exposition à 5 s et le nombre d’accumulations à trois.
   2. Ajouter un volume égal d’échantillons de Au@CDs préparés dans 5 μL de solution de bleu de méthylène (MB) et bien mélanger.
   3. Placez une goutte de suspension sur le substrat en laiton pour recueillir les spectres SERS.

3. Culture cellulaire

1. Culture de cellules de carcinome pulmonaire épithélial humain (cellules A549, passage en laboratoire) dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO₂.
2. Ensemencer les cellules dans des plaques de 96 puits (1 × 10⁵ cellules/puits) et traiter avec Au@CDs à différentes concentrations comprises entre 20 et 100 μM. Utilisez une trousse d’essai CCK-8 pour mesurer la viabilité cellulaire (voir le tableau des matériaux). Trois doublons indépendants sont utilisés dans chaque traitement.
3. Pour effectuer les expériences SERS, procédez comme suit :
   1. Placez une puce de saphir stérile (voir le tableau des matériaux) dans les plaques de 12 puits, puis ensemencez les cellules sur un seul puits avec 1 ml de milieu. Incuber les plaques dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO₂pendant la nuit pour atteindre 70%-80% de confluence.
   2. Ajouter le Au@CDs dans le puits unique et incuber pendant 4-6 h.
      NOTE: Avant l’incubation, tester la stabilité des substrats, en particulier les NP de phase de solution. Ces matières sont susceptibles de se dégrader par des processus de dissolution, d’agrégation et de sédimentation pendant le stockage et l’utilisation, ce qui peut réduire les pertes EM et diminuer l’activité SERS. Plus important encore, pour l’absorption cellulaire, elle pourrait être largement affectée par la taille des NP²².
   3. Pendant l’incubation, les substrats pénètrent dans les cellules par absorption endocytaire. Après l’incubation, observez les cellules au microscope optique jusqu’à ce que quelques particules noires soient vues à l’intérieur des cellules.
      REMARQUE: Si l’intensité du SERS est faible, essayez d’augmenter la concentration de Au@CD ou de prolonger le temps d’incubation.
   4. Retirez le milieu, rincez doucement les copeaux de saphir avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et trempez-les dans du PBS pour la détection SERS¹⁶.

4. Expériences SERS cellulaires

1. Ouvrez l’ordinateur, allumez le spectromètre Raman, démarrez le logiciel, puis allumez le laser 785 nm (voir Tableau des matériaux).
2. Cliquez sur Nouvelle mesure et commencez une nouvelle acquisition spectrale. Calibrer¹⁷ avec des plaquettes de silicium avant la mesure de l’échantillon.
3. Prenez un objectif 20x pour vous assurer qu’une image cellulaire claire est observée, puis changez l’objectif à 50x. Réglez la puissance laser de faible à élevée et le temps d’exposition et les accumulations appropriés.
   REMARQUE: Avant la mesure SERS, vérifiez la puissance laser appropriée pour éviter des dommages irréversibles à la cellule et assurez-vous que les paramètres d’acquisition sont cohérents. L’intensité du SERS est liée à la puissance du laser, à la taille du spot, à l’accumulation et au temps d’exposition.
4. Choisissez un point de cellules à mesurer et cliquez sur Exécuter. Chaque cellule est mesurée par 20 points, et 10 cellules sont mesurées pour prendre la moyenne.
   REMARQUE: Les composants intracellulaires sont compliqués, ce qui entraîne une grande disparité spectrale. Par conséquent, prenez des spectres dans des régions cellulaires similaires et prenez autant de spectres que possible.
5. Enregistrez les spectres.
6. Cliquez sur Nouvelle acquisition d’image Rationaliser, puis cliquez sur Révision vidéo, sélectionnez la plage à photographier et cliquez sur OK. Réglez les paramètres : ligne de bord de 785 nm, centre de 1 200 ^cm-1, durée d’exposition de 5 s, nombre d’accumulations de trois et puissance laser à 50 %.
7. Cliquez sur Nouvelle image vivante, choisissez Signal à la ligne de base, définissez la plage de la première limite 625 à la deuxième limite 1 700, puis cliquez sur Configuration de la zone. Ensuite, définissez les étapes appropriées, puis cliquez sur Appliquer et OK. Enfin, cliquez sur Exécuter pour commencer à effectuer l’imagerie SERS.

5. Culture bactérienne et mesures SERS

1. Diluer pendant la nuit les cultures d’E. coli et de S. aureus (1:100) dans 5 mL du nouveau milieu Luria-Bertani (LB) (voir le tableau des matériaux). Après croissance à 37 °C à A 600 0,4 à 0,6, centrifuger la culture à 5₀₀₀ × g pendant 5 min pour granuler les cellules.
2. Remettez les pastilles en suspension dans 1 mL de PBS suivie d’une centrifugation de 5 min 5 000 × g (à température ambiante) deux fois.
3. Mélanger la culture bactérienne avec le Au@CDs et observer le mélange directement sous la plateforme SERS.

6. Analyse des données

1. Lissez les spectres et corrigez la ligne de base.
2. Effectuer une analyse en composantes principales (ACP)¹⁶ avec les données traitées.

Résultats

La fabrication de la Au@CDs est illustrée à la figure 1. Les CD ont été préparés à partir d’AC et de GA par un procédé hydrothermal typique¹⁸. Au@CDs ont été rapidement synthétisés en réduisant HAuCl4 par des CD en milieu aqueux à température ambiante. La taille et la morphologie des CD et des Au@CDs peuvent être observées par TEM et TEM²³ à haute résolution (HR). Les CD préparés sont monodispersés avec de ...

Discussion

En résumé, Au@CDs avec une coque CD ultramince de 2,1 nm ont été fabriquées avec succès. Les nanocomposites présentent une sensibilité SERS supérieure à celle des NP Au purs. En outre, Au@CDs possèdent d’excellentes performances en termes de reproductibilité et de stabilité à long terme. D’autres recherches comprennent la prise de Au@CDs comme substrats pour effectuer l’imagerie SERS des cellules A549³¹ et pour détecter deux souches bactériennes³². Il a été prouvé que Au@CD...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10x tampon PBS (culture cellulaire)	Langeco Technology	BL316A
Plaque de culture cellulaire 6 puits	LABSELECT	11110
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	GLPBIO	GK10001
Acide citrique	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	C108869
CO2 incubateur	Thermo Fisher Technologies	3111
Agitateur magnétique à température constante	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Centrifugeuse cryogénique à grande vitesse	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
DMEM milieu de culture cellulaire à haute teneur en glucose	Procell	PM150210
Balance électronique	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Marqueur enzymatique	Thermo Fisher Technologies	3111
Sérum fœtal bovin	Zhejiang Tianhang Biological Technology	11011-8611
Figure 1	Figdraw.
Spectromètre infrarouge de Fourier	Thermo, Amérique	Nicolet 380
Lyophilisateur	Tecan	Infinite F50
Acide gallique	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	G104228
Spectromètre Raman portable	OCEANHOOD, Shanghai, Chine	Uspectral-PLUS
HAuCl4	Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou)
Microscope électronique à transmission haute résolution	Thermo Fisher Technologies	FEI Tecnai G2 Spirit T12
Autoclave haute température	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S  ;
Microscope inversé	Nanjing Jiangnan Yongxin Optique	XD-202
LB Bouillon BR	Huankai pico-organisme	028320
Réfrigérateur médical à ultra-basse température	Thermo Fisher Technologies	ULTS1368
Bleu de méthylène	Sigma-Aldrich
Pancréatine Cellule Solution Digestive	beyotime	C0207
Pénicilline streptomycine double résistance	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S  ;
Compteur d’eau pure	Millipore, USA	Spectromètre
	Renishaw
Puce saphir	beyotime
Bain-marie thermostatique	Changzhou Noki
Table ultra-propre	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
Absorption de la lumière UV-visible spectromètre	MADAPA, Chine	UV-6100S
Fil 3.4	Renishaw