Utilisation de l’imagerie STED de cellules vivantes pour visualiser l’ultrastructure de la membrane interne mitochondriale dans des modèles de cellules neuronales

Les mitochondries sont des organites eucaryotes d’origine endosymbiotique qui sont responsables de la régulation de plusieurs processus cellulaires clés, notamment le métabolisme intermédiaire et la production d’ATP, l’homéostasie ionique, la biosynthèse des lipides et la mort cellulaire programmée (apoptose). Ces organites sont topologiquement complexes, contenant un système à double membrane qui établit plusieurs sous-compartiments¹ (Figure 1A). La membrane mitochondriale externe (OMM) interface avec le cytosol et établit des contacts inter-organites directs ^2,3. La membrane mitochondriale interne (IMM) est une membrane d’économie d’énergie qui maintient des gradients d’ions stockés principalement sous forme de potentiel de membrane électrique (ΔΨ_m) pour piloter la synthèse d’ATP et d’autres processus nécessitant de l’énergie ^4,5. L’IMM est subdivisée en membrane limite interne (IBM), qui est étroitement apprimée à l’OMM, et en structures saillantes appelées crêtes qui sont liées par la membrane des crêtes (CM). Cette membrane délimite le compartiment le plus interne de la matrice de l’espace intracristallin (ICS) et de l’espace intermembranaire (IMS).

Les mitochondries ont une morphologie dynamique basée sur des processus continus et équilibrés de fission et de fusion qui sont régis par des mécanoenzymes de la superfamille des dynamines⁶. La fusion permet une connectivité accrue et la formation de réseaux réticulaires, tandis que la fission conduit à la fragmentation mitochondriale et permet l’élimination des mitochondries endommagées par mitophagie⁷. La morphologie mitochondriale varie selon le type de tissu⁸ et le stade de développement⁹ et est régulée pour permettre aux cellules de s’adapter à des facteurs tels que les besoins énergétiques ^10,11 et les facteurs de stress ¹². Les caractéristiques morphométriques standard des mitochondries, telles que l’étendue de la formation du réseau (interconnectées ou fragmentées), le périmètre, la surface, le volume, la longueur (rapport hauteur/largeur), la rondeur et le degré de ramification, peuvent être mesurées et quantifiées par microscopie optique standard car les tailles de ces caractéristiques sont supérieures à la limite de diffraction de la lumière (~200 nm)¹³.

L’architecture des crêtes définit la structure interne des mitochondries (Figure 1B). La diversité des morphologies des crêtes peut être classée en deux grandes catégories : plates (lamellaires ou discoïdales) ou tubulaires-vésiculaires¹⁴. Toutes les crêtes se fixent à l’IBM par des structures tubulaires ou en forme de fente appelées jonctions de crêtes (CJ) qui peuvent servir à compartimenter l’IMS de l’ICS et l’IBM du CM¹⁵. La morphologie des crêtes est régulée par des complexes protéiques clés de l’IMM, y compris (1) le site de contact mitochondrial et le système d’organisation des crêtes (MICOS) qui réside au niveau des CJ et stabilise les contacts IMM-OMM 16, (2) la GTPase de l’atrophie optique 1 (OPA1) qui régule le remodelage des crêtes^17,18,19, et (3) la F₁F_O ATP synthase qui forme des assemblages oligomères stabilisateurs aux extrémités des crêtes (CTs)^{20, Chapitre 21}. De plus, l’IMM est enrichi en phospholipides non bicouches phosphatidyléthanolamine et cardiolipine qui stabilisent l’IMM²² très incurvé. Les crêtes sont également dynamiques, démontrant des changements morphologiques dans diverses conditions, telles que différents états métaboliques 23,24, avec différents substrats respiratoires 25, sous famine et stress oxydatif 26,27, avec apoptose^28,29, et avec le vieillissement ³⁰. Récemment, il a été démontré que les crêtes pouvaient subir des événements de remodelage majeurs sur une échelle de temps de quelques secondes, soulignant leur nature dynamique³¹. Plusieurs caractéristiques des crêtes peuvent être quantifiées, y compris les dimensions des structures à l’intérieur des crêtes individuelles (par exemple, la largeur CJ, la longueur et la largeur des crêtes) et les paramètres qui relient les cristas individuelles à d’autres structures (par exemple, l’espacement intra-crête et l’angle d’incidence des crêtes par rapport à l’OMM)³². Ces paramètres quantifiables montrent une corrélation directe avec la fonction. Par exemple, l’étendue de la production d’ATP mitochondrial est positivement liée à l’abondance des crêtes, quantifiée par la densité des crêtes ou le nombre de crêtes normalisé à une autre caractéristique (par exemple, les crêtes par zone OMM)^33,34,35. Parce que la morphologie IMM est définie par des caractéristiques à l’échelle nanométrique, elle comprend une ultrastructure mitochondriale, qui nécessite des techniques d’imagerie qui fournissent une résolution supérieure à la limite de diffraction de la lumière. Comme décrit ci-dessous, ces techniques comprennent la microscopie électronique et la microscopie à super-résolution (nanoscopie).

Les cellules neurales et gliales du système nerveux central (SNC) sont particulièrement dépendantes de la fonction mitochondriale. En moyenne, le cerveau ne représente que 2 % du poids corporel total, mais utilise 25 % du glucose corporel total et représente 20 % de la consommation d’oxygène corporel, ce qui le rend vulnérable aux déficiences du métabolisme énergétique³⁶. Les maladies neurodégénératives progressives (ND), notamment la maladie d’Alzheimer (MA), la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie de Huntington (MH), la sclérose en plaques (SEP) et la maladie de Parkinson (MP), sont parmi les pathologies les plus étudiées à ce jour, les efforts de recherche allant de la compréhension des fondements moléculaires de ces maladies à la recherche de prévention et d’interventions thérapeutiques potentielles. Les ND sont associés à une augmentation du stress oxydatif provenant en partie des espèces réactives de l’oxygène (ROS) générées par la chaîne de transport d’électrons mitochondriales (ETC)³⁷, ainsi qu’à une altération de la manipulation du calcium mitochondrial 38 et du métabolisme des lipides mitochondriaux³⁹. Ces altérations physiologiques s’accompagnent de défauts notés dans la morphologie mitochondriale qui sont associés à AD 40,41,42,43,44, ALS^45,46, HD^47,48,49, MS⁵⁰ et ^51,52,53. Ces défauts structurels et fonctionnels peuvent être couplés par des relations de cause à effet complexes. Par exemple, étant donné que la morphologie des crêtes stabilise les enzymes OXPHOS⁵⁴, les ROS mitochondriaux ne sont pas seulement générés par l’ETC, mais ils agissent également pour endommager l’infrastructure dans laquelle réside l’ETC, favorisant un cycle ROS feed-forward qui améliore la susceptibilité aux dommages oxydatifs. De plus, il a été démontré que la désorganisation des crêtes déclenche des processus tels que la libération d’ADN mitochondrial (ADNmt) et les voies inflammatoires liées aux troubles auto-immuns, métaboliques et liés à l’âge⁵⁵. Par conséquent, l’analyse de la structure mitochondriale est essentielle pour une compréhension complète des ND et de leurs fondements moléculaires.

Les méthodes populaires d’observation des crêtes, y compris la microscopie électronique à transmission, la tomographie électronique et la cryotomographie électronique (cryo-ET), et la tomographie à rayons X, en particulier la tomographie cryo-molle, ont révélé des résultats importants et des travaux avec une variété de types d’échantillons 56,57,58,59,60 . Malgré les progrès récents vers une meilleure observation de l’ultrastructure organellaire, ces méthodes s’accompagnent toujours de la mise en garde de nécessiter la fixation d’échantillons et, par conséquent, ne peuvent pas capturer directement la dynamique en temps réel des crêtes. La microscopie à fluorescence à super-résolution, en particulier sous la forme de la microscopie à illumination structurée (SIM), de la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM), de la microscopie de localisation photoactivée (PALM), de la microscopie à expansion (ExM) et de la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED), est devenue un moyen populaire de visualiser les structures nécessitant une résolution inférieure à la limite de diffraction qui contraint les méthodes classiques de microscopie optique. Lorsque l’ExM est utilisé en conjonction avec une autre technique de super-résolution, les résultats sont impressionnants, mais l’échantillon doit être fixé et coloré dans un gel⁶¹. En comparaison, SIM, PALM/STORM et STED ont tous été utilisés avec succès avec des échantillons vivants, et de nouveaux colorants prometteurs qui colorent généralement l’IMM fournissent une approche nouvelle et facile pour l’imagerie en direct de la dynamique des cristae mitochondriales 62,63,64,65,66^. Les progrès récents dans les colorants vivants pour l’imagerie STED ont amélioré la luminosité et la photostabilité des colorants, et ces colorants ciblent l’IMM à un degré de spécificité plus élevé que leurs prédécesseurs. Ces développements permettent la collecte d’expériences à long terme en timelapse et en z-stack avec l’imagerie à super-résolution, ouvrant la porte à une meilleure analyse de l’ultrastructure et de la dynamique mitochondriales sur cellules vivantes.

Les protocoles d’imagerie des cellules vivantes des cellules SH-SY5Y indifférenciées et différenciées colorées avec le colorant PKmito Orange (PKMO) à l’aide de STED⁶³ sont fournis. La lignée cellulaire SH-SY5Y est un dérivé trois fois sous-cloné de la lignée cellulaire parentale, SK-N-SH, générée à partir d’une biopsie de la moelle osseuse du neuroblastome métastatique^67,68,69,70. Cette lignée cellulaire est un modèle in vitro couramment utilisé dans la recherche sur la ND, en particulier avec des maladies telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Parkinson, dans lesquelles le dysfonctionnement mitochondrial est fortement impliqué 10,43,71,72,73. La capacité de différencier les cellules SH-SY5Y en cellules ayant un phénotype semblable à celui des neurones en manipulant des milieux de culture s’est avérée un modèle approprié pour la recherche en neurosciences sans s’appuyer sur des cellules neuronales primaires^10,74. Dans ce protocole, de l’acide rétinoïque (AR) a été ajouté au milieu de culture cellulaire pour induire la différenciation des cellules SH-SY5Y. La polyarthrite rhumatoïde est un dérivé de la vitamine A et il a été démontré qu’elle régule le cycle cellulaire et favorise l’expression des facteurs de transcription qui régulent la différenciation neuronale⁷⁵. Un protocole de culture et d’imagerie de cellules vivantes de neurones isolés de l’hippocampe du rat est également fourni. Il a été démontré que l’hippocampe est affecté par la dégénérescence mitochondriale et, avec le cortex, joue un rôle important dans le vieillissement et la ND 76,77,78,79,80.

1. Propagation et différenciation des cellules SH-SY5Y

1. Préparation des milieux pour la croissance et l’entretien des cellules
   1. Préparer le milieu d’aigle modifié de Dulbecco complet et riche en glucose (DMEM, 4,5 g/L de D-glucose, 4 mM de L-glutamine, 110 mg/L de pyruvate de sodium) complété par un antibiotique-antimycosique final à 1 % (v/v) (10 000 unités/mL de pénicilline, 10 000 μg/mL de streptomycine et 25 μg/mL d’amphotéricine B) et des quantités variables de sérum de veau fœtal (FBS) (voir le tableau des matériaux). Les quantités de FBS dans les milieux de différenciation varient entre 10 %, 5 % ou 2 % (v/v) FBS finaux.
2. Entretien des cellules
   1. Maintenir les cellules dans du DMEM complété par 10 % (v/v) de FBS et les placer à 37 °C et 5 % de CO₂, puis les ensemencer dans du DMEM contenant 5 % (v/v) de FBS pour la différenciation. Des stocks de cellules congelées ont été entreposés dans des FBS avec 10 % (v/v) de diméthylsulfoxyde (DMSO) à raison de 1-2 x 10⁷ cellules/mL.
3. Préparation de l’acide rétinoïque (AR)
   1. Dissoudre 7,51 mg d’all-trans-RA (voir le tableau des matières) dans 5 mL d’éthanol à 95 % fraîchement préparé pour obtenir 5 mM de solution mère. Vérifier la concentration avec absorbance à 350 nm (ɛ = 44 300 M-1 ^cm-1), obtenue à partir de la fiche d’information du produit du protocole⁸¹ du fabricant, en utilisant une dilution de la solution mère à 5 μM dans de l’éthanol. Conservez 5 mM de stock à l’abri de la lumière à 4 °C jusqu’à 6 semaines.
4. Préparation de la poly-D-lysine pour le revêtement de lamelles
   REMARQUE : Le protocole de produit de poly-D-lysine (PDL), qui se trouve dans la section Documents et téléchargements du site du fournisseur⁸², fournit des informations sur le revêtement d’une variété de récipients de culture.
   1. Ce protocole comprend des volumes basés sur une cuve chambrée à 2 puits d’une superficie de 4 cm² par puits avec des fonds en verre de protection en borosilicate stérile #1.5 (voir le tableau des matériaux). Diluer la solution mère de PDL deux fois à 50 μg/mL avec le PBS de Dulbecco (DPBS ; pas de calcium, pas de magnésium).
      REMARQUE : #1.5 ou #1.5H sont tous deux des épaisseurs acceptables, qui sont essentielles pour la qualité de l’image. D’autres épaisseurs induiront une aberration sphérique et doivent être évitées.
5. Revêtement de lamelles avec PDL
   REMARQUE : Les lamelles peuvent être exposées à la lumière ultraviolette (UV) pendant 10 à 15 minutes dans une enceinte de sécurité biologique pour une stérilisation ultérieure.
   1. Appliquer 1,2 mL de solution PDL à 50 μg/mL dans chaque puits de lamelles stériles chambrées dans une armoire de culture cellulaire et incuber à température ambiante pendant 1 h. Retirer la solution PDL et rincer trois fois avec 3,6 mL d’eau distillée. Une fois le lavage final terminé, laissez sécher la chambre revêtue pendant 2 h exposée à l’air avant de la rincer et de l’utiliser immédiatement ou de la conserver dans un récipient hermétique à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
      REMARQUE : Rincez abondamment les lamelles car l’excès de PDL peut être toxique pour les cellules.
6. Différenciation des cellules SH-SY5Y avec PR
   REMARQUE : N’utilisez pas de cellules au-dessus du passage 15. Les cellules sont traversées à 80 % à 90 % de confluence. Les procédures de différenciation diffèrent mais suivent des étapes similaires. Une différenciation supplémentaire des neuroblastomes en neurones matures est obtenue avec un traitement ultérieur avec le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF)68,83,84,85^, mais n’a pas été réalisée dans ce protocole.
   FACULTATIF : Établir les cellules pendant au moins 24 h avant de semer sur la vitre de protection. Pour préparer des cellules à partir de bouillons congelés, décongeler rapidement 1 mL de flacons congelés de cellules et ajouter à 9 mL de substrat préchauffé additionné de 10 % de FBS, puis essorer à 350 x g pendant 10 minutes (à température ambiante) et jeter le surnageant pour éliminer le DMSO. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 5 mL de milieux préchauffés et de cellules de semence dans une fiole T-25. Une fois que les cellules ont atteint 80 % à 90 % de confluence, faites passer les cellules en les comptant et en les ensemencant pour la différenciation, le cas échéant.
   1. Jour 0 : Cellules germées.
      1. Ensemencez les cellules sur un verre de protection chambré à partir de stocks congelés ou d’une fiole en état de marche. Utiliser une densité de semis de 1,5 x 10⁴ cellules/cm².
         REMARQUE : Un seul puits dans une vitre de protection standard à 2 puits avec une surface de culture de 4 cm² nécessitera 6,0 x 10⁴ cellules. Les cellules qui resteront indifférenciées doivent être ensemencées avec du DMEM complété par 10 % (v/v) de FBS, et les cellules qui seront différenciées doivent être ensemencées avec du DMEM complété par 5 % (v/v) de FBS.
   2. Jour 1 : Commencer le traitement de différenciation de la polyarthrite rhumatoïde.
      1. Préparer le DMEM complété par 5 % (v/v) de FBS, 1 % (v/v) d’antibiotique-antimycosique et une concentration finale de 10 μM de RA ou d’éthanol du même volume d’additif pour servir de contrôle du véhicule pour cette procédure de différenciation. Retirez le substrat dans le verre de protection chambré utilisé pour l’ensemencement, rincez avec 1x PBS et ajoutez le nouveau DMEM dans les puits.
   3. Jour 3 : Remplacez le média par un média frais contenant de l’AR ou de l’éthanol.
      1. Retirer le milieu du jour 1 et le remplacer par un milieu neuf complété par 2 % (v/v) de FBS, 1 % (v/v) d’antibiotique-antimycosique et 10 μM de RA ou 95 % d’éthanol du même volume d’additif pour servir de contrôle du véhicule pour cette procédure de différenciation. Retirez le substrat dans le verre de protection chambré utilisé pour l’ensemencement, rincez avec 1x PBS et ajoutez un nouveau média dans les puits.
   4. Jour 6 : Réalisation de l’imagerie des cellules.
      REMARQUE : Les temps de différenciation cellulaire varient selon le protocole, mais six jours d’exposition à la PR sont suffisants pour induire un phénotype de type neurone dans les cellules SH-SY5Y⁸⁶.
      1. Effectuez des images en direct, avec les détails des sections 3 et 4 (Figure 2).

2. Culture primaire de neurones hippocampiques de rat

1. Préparation de matériaux pour l’isolement des neurones de l’hippocampe du rat.
   1. Préparez du DMEM frais supplémenté.
      1. Filtrer et stériliser un mélange de DMEM (glucose élevé, sans pyruvate de sodium) complété par 10 % (v/v) de FBS inactivé par la chaleur, 1 % (v/v) de solution de pyruvate de sodium et 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL). Conserver jusqu’à 2 semaines à 4 °C.
   2. Préparez un milieu de croissance neuronal frais supplémenté.
      1. Filtrer et stériliser un mélange de milieux de croissance neuronales additionné de 2 % (v/v) de vitamine B27, de 0,25 % (v/v) de glutamine et de 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine (voir le tableau des matériaux). Conserver jusqu’à 2 semaines à 4 °C.
2. Préparer la culture primaire des neurones de l’hippocampe.
   1. Préparer la culture primaire des neurones de l’hippocampe à la suite de travaux publiés précédemment⁸⁷ et à partir du protocole du produit sur le site du fabricant à partir duquel l’hippocampe de rat E18 disséqué est obtenu⁸⁸ (voir le tableau des matériaux). Ce protocole aboutit à une population principalement neuronale avec <2% d’astrocytes.
      REMARQUE : Le milieu d’hibernation avec lequel ce tissu est expédié sera utilisé pour les prochaines étapes de ce protocole. Ne le jetez pas.
   2. Préparer les matériaux et les milieux pour la dissociation des tissus.
      1. Allumez une pipette Pasteur pour diminuer le diamètre de l’ouverture et rangez-la dans une feuille d’aluminium pour éviter toute contamination jusqu’à l’utilisation. Préchauffer le DMEM préparé, la solution saline tamponnée de Hank (HBSS) et le milieu de croissance des neurones à 37 °C. Ajouter 2 flocons de DNAase à l’aide d’une pince à épiler stérile dans un tube conique de 15 ml.
   3. Effectuer la dissociation tissulaire.
      1. Retirez autant que possible le milieu d’hibernation dans lequel l’hippocampe de rat E18 disséqué est stocké avant de placer le tissu dans le tube conique de 15 ml contenant l’ADNase et d’incuber brièvement à 37 °C. Ajouter 900 μL de 1X HBSS suivi de 100 μL de trypsine à 0,5 %. Incuber le tissu à 37 °C pendant 15 min.
         REMARQUE : Les plaques revêtues de PDL peuvent être retirées de l’entreposage et placées dans un incubateur jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pendant cette période d’incubation.
   4. Effectuer l’homogénéisation des tissus et le comptage cellulaire.
      1. Après l’incubation avec la trypsine, retirer le milieu et ajouter 1 mL de milieu d’hibernation-ADNase préchauffé de l’étape précédente au tissu et homogénéiser avec la pipette Pasteur. Le support aura l’air opaque, puis s’éclaircira progressivement au fur et à mesure que l’homogénéisation se poursuivra.
      2. Ajoutez des neurones dissociés dans un nouveau tube avec 4 ml de DMEM préchauffé, puis comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
   5. Effectuer le placage cellulaire et la croissance des cellules primaires.
      1. Cellules à plaques d’une densité d’environ 1,65 x 10⁴ cellules/cm² en DMEM. Pour une vitre de protection à 2 puits (4 cm 2), ensemencer 65 000 à 70 000 cellules par puits avec² mL de DMEM. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO 2 pendant₂ h avant de vérifier l’adhérence. Une fois que les cellules commencent à adhérer, retirez 1 mL de milieu et remplacez-le par le même volume de milieu d’hibernation, puis agitez doucement pour mélanger. Une fois le milieu mélangé, répétez ce processus et retirez la moitié du milieu présent et remplacez-le par le même volume de milieu de croissance neuronale, puis mélangez doucement.
         REMARQUE : Le jour du placage est considéré comme un jour in vitro (DIV) 0, et les cellules sont prêtes à être photographiées à la DIV 7 (Figure 2).

3. Préparation des cellules pour l’imagerie des cellules vivantes

REMARQUE : Les types et l’origine des cellules (c.-à-d. les cellules cultivées et primaires) peuvent différer en ce qui concerne les exigences en matière de coloration ; Voir les rapports publiés pour plus de détails^62,63.

1. Préparation de PKmito Orange
   REMARQUE : D’autres colorants qui colorent généralement l’IMM ont été signalés^64,65,66 et sont disponibles dans le commerce. PKMO est le seul utilisé dans ce protocole.
   1. Remettre en suspension la poudre PKMO (voir le tableau des matériaux) dans du DMSO conformément aux instructions du fabricant⁸⁹. Aspirez le milieu des cellules et lavez-le dans un milieu préchauffé sans rouge phénol. Préparer un stock de PKMO dans du DMEM préchauffé, sans rouge phénolique, complété par 2 % (v/v) de FBS ou 10 % (v/v) selon l’état de différenciation, HEPES jusqu’à une concentration finale de 20 mM et 1 % (v/v) d’antibiotique-antimycosique avant de colorer les cellules en suivant les instructions du fabricant. Cette formulation, sans PKMO, est le milieu d’imagerie des cellules vivantes.
2. Coloration cellulaire avec PKMO
   1. Incuber les cellules avec le colorant à 37 °C et 5% de CO_2, pendant 30 min. Laver les cellules trois fois avec des milieux d’imagerie de cellules vivantes, et pour le lavage final, incuber pendant 30 minutes à 37 °C, 5 % de CO₂.
   2. Ajoutez des milieux d’imagerie de cellules vivantes frais et préchauffés. Les cellules sont maintenant prêtes pour l’imagerie.
      REMARQUE : Les traitements aigus (p. ex., médicaments et/ou facteurs de stress), lorsqu’ils sont utilisés, sont ajoutés avant l’imagerie en direct ; voir la section Discussion et la figure supplémentaire 1.

4. Imagerie de cellules vivantes par microscopie STED

REMARQUE : Ce protocole utilise un système STED construit autour d’un microscope inversé, le système étant spécifié dans le tableau des matériaux. Ce système est équipé de lasers à excitation pulsée (laser 561 nm avec puissance nominale ~300 μW) et d’un laser d’appauvrissement STED pulsé de 775 nm (puissance nominale 1,2 W), d’un scanner galvano réglable en continu et d’un détecteur de photodiodes à avalanche (APD) à filtre 615/20 nm. Une lentille à immersion dans l’huile 100x/1,40 pour STED est utilisée ici. Le logiciel Lightbox est utilisé pour l’acquisition d’images. Tous les détails fournis sont directement liés à ce logiciel et à la configuration du système.

1. Directives générales et étapes pour l’imagerie
   1. Utilisez un incubateur ou une chambre environnementale pour maintenir la viabilité des cellules, mais les expériences à température ambiante à court terme sont également acceptables. Ces étapes sont spécifiques à la configuration STED décrite ci-dessus.
   2. Sélectionnez les jeux de laser et de filtres pour l’imagerie.
      1. Utilisez les paramètres d’un colorant orange en sélectionnant le ou les colorants utilisés dans la coloration dans la liste des colorants, ou celui dont les propriétés spectrales sont les plus proches du ou des colorants utilisés. Activez-les en double-cliquant ou en les faisant glisser vers la liste d’exemples, où il est indiqué « Faites glisser le(s) colorant(s) ici ».
   3. Sélectionnez une région à imager.
      1. Dans une vue d’ensemble, créez une région d’intérêt (ROI) autour d’une mitochondrie d’intérêt en sélectionnant le bouton rectangulaire ROI et en cliquant et en faisant glisser pour façonner la région. Le ROI peut être redimensionné et pivoté à l’aide des coins ROI ou des bords incurvés qui apparaissent lorsque vous passez la souris sur un coin.
         REMARQUE : Un résumé des paramètres d’imagerie suggérés se trouve dans le tableau 1. Ces paramètres ont été ajustés empiriquement à l’aide de ceux précédemment rapportés pour cette configuration STED et cette combinaison de colorants⁶³.
   4. Mettez en place un portail.
      1. À côté du menu Général , sélectionnez le menu Déclenchement ou cliquez longuement pour ajouter le menu à la vue. Il est recommandé d’ajuster l’extrémité du détecteur STED à 1-1,05 à 7,8-7,85 ns, comme présenté ici. Les temps de déclenchement peuvent varier et être aussi courts que 1-1,05 à 7-7,05 ns.
   5. Ajustez l’intensité de manière appropriée en fonction de l’échantillon.
      REMARQUE : Généralement, la puissance d’excitation utilisée pour STED est 2 à 3 fois supérieure à la puissance utilisée pour le confocal, de sorte qu’un échantillon nécessitant une puissance laser d’excitation de 5% pour le confocal peut utiliser une puissance laser d’excitation de 10% à 15% pendant l’acquisition de STED.
      1. Réglez le laser d’excitation pour STED sur 15%-20% et le laser d’appauvrissement STED sur 20%-25% avec des accumulations de 10 lignes. Utilisez un temps d’arrêt des pixels de 4 μs avec une taille de pixel de 20 à 25 nm. Le trou d’épingle a été maintenu à 1,0 UA pour les cellules en culture et à 0,7 UA pour les cellules primaires de l’hippocampe de rat afin d’améliorer la section optique dans les mitochondries les plus denses.
         REMARQUE : Les images confocales et STED peuvent toutes deux être acquises pour une comparaison côte à côte (Figure 3A, B, Figure 4A) ou seule la STED peut être acquise.
2. Informations supplémentaires pour les séries chronologiques/z-series
   1. Sélectionnez la série chronologique.
      1. Sélectionnez le menu déroulant Heure . Définissez le nombre d’itérations (5 utilisées ici) et l’intervalle de temps (25 ou 30 s utilisé ici) souhaité pour un timelapse (Figure 3C, D, Figure 4B).
         REMARQUE : Si l’intervalle est plus court que le temps d’acquisition, les itérations se poursuivront sans délai. Lors de l’exécution d’un timelapse, il est fortement recommandé d’utiliser une unité de mise au point parfaite ou un suivi de mise au point similaire pour éviter toute dérive potentielle.
   2. Réglez la plage de volume.
      1. Réglez la plage de volume z comme vous le souhaitez en activant l’option Volume et en ajustant les deux extrémités de la plage. La taille des pas utilisée dans ce protocole pour l’imagerie 2D était de 150 à 200 nm. La taille de pas recommandée par rapport à l’échantillonnage de Nyquist requis pour la déconvolution du STED brut peut être calculée à l’aide d’outils en ligne⁹⁰.
         REMARQUE : La puissance du laser d’épuisement STED et le nombre de plans imagés peuvent augmenter le photoblanchiment du colorant et l’exposition à la lumière de la cellule à des niveaux nocifs. Vérifiez s’il y a des signes de phototoxicité et de photodommages après l’acquisition.

5. Outils de traitement et d’analyse de l’ultrastructure mitochondriale

REMARQUE : Le traitement d’image (c’est-à-dire la déconvolution) est facultatif, mais généralement utilisé lors de la création et de l’analyse d’images STED en vue de leur publication. La déconvolution pour améliorer le contraste et réduire le bruit est fortement suggérée pour une segmentation optimale des crêtes individuelles, comme décrit ci-dessous (Figure 2).

1. Déconvolution d’image STED
   REMARQUE : Le logiciel utilisé pour la déconvolution dans ce protocole est fourni dans le tableau des matériaux.
   1. Définissez les paramètres microscopiques de l’image.
      REMARQUE : Assurez-vous que les métadonnées du microscope sont correctement saisies dans les paramètres microscopiques de l’image. Cela inclut l’indice de réfraction du milieu de montage ; milieu d’immersion ; taille des pixels ; les longueurs d’onde d’excitation, d’émission et d’épuisement ; et toute autre information pertinente. Les modèles avec ces paramètres peuvent être enregistrés pour être réutilisés.
   2. Déconvolutez les images STED brutes à l’aide de l’algorithme logiciel.
      1. L’accès aux algorithmes de déconvolution automatisés dans les logiciels de déconvolution permet un traitement d’image par déconvolution sans intervention. Sélectionnez le bouton Express et définissez le type de déconvolution sur Rapide, Standard, Agressif ou Conservateur pour différents degrés de puissance de déconvolution. Des images représentatives utilisant la déconvolution express avec des paramètres agressifs sont présentées (Figure 3, Figure 4 et Figure 5).
      2. Enregistrez les images du logiciel de déconvolution au format ICS2.
   3. Pour la déconvolution manuelle, effectuez les opérations suivantes.
      1. En bref, lorsque vous effectuez une déconvolution manuelle, enregistrez les modèles de l’assistant de déconvolution par souci de cohérence et ayez la possibilité de charger un modèle au démarrage de l’assistant. Utilisez les informations de la fonction d’étalement des points mesurés (PSF) si elles sont générées avec la configuration et les paramètres d’acquisition.
      2. Recadrez l’image STED brute, si nécessaire, avant que le logiciel de déconvolution ne stabilise automatiquement l’image. Les modules complémentaires aux progiciels de déconvolution permettent une compensation spécifique d’éventuels artefacts d’imagerie tels que la dérive thermique et les aberrations chromatiques.
      3. Ensuite, générez un histogramme logarithmique pour effectuer manuellement ou automatiquement une soustraction en arrière-plan. Sélectionnez l’algorithme de déconvolution classique d’estimation du maximum de vraisemblance (CMLE).
         REMARQUE : Pour la déconvolution, les valeurs clés à ajuster sont le seuil de rapport signal/bruit, le nombre d’itérations et le seuil de qualité. Ces valeurs peuvent être ajustées et la déconvolution peut être prévisualisée pour déterminer les paramètres optimaux.
2. Segmentation et analyse des particules
   NOTE : Ce protocole utilise FIJI (Is Just ImageJ), un logiciel open-source (voir Table des matériaux), à des fins de segmentation et d’analyse. D’autres logiciels comparables, notamment CellProfiler, Icy, Ilastik et QuPath, sont disponibles à ces fins.
   1. Préparez les images pour la segmentation.
      1. Ouvrez les images STED brutes .obf ou les fichiers .ics2 à partir du logiciel de déconvolution en accédant à Fichier → Ouvrir ou en cliquant et en faisant glisser les fichiers vers la barre d’outils ImageJ. À partir de là, tout traitement qui facilite la segmentation des images peut être effectué avant la segmentation.
      2. Pour que les modifications restent cohérentes, enregistrez les fonctions à l’aide des plug-ins → des macros → Enregistrer et copiez-collez les raccourcis clavier dans une nouvelle macro, à partir de Plugins → Nouvelle macro →. Assurez-vous de sélectionner l’image à traiter avant d’exécuter la macro.
         REMARQUE : Les modifications couramment acceptées pour la quantification de la taille et de la forme comprennent le recadrage, la projection d’une pile z et la soustraction de l’arrière-plan avec le lissage désactivé. Les modifications doivent être effectuées de manière cohérente entre les images d’un ensemble de données et signalées.
   2. Ajuster les paramètres de segmentation Weka pouvant être entraînés
      REMARQUE : Des détails supplémentaires avec des instructions étape par étape pour l’utilisation de l’outil de segmentation semi-automatique et des analyses en aval pour les mitochondries ont été publiés⁹¹.
      1. Ouvrez les images STED déconvoluées dans le plug-in Trainable Weka Segmentation (TWS)⁹² , situé sous Plugins → Segmentation → Trainable Weka Segmentation. Dans les paramètres de segmentation, sélectionnez les fonctions Flou gaussien, Projections de membrane et Filtre Sobel . L’épaisseur de membrane par défaut est 1 et la taille par défaut du patch de membrane est 19.
      2. Étiquetez la classe 1 ou 2 comme « Cristae » et l’autre comme « Arrière-plan » (Figure 2). Les modèles peuvent également être enregistrés à l’aide du bouton Enregistrer le classificateur . Sélectionnez le classificateur de charge pour réutiliser ces paramètres pour d’autres images.
   3. Effectuez des suivis de classe TWS.
      1. Utilisez l’outil Ligne ou d’autres formes pour mettre en évidence certaines des crêtes ou de l’arrière-plan. Au moins certaines sélections d’arrière-plan doivent inclure des espaces entre les cristae. Tracez une ligne sur la structure à attribuer à l’une ou l’autre des classes, puis sélectionnez le bouton Ajouter à sur le côté droit pour les crêtes ou l’arrière-plan. Double-cliquez sur une trace pour supprimer la structure de cette étiquette.
   4. Effectuer une formation à la classification TWS.
      1. Sélectionnez le bouton Entraîner le classificateur sur le côté gauche pour générer une carte basée sur les informations fournies au plug-in. La superposition des classes segmentées peut être activée ou désactivée à l’aide du bouton Activer/désactiver la superposition, et l’opacité de la superposition peut être ajustée dans les paramètres. Le classificateur peut être réentraîné avec des étiquettes supplémentaires. Une fois satisfait, sélectionnez le bouton Obtenir la probabilité.
   5. Mesurez les particules.
      1. À l’aide de la carte de probabilité des crêtes, mettez l’image en seuil pour générer un masque, puis accédez à Analyser → Analyser les particules. En règle générale, le type de seuil par défaut peut être utilisé et la plage ajustée pour s’assurer que l’ensemble des crêtes est pris en compte. Les mesures fournies par l’analyse des particules peuvent être ajustées à l’aide de l’option Analyser → Définir les mesures.
         REMARQUE : Des exemples de paramètres de taille et de forme tels que la surface, le périmètre, la circularité et le rapport hauteur/largeur des crêtes sont mesurés et affichés en fonction des mesures sélectionnées (Figure 2, Figure 5A, Tableau supplémentaire 1).
      2. FACULTATIF : Sélectionnez l’image STED brute avec les mêmes dimensions que l’image déconvoluée et appliquez les ROI à partir du gestionnaire, puis sélectionnez Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir des valeurs d’intensité.
   6. Obtenir des tracés linéaires.
      1. Des tracés linéaires ont été générés à partir des images STED déconvoluées. Tracez une ligne multipoints, ajustez l’épaisseur de la ligne à plusieurs pixels de large pour faire la moyenne du bruit et cannelez la ligne pour l’adapter aux mitochondries (Figure 2, Figure 5B). Le tracé linéaire généré est utilisé pour mesurer les distances crête à crête afin de rendre compte de la périodicité et de la distribution des crêtes sur une certaine plage.
         REMARQUE : Dans le même ordre d’idées, la densité des crêtes peut être rapportée comme le nombre de crêtes indépendantes dans une zone donnée, déterminé en mesurant la partie externe des mitochondries. La zone mitochondriale peut être déterminée en appliquant un filtre à l’image STED déconvoluée ou brute pour générer un masque. Assurez-vous que le masque s’adapte précisément au contour des mitochondries avant de mesurer la zone.

Ce protocole décrit les conditions de croissance cellulaire pour les cellules en culture et primaires, en mettant l’accent sur l’imagerie STED des cellules vivantes et les analyses ultérieures des crêtes mitochondriales. Les projections faites avec ImageJ de mitochondries à partir de cellules SH-SY5Y indifférenciées (Figure 3A) et SH-SY5Y différenciées par RA (Figure 3B) peuvent être collectées sous forme d’empilements z avec des cellules confocales et STED traditionnelles, et les images STED brutes peuvent ensuite être déconvoluées. L’imagerie timelapse peut également être réalisée et ensuite déconvoluée (Figure 3C,D). À l’aide de paramètres d’imagerie légèrement différents pour les neurones primaires de l’hippocampe du rat (tableau 1), les images confocales et brutes de STED peuvent être acquises sous forme de z-stacks, et les images brutes de STED peuvent être déconvoluées (Figure 4A). L’imagerie timelapse des mitochondries des neurones primaires est également possible (Figure 4B). En général, les images time-lapse doivent être en mesure de montrer des événements dynamiques mitochondriaux.

Lorsque les projections brutes STED et déconvoluées STED z-stack à partir des échantillons utilisés pour la segmentation semblent cohérentes, des mesures quantitatives sont effectuées. Le plug-in TWS utilise l’image STED déconvoluée pour segmenter afin de créer un masque de probabilité, qui est ensuite utilisé pour créer un masque binaire des crêtes afin d’obtenir des paramètres de taille et de forme (Figure 5A). Les régions de ce masque sont enregistrées dans le gestionnaire de retour sur investissement et peuvent être appliquées à l’image STED brute si vous le souhaitez pour mesurer les différences d’intensité relative. Les projections STED déconvoluées peuvent également être utilisées pour déterminer la périodicité et la densité des crêtes dans une zone donnée (Figure 5B).

Figure 1 : Morphologie mitochondriale. Les mitochondries ont un système à deux membranes qui définit différents sous-compartiments (A). Les crêtes sont des plis de la membrane interne avec des caractéristiques définies (B). Abréviations : OMM, membrane mitochondriale externe ; ICS, espace intracristallin ; IMS, espace intermembranaire ; CM, membrane des crêtes ; IBM, membrane limite interne ; IMM, membrane mitochondriale interne ; TDM, pointe de la crête ; CJ, carrefour des cristae. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Schéma du flux de travail. Les cellules SH-SY5Y ou neurones primaires de l’hippocampe du rat sont cultivées sur une vitre de protection revêtue de PDL. Les cellules SH-SY5Y sont cultivées en parallèle pour rester indifférenciées ou soumises à la différenciation de la PR pendant six jours. Les neurones primaires de l’hippocampe du rat ont été cultivés sur une vitre de couverture recouverte de PDL après avoir été isolés de sections de l’hippocampe pendant sept jours. Une fois prêtes à être imagées, les cellules ont été colorées avec PKMO et imagées avec STED. Les images STED brutes sont ensuite déconvoluées, et les images déconvoluées sont traitées dans FIJI pour obtenir des mesures de taille et de forme, telles que la densité des crêtes, la surface, le périmètre, la circularité et le rapport hauteur/largeur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Imagerie des mitochondries dans les cellules SH-SY5Y. Des projections confocales représentatives (à gauche), STED brutes (au centre) et déconvoluées par Huygens (à droite) de mitochondries à partir de cellules SH-SY5Y non différenciées (A) et différenciées par RA (B) avec coloration PKMO sont présentées. Un timelapse avec des intervalles de 30 s et 5 itérations de cellules SH-SY5Y différenciées par RA est montré (C) avec des régions sélectionnées (boîtes blanches) développées (D) à l’aide d’images à l’échelle de ces régions sans interpolation. Barres d’échelle : A, B, 250 nm ; C,D, 1 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Imagerie des mitochondries dans les neurones primaires de l’hippocampe du rat. Des projections confocales représentatives (à gauche), STED brutes (au centre) et STED déconvoluées de Huygens (à droite) de mitochondries provenant de neurones primaires de l’hippocampe de rat sont représentées (A). Un timelapse avec des intervalles de 25 s et 5 itérations de mitochondries dans ces neurones est montré (B). Barres d’échelle : A, 250 nm ; B, 1 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Traitement d’images STED déconvoluées dans ImageJ. L’utilisation représentative du plugin Trainable Weka Segmentation pour mesurer la taille et la forme des crêtes est illustrée (A). De gauche à droite, les images suivantes sont montrées : l’image STED déconvoluée, la carte de probabilité basée sur la segmentation du plug-in TWS, le masque de seuillage dans FIJI en utilisant la carte de probabilité en entrée, le masque avec les ROI soulignés et les ROI superposés à l’image STED déconvoluée d’origine. Les mesures de surface, de périmètre, de circularité et de rapport d’aspect correspondant à ces objets se trouvent dans le tableau supplémentaire 1. Un tracé linéaire utilisant l’image STED déconvoluée pour mesurer les distances crête à crête comme lecture de la densité des crêtes est montré (B). Barres d’échelle : 0,5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Récapitulatif des paramètres d’acquisition de STED. Les paramètres utilisés pour l’imagerie STED 2D pour chaque type de cellule, SH-SY5Y indifférencié, SH-SY5Y différencié par PR et neurones primaires de l’hippocampe de rat, sont affichés. Pour tous les time-lapses, 5 itérations ont été prises avec des intervalles variables en fonction de la taille du retour sur investissement.

Figure supplémentaire 1 : Imagerie des cellules SH-SY5Y avec ajout d’β amyloïde (Aβ). Des images confocales représentatives (à gauche), STED brutes (au centre) et STED déconvoluées (à droite) de cellules SH-SY5Y différenciées par PR avec coloration PKMO (en haut) et Aβ-HiLyte647 (en bas) sont présentées (A). Des projections z-stack fusionnées de PKMO STED brut (vert) avec Aβ STED brut (magenta) (B) ou PKMO STED déconvolué (vert) avec Aβ STED (magenta) (C) déconvolué sont présentées. Barres d’échelle : 0,5 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Mesures de taille et de forme des crêtes segmentées. Les mesures de taille et de forme de la surface (μm2), du périmètre (μm), de la circularité et du rapport hauteur/largeur, correspondant aux objets délimités dans la figure 5A à partir de mitochondries segmentées, sont indiquées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Résumé des paramètres d’acquisition avec des échantillons de β amyloïde. Les paramètres utilisés pour l’imagerie STED 2D de PKMO et Aβ-HiLyte647 dans les cellules SH-SY5Y indifférenciées et différenciées par RA sont affichés. Confocal d’Aβ-HiLyte647 peut être utilisé seul car il n’y a pas de structure spécifique à résoudre ; Des images STED d’Aβ-HiLyte647 sont présentées ici pour des tailles de particules plus petites. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier complémentaire 1 : Protocole de traitement de l’amyloïde β. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.