Dépistage analogique du fentanyl à l’aide de LC-TIMS-TOF MS/MS

Résumé

Méthode de criblage d’analogues du fentanyl en fonction de leur temps de rétention, de leur mobilité et de leur profil de fragmentation par spectrométrie de masse.

Résumé

L’utilisation du fentanyl et l’émergence d’analogues du fentanyl au cours des dernières décennies sont devenues une préoccupation croissante pour la communauté dans son ensemble. Le fentanyl et ses analogues sont les principaux facteurs contribuant aux surdoses mortelles et non mortelles aux États-Unis. Les cas les plus récents de surdose liée au fentanyl sont liés au fentanyl fabriqué illégalement et à sa puissance extrême. Dans le présent travail, nous décrivons un protocole analytique à haut débit pour le dépistage des analogues du fentanyl. L’utilisation de la chromatographie liquide complémentaire, de la spectrométrie de mobilité des ions piégés et de la spectrométrie de masse en tandem permet de séparer et d’attribuer des centaines d’analogues du fentanyl à partir d’un seul échantillon en un seul balayage. L’approche décrite tire parti du développement récent de l’acquisition dépendante des données et de l’acquisition indépendante des données utilisant l’accumulation parallèle dans le piège de la mobilité, suivie d’une fragmentation séquentielle utilisant la dissociation induite par la collision. Les analogues du fentanyl sont attribués avec certitude en fonction de leur temps de rétention, de leur mobilité et de leur profil de fragmentation de la MS.

Introduction

Le fentanyl et ses analogues sont les principaux facteurs de surdoses mortelles et non mortelles aux États-Unis ^1,2. Le Center for Disease Control and Prevention (CDC) a indiqué que le nombre de décès par surdose liés aux opioïdes synthétiques de 2013 à 2021 était supérieur à 258 000. Rien qu’en 2021, plus de 68 000 décès par surdose ont pu être attribués aux opioïdes synthétiques, soit 82 % de tous les décès par surdose dans le pays³. Depuis 2013, des centaines d’analogues du fentanyl ont été identifiés, avec une puissance variable⁴. Avec l’émergence d’analogues du fentanyl fabriqués illégalement, l’opioïde synthétique de l’annexe II lui-même reste l’opioïde synthétique le plus populaire disponible aux États-Unis³. Selon le Center for Forensic Science Research and Education (CFSRE), le fluorofentanyl était le fluorofentanyl, et d’autres opioïdes synthétiques non liés au fentanyl sont désormais introduits à un rythme rapide sur le marché volatile des drogues⁵.

En raison du volume écrasant de fentanyl et d’analogues apparentés au fentanyl circulant sur le marché de la drogue, la DEA a mis en œuvre un programme de profilage de la signature du fentanyl intitulé Operation Death Dragon, afin de suivre la méthodologie utilisée pour synthétiser ces composés dans l’espoir de relier les saisies de drogue à leur origine⁶. En 2018, 94 % des saisies de drogue ont été identifiées comme étant synthétisées par la méthode Janssen, tandis que les 6 % restants ont été synthétisés par la méthode Siegfried⁶. La principale différence entre les deux méthodes est la présence de l’analogue du fentanyl, le benzyl fentanyl, détecté comme une impureté dans la méthode Janssen, tandis que la présence de despropionyl fentanyl (4-ANPP), un métabolite/précurseur du fentanyl, est une impureté détectée lors de la synthèse avec la méthode Siegfried⁷.

L’utilisation de la chromatographie en phase gazeuse et liquide en tandem avec la spectrométrie de masse (GC-MS et LC-MS, respectivement) pour le dépistage et la quantification ciblés des opioïdes synthétiques est régulièrement mise en œuvre dans les laboratoires de toxicologie. La GC-MS a été considérée comme l’étalon-or pour la détection des drogues d’abus dans les échantillons biologiques. L’accès à des bibliothèques spectrales de masse accessibles au^public8 et à des instruments commercialisés sous forme de systèmes prêts à l’emploi⁹ sont quelques-unes des raisons pour lesquelles la GC-MS est restée une partie intégrante des laboratoires, tant pour le dépistage complet que pour la quantification ciblée ^9,10. Cependant, les méthodes actuelles de quantification de la GC-MS dans la littérature ont tendance à avoir une portée limitée des analytes¹¹ et deviennent rapidement obsolètes et non applicables aux cas actuels. Plus important encore, les limites de détection et de quantification ne sont pas comparables à celles des méthodes LC-MS (< 1 ng/mL)¹², ce qui augmente le risque de résultats faussement négatifs. L’une de ces comparaisons entre la GC-MS et la LC-MS, qui a porté sur des échantillons post-mortem, a révélé que sur 134 cas de carfentanil identifiés positivement, l’un des opioïdes synthétiques les plus puissants à ce jour, 104 de ces cas ont été testés négatifs pour le carfentanil à l’aide de la GC-MS¹³. Dans les laboratoires d’analyse de drogues, la GC-MS est plus fréquemment utilisée et modifiable pour les opioïdes synthétiques en raison de la forte concentration des échantillons analysés. Pourtant, la GC-MS est toujours utilisée en conjonction avec des techniques supplémentaires telles que la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) et la microscopie électronique à balayage (MEB) pour la confirmation de ces composés¹⁴. L’application de la GC-MS à l’analyse d’échantillons biologiques en toxicologie médico-légale nécessite des méthodes de préparation d’échantillons qui incluent l’extraction de ces composés par extraction liquide-liquide (LLE) ou extraction en phase solide (SPE)¹⁵. La LLE peut être réalisée avec une variété de solvants, mais dans un laboratoire à haute production, la LLE peut ne pas être rentable ou rapide. La LLE consomme de grandes quantités de solvants ainsi que le volume d’échantillons, tandis que l’alternative, SPE, peut être automatisée et nécessite un volume d’échantillon minimum^{de 16}. Une étude récente de GC-MS a révélé la séparation de 20 analogues isomères différents du fentanyl à l’aide de trois programmes thermiques GC^distincts17. Bien que la séparation de référence entre les isomères ait été couronnée de succès, l’applicabilité de cette méthode aux dossiers et aux flux de travail médico-légaux pertinents est limitée.

La LC-MS a gagné en popularité dans les tests médico-légaux, notamment en raison des limites de la GC-MS lorsqu’il s’agit de composés non volatils et sensibles à la chaleur^18,19. Le dépistage par LC-MS à l’aide de triples quadripôles (QQQ) et d’instruments de piège à ions a permis de détecter les opioïdes synthétiques à de faibles concentrations (<1 ng/mL)12,20,21,22,23,24. En règle générale, ces méthodes LC-MS sont utilisées comme méthodes de confirmation secondaire pour compléter les résultats de l’immunodosage et/ou de la GC-MS. En 2017, Shoff et al. du laboratoire de toxicologie du département du médecin légiste du comté de Miami-Dade (MDME) ont développé une méthode de dépistage complète pour 44 composés liés aux opioïdes à l’aide de la chromatographie liquide à ultra haute pression (UHPLC)-piège à ions MS^{n 13}. Semblable aux méthodes MRM ciblées, cette méthode de piège à ions utilisait une liste de précurseurs programmés (SPL) contenant les temps de rétention, les ions cibles précurseurs, ainsi que les ions filles primaires pour la fragmentation spectrale de MS³ lorsque cela était possible. Ce qui distingue cette méthode de criblage des méthodes développées sur les triples quadripôles et les pièges à ions quadripolaires linéaires, c’est le détail supplémentaire fourni dans les données spectrales. Ce que cette méthode de criblage ne peut pas fournir, c’est l’analyse quantitative, qui est rarement développée sur l’instrumentation des pièges à ions, ainsi que l’identification d’inconnues¹³. Les méthodes LC-QQQ pour les opioïdes synthétiques permettent de dépister et de quantifier simultanément une liste de cibles prédéfinies. L’utilisation de transitions de surveillance des réactions multiples (MRM) pour l’identification et la quantification des composés est une technique d’acquisition de données fiable et la technique la plus couramment utilisée dans la littérature pour la détection des opioïdes synthétiques^12,20. Les plages linéaires rapportées pour la quantification d’un éventail d’opioïdes synthétiques vont de 0,01 à 100 ng/mL, tandis que les opioïdes synthétiques plus puissants, tels que le carfentanil, sont détectés dans la plage inférieure à ng/mL¹, ^{1, 24, 25, 26, 27}.

La séparation des opioïdes synthétiques isomères a été abordée dans les méthodes LC-MS. L’une de ces méthodes a permis de séparer 174 analogues isomères du fentanyl en 16 minutes à l’aide d’une colonne de biphényle²⁸. De plus, les fluctuations des paramètres dépendants de la LC, tels que l’efficacité de la colonne, le pH de la phase mobile et les changements de pression, créent des décalages du temps de rétention qui doivent être pris en compte dans des essais ciblés avec une surveillance cohérente et des fenêtres de collecte plus grandes (>0,4 min), ce qui peut entraîner un chevauchement potentiel de ces isomères une fois résolus. D’autres techniques chromatographiques pour la séparation des isomères ont été explorées, notamment l’utilisation de la chromatographie liquide bidimensionnelle (2D-LC)²⁹ ; Et bien que cette technique ait la capacité de fournir une séparation orthogonale des composés, les inconvénients l’emportent sur les avantages, notamment les temps d’exécution excessifs, le coût, la difficulté de développement de la méthode et l’utilité par rapport aux séparations alternatives³⁰.

La spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) devient de plus en plus fiable pour l’identification des opioïdes synthétiques. Plusieurs sociétés d’instrumentation ont commercialisé des méthodes ciblées développées dans le but d’identifier une large gamme d’opioïdes synthétiques dans des matrices biologiques complexes 19,28,31. Ces méthodes, contrairement aux méthodes décrites précédemment, peuvent stocker des données analytiques pour une analyse rétroactive. Ainsi, les spécimens qui ont déjà été analysés avec des résultats indéterminés peuvent être revisités plus tard pour la découverte de composés nouvellement identifiés. Ce qui distingue le HRMS du QQQ, c’est l’identification précise des masses. Bien que les deux techniques de MS puissent quantifier avec précision à de faibles concentrations, la HRMS s’est avérée plus efficace pour le dépistage initial et la découverte de composés inconnus 32,33,34. La HRMS, en particulier les analyseurs de MS à temps de vol (TOF), a été à l’avant-garde de la découverte des NPS, permettant aux laboratoires d’analyses médico-légales de fournir des données urgentes sur de nouveaux composés aux forces de l’ordre et à la communauté scientifique afin d’étendre la propagation de certains de ces composés tout en augmentant la sensibilisation et l’éducation³³. L’utilisation du TOF pour la détection des stupéfiants est devenue extrêmement répandue, avec des méthodes contenant plus de 600 composés séparés dans un programme chromatographique de 10 minutes. Des études antérieures ont rapporté les avantages de la spectroscopie de mobilité des ions piégés (TIMS) couplée à la TOF pour la détection et la séparation des opioïdes isomères³⁵.

Tirant parti de l’orthogonalité entre la chromatographie liquide, la spectrométrie de mobilité des ions piégés et la spectrométrie de masse, la méthode présentée fournit une large caractérisation des analogues du fentanyl en fonction du temps de rétention, du profil isotopique, de la mobilité et du modèle de fragmentation.

Protocole

1. Préparation de l’échantillon

1. Conservez la trousse de dépistage analogique du fentanyl à -20 °C une fois qu’elle a été reçue. Remettre chaque échantillon en suspension jusqu’à une concentration finale de 400 μg/mL par l’ajout de 500 μL de méthanol pur de qualité LC/MS.
2. Mélanger à l’aide d’un mélangeur à plaques ou d’un vortex à 400 tr/min pendant 1 h ou vortex à vitesse moyenne pendant 15 min. Après la remise en suspension, conservez les flacons à -20 °C.
3. Diluer chaque étalon jusqu’à une concentration finale de 1 ng/mL à l’aide de méthanol pur de qualité LC/MS.
4. Regroupez les étalons en groupes, de sorte que chaque groupe ne contienne pas d’étalons isomères. Voir le tableau supplémentaire 1 pour la répartition des 14 groupes de normes sur le fentanyl.

2. Préparation des phases mobiles HPLC

1. Préparer la phase A mobile (MPA) à l’aide de 5 mM/L de formiate d’ammonium (NH₄HCO₂) dans H₂O avec de l’acide formique à 0,05 % (85 %).
   1. Peser 0,078 g de NH₄HCO₂, verser dans une fiole jaugée de 250 mL et remplir d’eau jusqu’à environ 2/3^tr. Agitez pour bien mélanger.
   2. Une fois complètement dissous, ajouter 0,125 mL d’acide formique (85 %). Remplissez d’eau jusqu’à la ligne de remplissage (250 ml) et mélangez.
2. Préparez la phase B mobile (MPB) en utilisant de l’acide formique à 0,05 % dans un mélange d’acétonitrile de méthanol 1:1.
   1. Verser 125 mL d’acétonitrile dans une fiole jaugée et ajouter le méthanol jusqu’à ce qu’il atteigne la ligne de remplissage.
   2. Agitez pour bien mélanger. Ajouter 0,125 mL d’acide formique à 0,05 % dans la fiole et mélanger pour homogénéiser.

3. Développement de méthodes HPLC

1. Ouvrez le logiciel LC sur l’écran d’accueil. Dans la table d’exemple, située au centre de la fenêtre, créez un protocole.
   1. Annotez la colonne du flacon avec l’emplacement de l’échantillon. Annotez la colonne d’ID d’exemple à l’aide du format YYYYMMDD_NAME (descripteur représentatif). Annotez la colonne de volume avec le volume d’injection souhaité (15 μL).
2. Annotez la colonne du chemin d’accès aux données avec l’emplacement où les données seront enregistrées.
3. Entrée de méthode HPLC
   1. Sélectionnez Nouveau dans la barre de la table d’exemple située au milieu de l’écran. Sous la méthode de séparation, sélectionnez la flèche déroulante et cliquez sur Nouvelle méthode dans la fenêtre contextuelle.
   2. Une nouvelle fenêtre s’affichera étiquetée méthode de séparation, ici modifiez le temps d’acquisition ou la méthode du système de cadre de contrôle d’instrument (ICF).
   3. Double-cliquez sur le bouton Modifier la méthode du système ICF pour ouvrir la fenêtre contextuelle permettant de modifier le dégradé binaire, comme le montre la figure 1.
   4. Sous l’onglet gradient binaire, une représentation visuelle du gradient se trouve à gauche et la répartition du dégradé est à droite, définissez les horodatages, le débit et les concentrations MPA et MPB.
   5. Assurez-vous que le temps d’arrêt est réglé sur 18 min, le débit sur 0,400 mL/min et la limite de pression min et max à 0 psi et 6000 psi.
   6. Définissez les concentrations d’horodatage comme suit :
      À 0,00 min, réglez la concentration B sur 20,0.
      À 1,50 min, réglez la concentration B sur 25,0.
      À 3,00 min, régler la concentration B à 27,0.
      À 6.00 min, réglez la concentration B sur 27.0.
      À 6,50 min, régler la concentration B à 30,0.
      À 7.00 min, réglez la concentration B sur 95.0.
      À 16.00 min, réglez la concentration B sur 95.0.
      À 16 h 50, régler la concentration B à 20,0.

4. Initialisation de la HPLC

1. Dans la section de colonne HPLC, insérez la colonne LC (colonne HPLC monolithique C18 100 mm x 4,6 mm) et les protections de colonne (colonne de protection 5 mm x 4,6 mm). Faites attention à la pression minimale et maximale de la colonne.
2. Exécutez un échantillon blanc (même solution tampon) pour tester les fuites et créer une base de référence. Recherchez les fuites. Les fuites peuvent être observées par les fluctuations de pression de la colonne. S’il y a des fuites, déterminez d’où elles pourraient provenir et resserrez les connexions.
3. Exécutez un échantillon vierge (même solution tampon) à l’aide du programme LC souhaité pour préconditionner la colonne.

5. Développement de la méthode timsTOF MS/MS

1. Ouvrez l’application timsControl. Sur le côté gauche de la fenêtre se trouvent les paramètres MS et TIMS.
   1. Sous les paramètres MS, réglez le début et la fin du balayage sur 50 m/z et 1800 m/z, respectivement. Sélectionnez le mode positif pour la polarité ionique et sélectionnez l’accumulation parallèle-fragmentation en série pour le mode de balayage.
   2. Sous les paramètres TIMS, réglez le mode sur personnalisé, 1/K0 commence à 0,40 Vs/cm², 1/K0 finit à 1,85 Vs/cm², le temps de rampe est réglé à 150,0 ms et MS moyenne est réglée à 1.
2. Dans la sélection inférieure d’onglets sous Source, effectuez les modifications suivantes dans les deux zones de réglage.
   1. Dans la source, réglez le décalage de la plaque d’extrémité sur 500 V, le décalage du capillaire sur 4500 V, le nébuliseur sur 3,0 bar, le gaz sec sur 10,0 L/min et la température sèche sur 200 °C.
   2. Dans les paramètres du pousse-seringue, assurez-vous que la seringue est Hamilton 1 mL, que la fonction active est activée et que le débit est réglé sur 80,0 μL/h.
3. Dans l’onglet Tune, effectuez les modifications suivantes dans les onglets de paramètres pour Général, Traitement et TIMS.
   1. Sous l’onglet Paramètres généraux, configurez les sections suivantes : transfert, cellule de collision, quadripôle, focus pré TOF et détection.
      1. Sous les paramètres de transfert, réglez la déviation 1 delta sur 70,0 V, l’entonnoir 1 RF sur 341,0 Vpp, l’énergie CID sur 0,0 eV, l’entonnoir 2 RF sur 300,0 Vpp, la RF multipolaire sur 300,0 Vpp.
      2. Dans les paramètres de la cellule de collision, assurez-vous que l’énergie de collision est réglée sur 6,0 eV et la RF de collision sur 1200,0 Vpp.
      3. Sous les réglages quadripolaires, assurez-vous que l’énergie ionique est réglée à 6,0 eV et la faible masse à 250,00 m/z.
      4. Sous les paramètres de mise au point pré TOF, réglez le temps de transfert sur 75,0 μs et le stockage de pré-impulsion sur 5,0 μs.
   2. Sous l’onglet Paramètres de traitement, configurez les sections suivantes : détection des pics de spectres de masse et détection des pics de mobilité.
      1. Dans les paramètres de crête des spectres de masse, désélectionnez la somme des intensités (surface) et réglez le seuil absolu sur 667.
   3. Sous l’onglet TIMS, configurez les sections suivantes : décalages, contrôle des changements ioniques et paramètres avancés.
      1. Dans le cadre du réglage des décalages, réglez Δt1 sur -20,0 V, Δt2 sur -100,0 V, Δt3 sur 40,0 V, Δt4 sur 80,0 V, Δt5 sur 0,0 V, Δt6 sur 120,0 et la cellule de collision sur 250,0 V.
      2. Dans les paramètres de contrôle de la charge ionique, cliquez sur la case pour activer et régler l’intensité cible sur 5,00 M.
      3. Sous les paramètres avancés, activez l’accumulation de serrures à la portée de mobilité.
4. Dans l’onglet MS/MS, définissez le mode de balayage sur l’accumulation parallèle-fragmentation en série et configurez les sections suivantes : ions précurseurs, planification, exclusion active, paramètres d’énergie de collision, paramètres de largeur d’isolation et pas TIMS.
   1. Sous les ions précurseurs, réglez le nombre de rampes d’accumulation parallèles et de fragmentation en série à 8, la charge minimale à 1 et la charge maximale à 5.
   2. Sous Paramètres de planification, activez les répétitions précurseurs. Sous l’exclusion active, cochez la case pour activer et définissez la libération sur 0,40 min après.
   3. N’ajustez pas les paramètres d’énergie de collision et les paramètres de largeur d’isolement. Cliquez sur la case pas à pas TIMS pour l’activer.

6. Étalonnage de la mobilité et de la masse

1. Effectuez l’étalonnage pour les domaines m/z et de mobilité. Sous les paramètres d’étalonnage m/z, sélectionnez l’un des profils de mixage d’accord préchargés dans la liste de référence qui apparaît dans le menu déroulant.
2. Pour calibrer, chargez la seringue pour le TOF avec une solution de mélange d’ajustement. Sur le côté droit de la fenêtre, utilisez les paramètres intitulés Mode d’étalonnage pour les différents types d’étalonnage à définir pour obtenir le score le plus élevé.
3. Assurez-vous que le score est aussi proche que possible de 100 %. Basculez entre linéaire, quadradique et quadratique amélioré pour obtenir le meilleur score.
4. Calibrer pour la mobilité en suivant les étapes 6.1 à 6.3 utilisées pour calibrer m/z.
5. Une fois calibrée, enregistrez la méthode MS en sélectionnant l’onglet Méthode dans la barre supérieure. Dans le menu déroulant, sélectionnez Enregistrer sous pour générer un nouveau fichier de méthode MS.

7. Création d’une méthode d’acquisition indépendante des données (dia) d’accumulation parallèle et de fragmentation en série

1. Une fois qu’un ensemble de données a été collecté dans l’acquisition dépendante des données (dda) accumulation parallèle-fragmentation en série, exécutez les expériences en dia. Ouvrez l’application logicielle ion mobility et chargez la méthode dda enregistrée à l’étape 6.5.
2. Laissez tous les paramètres identiques, à l’exception du paramètre MS, passez de l’accumulation parallèle-fragmentation en série à la fragmentation dia-accumulation parallèle-série.
3. Au bas du panneau, sélectionnez l’onglet MSMS , puis cliquez sur Éditeur de fenêtre pour ouvrir la fenêtre contextuelle de dia illustrée à la figure 2.
4. Chargez l’ensemble de données dda précédemment enregistré (fichier .m) à l’aide du bouton d’ouverture de l’analyse situé en haut de la fenêtre contextuelle.
5. Une carte thermique apparaît en bas à gauche et affiche les fenêtres avec un polygone de fenêtres en diagonale sur le graphique. Cliquez et faites glisser pour redimensionner le polygone afin qu’il s’adapte aux données de la carte thermique (les coins sont sélectionnables en double-cliquant sur les lignes latérales, un point apparaîtra qui peut être déplacé et redimensionné).
6. À droite des fenêtres se trouvent les paramètres de la fenêtre. Définissez la largeur de masse (50 correspond à aller) et définissez le chevauchement horizontal, tous deux en Da.
7. Définissez le nombre de fenêtres de mobilité par largeur de masse et le chevauchement vertical.
8. Cliquez sur Calculer les fenêtres en bas à droite de la fenêtre contextuelle pour voir les fenêtres affichées avec les nouveaux paramètres. Une fois que vous le souhaitez, cliquez sur Appliquer les fenêtres dia-PASEF à la méthode. Cela fermera la fenêtre contextuelle et la ramènera à l’écran d’accueil.

8. Mobilité ionique HPLC Traitement des données TOF

1. Ouvrez le logiciel d’analyse de données. Dans le coin supérieur gauche, cliquez sur l’onglet Fichier et sélectionnez Ouvrir dans la liste déroulante. Dans la fenêtre des nouveaux fichiers, sélectionnez les fichiers de votre choix et cliquez sur Ouvrir.
2. Vérifiez l’étalonnage. Faites un clic droit sur le nom du fichier sous la boîte d’analyse et sélectionnez Propriétés. Une fenêtre intitulée fichier name_analysis propriétés apparaîtra. Sélectionnez État de l’étalonnage.
3. Dans la liste déroulante, sélectionnez Étalonnage de l’instrument pour le spectromètre de masse. Confirmez que l’erreur n’est pas supérieure à 1 μg/mL. Sélectionnez Étalonnage initial de la mobilité et vérifiez que l’erreur n’est pas supérieure à 1 μg/mL.
4. Préparez un chromatogramme dans le logiciel d’analyse de données comme décrit ci-dessous.
   1. Faites un clic droit sur Chromatogramme sous le nom du fichier, sélectionnez Modifier le chromatogramme. Dans Type, cliquez sur la liste déroulante et sélectionnez Chromatogramme ionique extrait.
   2. Sous Filtre, sélectionnez Tous les MS et, en mode de balayage, sélectionnez Tous. Il s’agit de voir les pics de la molécule d’intérêt plutôt que seulement ses fragments.
   3. En dessous, recherchez les deux options de filtre pour la sélection des molécules : masses ou formule surlignée en bleu.
   4. Si vous utilisez des masses pour extraire un ion, insérez le m/z théorique de la molécule d’intérêt. Dans ce cas, sélectionnez (masse pour résultat représentatif) m/z.
   5. Si vous utilisez une formule pour extraire un ion, insérez la formule de la molécule ainsi que les formes d’ions d’intérêt pour le chromatogramme. Dans ce cas, sélectionnez l’ion protoné, [M+H]⁺.
   6. Réglez la polarité sur le mode positif.
5. Spectre de masse
   1. Faites un clic droit sur la ligne de base du pic du composé et faites-le glisser vers l’autre bord du pic. Cela créera un spectre de masse de fragments dans ce temps de rétention.
6. Génération de Mobilogram
   1. Faites un clic droit sur l’onglet de gauche intitulé mobilogramme et sélectionnez Modifier le mobilogramme. Une fenêtre intitulée Modifier les traces du mobilogramme apparaîtra. Suivez les étapes 8.4.2 à 8.4.7 pour modifier le chromatogramme.
   2. Dans l’entrée de temps de rétention, ajoutez la plage de temps de rétention du pic d’intérêt.
   3. Une fois les paramètres sélectionnés, cliquez sur Ajouter suivi de Ok en haut à droite de la fenêtre d’édition des traces du mobilogramme.
   4. Après un court laps de temps, le logiciel traitera les sélections souhaitées et produira un chromatogramme. Répéter les étapes 8.6.1 à 8.6.3 pour tous les ions du mélange.
   5. Génération des spectres composés
      1. En bas de la fenêtre d’affichage du spectre, sélectionnez Profile MS et Fragment MS. Cela permettra d’inclure les ions du balayage complet et du PASEF.
      2. Dans la vue du spectre, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Copier les spectres composés. Avec les données spectrales qui apparaissent à droite, trouvez plus d’informations sur le composé telles que la résolution, le pouvoir de résolution, l’intensité et le rapport signal/bruit (S/B).
   6. Traitement des données
      1. Pour traiter les données, intégrez manuellement le chromatogramme et les pics de mobilité afin de fournir des informations importantes sur la molécule d’intérêt.
      2. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur Rechercher et sélectionnez Intégrer uniquement le chromatogramme ou le mobilogramme. Faites un clic gauche et faites glisser pour mettre en surbrillance le pic souhaité. Les informations s’afficheront, notamment le temps de rétention, la zone, le numéro de série et la mobilité.

Résultats

Le kit de dépistage analogique du fentanyl composé de 250 étalons analogues a été divisé en 14 groupes : 12 groupes de 17 analogues et 2 groupes de 16 analogues, afin d’éviter les interférences m/z. Chaque analogue est en outre caractérisé par son m/z, son temps de rétention (RT), sa mobilité (K) et son modèle de fragmentation MS/MS.

Des exemples de séparations isomériques sont illustrés à la figure 3 et à la figure 4 pour la formule chimique C₂₂H₂₈N₂O₂ et C₂₁H₂₈N₂OS, respectivement.

La trousse de dépistage analogue du fentanyl contient quatre isomères dont la formule chimique est le C₂₂H₂₈N₂O₂ (voir la figure 3). L’inspection de la figure 4 montre le chromatogramme ionique extrait [M+H]⁺ , les mobilogrammes, le motif isotopique et le modèle de fragmentation MS/MS. Le méthoxyacétyl fentanyl et le fentanyl carbamate se séparent bien dans les domaines LC et mobilité du para-méthoxyacétyl fentanyl et du B-hydroxyl fentanyl. Cependant, une séparation claire entre le para-méthoxyacétyl fentanyl et le B-hydroxyl fentanyl est obtenue par leurs modèles de fragmentation.

Le kit de dépistage analogique du fentanyl contient trois isomères dont la formule chimique est C₂₁H₂₈N₂OS. L’inspection de la figure 4 montre le chromatogramme ionique extrait [M+H]⁺ , les mobilogrammes, le motif isotopique et le modèle de fragmentation MS/MS. L’a-méthyl thiofentanyl et le (±)-trans-3-méthyl thiofentanyl se séparent dans le domaine LC, mais pas dans le domaine de la mobilité. De plus, le (±)-trans-3-méthyl thiofentanyl et le (±)-cis-3-méthyl thiofentanyl se séparent dans le domaine de la mobilité et non dans le domaine LC. Cela montre la complémentarité de la LC et la séparation de mobilité, améliorant l’identification des espèces isomères par l’orthogonalité des domaines. La figure 4D résume ce résultat fourni par LC et mobilité.

Figure 1 : Rampe de pente dans le logiciel. Système ICF, méthode de dialogue, gradients de dialogue, points temporels appliqués lors de la séparation en fonction du pourcentage de concentration B. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : paramètres de la fenêtre dia-PASEF. Sous les méthodes dia-PASEF MS, les paramètres MS/MS sont uniques. Le graphique de gauche montre les polygones de fenêtre ajustés à partir des données enregistrées dans la méthode dda-PASEF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Chromatogramme ionique extrait typique, mobilogramme extrait et projection MS amplifiée pour les opioïdes isomères. (A) Structures du méthoxyacétyl fentanyl, du para-méthoxy acétyl fentanyl, du β-hydroxy fentanyl, du fentanyl carbamate et respectivement (B) temps de rétention typique, (C) mobilité typique, (D) signal isomère, (E) fragments majeurs et (F) représentation de la fragmentation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Chromatogrammes ioniques extraits typiques et mobilogrammes extraits pour les opioïdes isomères. (A) Structures du α-méthyl thiofentanyl, du (±)-trans-3-méthyl thiofentanyl et du (±)-cis-3-méthyl thiofentanyl. Pour les isomères respectifs (B) temps de rétention typique, (C) mobilité typique, (D) orthogonalité entre le temps de rétention et la mobilité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Groupes de mélange. Ce tableau indique quels opioïdes se trouvent dans chacun des 14 mélanges créés pour cette procédure. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La séparation analytique d’échantillons biologiques contenant une teneur isomérique élevée peut être difficile sur le plan analytique. Dans cet article, la méthode décrite vise à caractériser 29 ensembles d’isomères, pour un total de 185 analogues à partir d’un kit standard de 250 opioïdes. Lors de la préparation du groupe d’essai, il est important de s’assurer qu’il n’y a pas deux analogues avec m/z qui ne peuvent pas être distingués expérimentalement. Les données décrites ici utilisent des normes qui ne proviennent pas d’une matrice basée sur l’homme, si cette méthode doit être utilisée dans une expérience sur le terrain ; Des essais supplémentaires utilisant la matrice d’intérêt sont nécessaires pour garantir l’applicabilité de la méthode. La matrice pourrait faire en sorte que les analytes s’ionisent différemment de ce qu’ils font dans une expérience sans matrice, ce qui rend impératif de déterminer quelles formes ioniques prévalentes seront observées. Dans l’analyse, l’identification est basée sur les motifs isotopiques des formes les plus abondantes (par exemple, [M+H]⁺¹ et [M+Na]⁺¹).

Le choix du programme LC est critique dans les cas où les isomères ne sont pas séparés dans le domaine de la mobilité. La diminution de la pente du gradient peut augmenter la spécificité de la méthode en augmentant la différence entre les pics chromatographiques.

Lors de l’analyse des données, il est important que les signaux non pertinents soient ignorés lors de la détermination du temps de rétention et de la mobilité. Les avantages du HRMS permettent d’obtenir des fenêtres m/z étroites (résolution de masse typique de ~50 000) avec un filtrage de mobilité supplémentaire, réduisant ainsi le bruit chimique.

La méthode décrite ici fournit une bibliothèque de référence pour le dépistage des analogues du fentanyl à partir d’un échantillon inconnu. Les profils de fragmentation RT, K, isotopique et MS rapportés sont utilisés comme qualificatifs lors du traitement des données et de l’affectation inconnue. Par rapport à l’analyse traditionnelle MRM LC-QQQ, bien qu’il soit possible d’atteindre des niveaux de détail similaires 13,19,27, l’avantage unique est de dépister les opioïdes alternatifs non inclus dans la base de données générée à l’aide du kit FID. Chaque nouvel opioïde devra faire l’objet d’une analyse à l’aide d’un étalon synthétique pour sa validation finale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Formiate d’ammonium pour HPLC	Fluka	17843-50G
Eppendorf  ; Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes	Fisher	05-402-25
ESI-L Low Concentration Tuning mix	Agilent	G1969-85000
Kit de dépistage analogique du fentanyl (FAS)  ;	Cayman Chemical	9003237, 9003286, 9003380, 9003381	kit de 250 opioïdes snthétiques, 210 analogues du fentanyl, divisé en un seul kit et en versions de panneaux émergents 1-4
Acide formique Optima LC/MS	Fisher	A117-50
Colonne de garde en onyx (5 x 4,6 mm)  ;	Phenomenex	CHO-7649	colonne de garde pour colonnes C18
Colonne HPLC monolithique C18 Onyx (100 x 4,6 mm)	Colonne LC Phenomenex	CHO-7643	en phase inverse C18
Acetonitrile de qualité Optima  ;	Fisher	A996-4
Méthanol de qualité Optima	Fisher	A454-4
Eau de qualité Optima	Fisher	W7-4
Pipette	Fisher	05-719-510	kit de 1-10 & micro ; L, 10-100 et micro ; L, et 100-1000 & micro ; Pipette L
Pointes de pipette 10µ ; L	Fisher	94060100
Pointes de pipette 1000µ ; L	Fisher	94056710
Pointes de pipette 200µ ; L	Fisher	94060310
Mélangeur à plaques	IKA  ;	MS 3 D S1	IKA MS 3 digtital
Prominence LC-20 CE chromatographe liquide ultrarapide	Shimadzu, Japon		équipé de DGU-20A5, LC-20AD, SIL-20AC, CTO-20A, SPD-M20A, CBM-20A, SPD-20A
timsTOF Pro	Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA		instrument timsTOF avec PASEF  ;