Article de méthode

Formation osseuse intégrée par ossification endochondrale in vivo à l’aide de cellules souches mésenchymateuses

DOI :

10.3791/65573

⸱

14 juillet 2023

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La thérapie osseuse par ossification endochondrale par implantation de tissu cartilagineux artificiel produit à partir de cellules souches mésenchymateuses a le potentiel de contourner les inconvénients des thérapies conventionnelles. Les hydrogels d’acide hyaluronique sont efficaces pour mettre à l’échelle des greffes de cartilage uniformément différenciées ainsi que pour créer un os intégré avec vascularisation entre les greffons fusionnés in vivo.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La thérapie conventionnelle de régénération osseuse utilisant des cellules souches mésenchymateuses (CSM) est difficile à appliquer aux défauts osseux supérieurs à la taille critique, car elle n’a pas de mécanisme pour induire l’angiogenèse. L’implantation de tissu cartilagineux artificiel fabriqué à partir de CSM induit l’angiogenèse et la formation osseuse in vivo via l’ossification endochondrale (ECO). Par conséquent, cette approche médiée par l’ECO peut être une thérapie de régénération osseuse prometteuse à l’avenir. Un aspect important de l’application clinique de cette approche médiée par l’ECO est l’établissement d’un protocole de préparation d’une quantité suffisante de cartilage à implanter pour réparer le défaut osseux. Il n’est surtout pas pratique de concevoir une seule masse de cartilage greffé d’une taille conforme à la forme du défaut osseux réel. Par conséquent, le cartilage à transplanter doit avoir la propriété de former de l’os intégralement lorsque plusieurs morceaux sont implantés. Les hydrogels peuvent être un outil intéressant pour la mise à l’échelle des greffons d’ingénierie tissulaire pour l’ossification endochondrale afin de répondre aux exigences cliniques. Bien que de nombreux hydrogels d’origine naturelle favorisent la formation de cartilage MSC in vitro et ECO in vivo, le matériau d’échafaudage optimal pour répondre aux besoins des applications cliniques n’a pas encore été déterminé. L’acide hyaluronique (AH) est un composant crucial de la matrice extracellulaire cartilagineuse et est un polysaccharide biodégradable et biocompatible. Ici, nous montrons que les hydrogels d’AH ont d’excellentes propriétés pour soutenir la différenciation in vitro du tissu cartilagineux à base de CSM et favoriser la formation osseuse endochondrale in vivo.

Introduction

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L’os autologue est toujours la référence en matière de réparation des défauts osseux dus à des traumatismes, des malformations congénitales et de la résection chirurgicale. Cependant, la greffe osseuse autogène présente des limites importantes, notamment la douleur du donneur, le risque d’infection et le volume osseux limité qui peut être isolé des patients 1,2,3,4. De nombreux biomatériaux ont été développés comme substituts osseux, combinant des polymères naturels ou synthétiques avec des matériaux minéralisés tels que le phosphate de calcium ou l’hydroxyapatite 5,6. La formation osseuse dans ces matériaux d’ingénierie est généralement réalisée en utilisant le matériau minéralisé comme matériau d’amorçage pour permettre aux cellules souches de se différencier directement en ostéoblastes par le processus d’ossification intramembranaire (IMO)7. Ce processus n’a pas d’étape angiogénique, ce qui entraîne une vascularisation in vivo insuffisante du greffon après l’implantation 8,9,10 et, par conséquent, les approches utilisant un tel processus peuvent ne pas être optimales pour traiter les grands défauts osseux 11.

Il a été démontré que les stratégies appliquées pour récapituler le processus d’ossification endochondrale (ECO), un mécanisme inné de la squelétogenèse au cours du développement, permettent de surmonter des problèmes importants associés aux approches traditionnelles basées sur l’OMI. Dans l’ECO, les chondrocytes de la matrice cartilagineuse libèrent le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), qui favorise l’infiltration vasculaire et le remodelage de la matrice cartilagineuse dans l’os12. L’approche de l’ostéogenèse médiée par l’ECO via le remodelage du cartilage et l’angiogenèse, qui est également activée lors de la réparation des fractures, utilise du tissu cartilagineux créé artificiellement dérivé des CSM comme matériau d’amorçage. Les chondrocytes peuvent tolérer l’hypoxie dans les défauts osseux, induire l’angiogenèse et convertir une greffe de cartilage sans système vasculaire en tissu angiogénique. De nombreuses études ont rapporté que les greffes de cartilage à base de CSM génèrent de l’os in vivo en mettant en œuvre un tel programme ECO 13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Une condition essentielle pour l’application clinique de cette approche médiée par l’ECO est de savoir comment préparer la quantité souhaitée de greffe de cartilage dans un cadre clinique. Il n’est pas pratique de préparer un cartilage clinique d’une taille adaptée au défaut osseux réel. Par conséquent, le cartilage du greffon doit former intégralement de l’os lorsque plusieurs fragments sont implantés22. Les hydrogels peuvent être un outil intéressant pour la mise à l’échelle des greffons d’ingénierie tissulaire pour l’ossification endochondrale. De nombreux hydrogels d’origine naturelle soutiennent la formation de cartilage MSC in vitro et ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 ; Cependant, le matériau de support optimal pour répondre aux exigences de l’application clinique n’a pas encore été déterminé. L’acide hyaluronique (AH) est un polysaccharide biodégradable et biocompatible présent dans la matrice extracellulaire du cartilage33. L’AH interagit avec les CSM via des récepteurs de surface tels que CD44 pour soutenir la différenciation chondrogénique 25,26,28,30,31,32,34. De plus, les échafaudages à base d’AH favorisent la différenciation ostéogénique médiée par l’OMI des cellules souches de la pulpe dentaire humaine35, et les échafaudages combinés au collagène favorisent l’ostéogenèse médiée par l’ECO36,37.

Nous présentons ici une méthode de préparation d’hydrogels d’AH à l’aide de CSM humaines adultes dérivées de moelle osseuse et leur utilisation pour la chondrogenèse hypertrophique in vitro et l’ossification endochondrale ultérieure in vivo38. Nous avons comparé les caractéristiques de l’AH avec celles du collagène, un matériau largement utilisé dans l’ingénierie du tissu osseux avec les CSM et un matériau utile pour la mise à l’échelle des greffons artificiels pour l’ossification endochondrale17. Dans un modèle de souris immunodéprimées, les constructions d’AH et de collagène ensemencées avec des CSM humaines ont été évaluées pour leur potentiel ECO in vivo par implantation sous-cutanée. Les résultats montrent que les hydrogels d’AH sont excellents comme échafaudage pour les CSM afin de créer des greffes de cartilage artificiel qui permettent la formation osseuse par ECO.

Le protocole est divisé en deux étapes. Tout d’abord, des constructions de CSM humaines ensemencées sur de l’hydrogel d’acide hyaluronique sont préparées et différenciées en cartilage hypertrophique in vitro. Ensuite, les constructions différenciées sont implantées par voie sous-cutanée dans un modèle nu pour induire une ossification endochondrale in vivo (Figure 1).

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Protocole

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Ce protocole utilise des souris nues mâles âgées de 4 semaines. Hébergez quatre souris dans une cage soumise à un cycle lumière/obscurité de 12 h à 22−24 °C et à une humidité relative de 50 % à 70 %. Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux directives approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale et dentaire de Tokyo (ID d’approbation : A2019-204C, A2020-116A et A2021-121A).

1. Préparation des tampons et des réactifs

  1. Préparez le milieu de croissance des cellules souches mésenchymateuses (milieu de croissance MSC) en ajoutant le kit de supplément de milieu de croissance MSC au milieu basal MSC et conservez-le à 4 °C.
  2. Préparez le milieu Eagle modifié de Dulbecco et le milieu F12 (DMEM/F-12) de Ham’s en ajoutant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 50 μg/mL de gentamicine, 200 μM de L-alanyl-L-glutamine et 1 ng/mL de facteur de croissance fibroblastique basique au milieu et conservez-le à 4 °C.
  3. Préparer le milieu chondrogénique en ajoutant 1 % de supplément ITS-G, 0,12 % d’albumine sérique bovine, 50 μg/mL de gentamicine, 0,35 mM de L-proline, 100 nM de dexaméthasone et 10 ng/mL de TGF-β3 au DMEM juste avant l’utilisation.
  4. Préparer le milieu hypertrophique en ajoutant 10 mM de β-glycérophosphate, 0,12 % d’albumine sérique bovine, 10 nM de dexaméthasone, 200 μM d’ascorbate-2-phosphate, 50 nM de L-thyroxine, 50 μg/mL de gentamycine et 50 pg/mL d’IL-1β au DMEM juste avant utilisation.
  5. Enduire une boîte de culture à 24 puits de 200 μL de paraffine fondue préchauffée à 60 °C. Laisser reposer à température ambiante jusqu’à ce que la paraffine soit prise.

2. Expansion des CSM humaines

NOTA : Avant de commencer les expériences, les CSM présentant un potentiel élevé de chondrogenèse des CSM doivent être sélectionnées en microculture de masse comme décrit en17.

  1. Selon les instructions du fabricant, cultiver des CSM primaires dérivées de la moelle osseuse humaine (passage 2) avec un milieu de croissance CSM dans une boîte de 10 cm à une densité de 5 x 103 cellules/cm 2 à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 et à 95 % d’air humidifié.
  2. Changez le support tous les 2-3 jours. Une fois que les cellules ont atteint 80 à 90 % de confluence, aspirez le milieu de la boîte de culture cellulaire à l’aide d’une pompe à vide, lavez avec 5 ml de PBS, puis aspirez la solution avec une pompe à vide.
  3. Ajouter 1 mL de solution de trypsine à 0,05 % et d’EDTA à 0,02 % dans le plat. Incubez le plat pendant 5-10 min à 37 °C.
  4. Ajouter 1 mL de milieu de croissance MSC pour arrêter la réaction enzymatique. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml.
  5. Mélangez la suspension cellulaire d’autres plats dans le tube de 50 ml et conservez-la sur de la glace.
  6. Utilisez le compteur de cellules pour compter les cellules en mélangeant 10 μL de la suspension cellulaire avec 10 μL de colorant bleu trypan à 0,4 %.
  7. Centrifuger la suspension cellulaire restante à 220 x g pendant 3 min à température ambiante. Retirer le surnageant et ajouter la solution de cryoconservation à une concentration de 1,0 x 106 cellules par mL.
  8. Verser 1 mL de la suspension cellulaire dans chaque cryotube et conserver à -80 °C pendant 12 h avant de passer à l’azote liquide. Les stocks congelés qui en résultent (passage 3) sont utilisés pour ce protocole.
  9. Pour les expériences, semer les CSM ensemencées dans une boîte de 10 cm à une densité de 5 x 103 cellules/cm2. Cellules de culture jusqu’à 80%-90% confluentes (passage 4) en milieu DMEM/F-12.

3. Préparation d’hydrogels encapsulés dans le CSM

  1. Trypsiniser les cellules et préparer la suspension cellulaire comme décrit aux étapes 2.3 à 2.6.
  2. Pour faire 10 constructions (2,5 x 105 cellules par construction), aliquote la suspension cellulaire contenant 2,5 x 106 cellules dans un microtube de 1,5 mL.
  3. Centrifuger la suspension à 220 x g pendant 3 min, retirer le surnageant à l’aide d’une pompe à vide et le maintenir sur la glace.
  4. Amenez l’acide hyaluronique (AH) modifié au thiol, la réticulation réactive au thiol, le diacrylate de polyéthylène glycol et les bouteilles d’eau dégazées à température ambiante.
  5. Dans des conditions stériles, ajouter 1,0 mL d’eau dégazée dans le flacon contenant de l’AH (voir les instructions du fabricant) à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille.
  6. Tourbillon se réchauffant de temps en temps jusqu’à 37 °C jusqu’à ce que la solution devienne claire, puis placez-le sur de la glace. Il faut moins de 30 minutes pour que les solides se dissolvent complètement.
  7. Dans des conditions stériles, ajoutez 0,5 mL d’eau dégazée dans le flacon de réticulation à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille. Dissoudre en retournant plusieurs fois, puis placer sur de la glace.
  8. Ajouter 120 μL de la solution d’AH dissoute à la pastille alizée (2,5 x 106 cellules). Remettez en suspension la pastille de cellule en pipetant d’avant en arrière.
  9. Ajouter 30 μL de la solution de réticulation dissoute dans le tube contenant l’AH et les cellules (étape 3.8) et mélanger en tapotant le tube, puis faire tourner brièvement. Combinez la solution HA et la solution de réticulation dans un rapport de 4 :1.
  10. Déposez 15 μL de la solution combinée contenant des CSM (2,5 x 105 cellules) sur la plaque à 24 puits recouverte de paraffine et laissez-la se solidifier à 37 °C pendant 30 min (Figure 2). En raison de la viscosité élevée, préparez au moins 10 % de quantité supplémentaire de mélange cellule/hydrogel par rapport à nécessaire.
    REMARQUE : Les caractéristiques de l’hydrogel ont été décrites précédemment39.

4. Conditions de différenciation in vitro

  1. Ajouter 0,5 mL de milieu de différenciation chondrogénique à une construction d’hydrogels d’AH semés par MSC. Changez le support tous les 2-3 jours.
  2. Après 3 semaines, passer à un milieu de différenciation hypertrophique (0,5 mL par puits) et cultiver les constructions pendant 2 semaines supplémentaires.

5. Implantation in vivo de CSM

  1. Après un total de 5 semaines de culture in vitro, implanter les constructions par voie sous-cutanée dans le dos des souris nues comme décrit précédemment38,40.
  2. Peser les souris et administrer un anesthésique combiné préparé avec 0,75 mg/kg de poids corporel (p.c.) de médétomidine, 4,0 mg/kg p.c. de midazolam et 5,0 mg/kg p.c. de butorphanol par injection intrapéritonéalecomme décrit 38.
  3. Confirmez l’anesthésie adéquate par immobilité aux stimuli chirurgicaux et surveillez la profondeur respiratoire par des mouvements thoraciques lents et réguliers et un apport adéquat d’oxygène par la couleur de la muqueuse rose périodiquement pendant l’opération. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant l’anesthésie.
  4. Placez la souris sur un champ chirurgical stérile en position couchée, stérilisez le site d’incision avec 50 ppm d’eau d’acide hypochloreux (pH 5,0 ; HAW), et placez un champ chirurgical perforé sur la souris.
    REMARQUE : Stérilisez tout le matériel chirurgical dans un autoclave, de l’oxyde d’éthylène gazeux ou HAW. Les chirurgiens doivent se laver les doigts et porter des blouses et des gants chirurgicaux.
  5. Faites deux incisions cutanées de 5 mm de long à 2 cm d’intervalle dans les zones des épaules et des hanches le long de la ligne médiane de la colonne vertébrale à l’aide de ciseaux.
  6. Insérez une spatule par voie sous-cutanée à travers l’incision pour créer une poche sous-cutanée.
  7. Insérez deux à trois constructions (~15 μL chacune, étape 5.1) dans chaque poche à l’aide d’une pince. Les constructions d’AH implantées dans la même poche sont sujettes à la fusion très fréquemment. Pour éviter la fusion, insérez une construction HA dans chaque poche.
  8. Fermez les incisions avec des sutures en soie tressée 4-0. Injecter à la souris un antagoniste des anesthésiques préparé avec 0,75 mg/kg p.c. d’atipamézole comme décrit38.
  9. Pendant que les souris se remettent de l’anesthésie, placez-les dans des cages de récupération stériles contenant une litière stérile au sol sans nourriture ni bouteilles d’eau et surveillez en permanence la température corporelle, le pouls et la respiration.
  10. Ne laissez pas les souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elles aient repris suffisamment conscience pour maintenir leur décubitus sternal. Une fois complètement rétablis, remettez les animaux dans la salle d’élevage avec les autres animaux.
  11. Surveillez les animaux tous les deux jours pendant la période de guérison pour détecter toute complication possible. Euthanasier les souris par inhalation de dioxyde de carbone avec peu de souffrance à 4 et 8 semaines après l’implantation.
  12. Inciser la peau au niveau des sites greffés et retirer les constructions implantées à l’aide d’une pince. Fixez les constructions dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 16 h, puis soumettez-les à l’analyse.

6. Analyse statistique

  1. Déclarez les données quantitatives sous forme de moyenne ±écart-type (ET). Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel commercial.
  2. Utilisez le test t de Student ou l’ANOVA à un facteur suivi du test de comparaisons multiples de Tukey pour déterminer les différences significatives entre les groupes. p<0,05 et p<0,01 indiquent des différences significatives entre deux groupes.

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Résultats

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Les hydrogels d’AH encapsulés dans MSC ont été cultivés dans un milieu chondrogénique supplémenté en TGFβ3, un inducteur de la chondrogenèse41 (étape 4.1). Nous avons comparé les propriétés de l’AH avec celles du collagène, qui s’est avéré efficace dans la création de greffes de cartilage artificiel à base de CSM pour l’ossification endochondrale, comme décrit précédemment38. Les CSM indifférenciées n’ont pas été incluses comme témoins négatifs dans cette étude, car il a ét...

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Discussion

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L’utilisation de matériaux d’échafaudage appropriés qui favorisent la transition du cartilage hypertrophique à l’os est une approche prometteuse pour mettre à l’échelle les greffes de cartilage hypertrophique à base de CSM et traiter les défauts osseux de taille cliniquement significative. Ici, nous montrons que l’AH est un excellent matériau d’échafaudage pour soutenir la différenciation du tissu cartilagineux hypertrophique à base de CSM in vitro et pour favoriser la formation osseuse endochondrale in vivo...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ont déclaré qu’il n’y avait pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par une subvention d’aide à la recherche scientifique (KAKENHI) de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) (subvention nos. JP19K10259 et 22K10032 à MAI).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 w/v % de trypsine-1 mmol/L EDTA.4Na SolutionFUJIFILM Wako Pure Chemical  ;209-16941
AntisedanNippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphateNacalai Tesque13571-14
BambankerGC LymphotecCS-02-001
facteur de croissance fibroblastique de baseReprocellRCHEOT002  ;
albumine sérique bovineFUJIFILM Wako Pure Chemical  ;012-238817,5 w/v %
Compteur de cellules automatisé Countess avec lames de chambre de comptage de cellules et coloration au bleu trypan 0,4InvitrogenC10283
dexaméthasoneMerckD8893
DomitorNippon Zenyaku Kogyo
DormicumAstellas Pharma
Dulbecco’s Modified Eagle MediumMerckD6429haute teneur en glucose
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 HamMerckD6421
Sérum de veau fœtalHycloneSH30396.03
Sulfate de gentamicineFUJIFILM Wako Pure Chemical  ;1676045  ; 10 mg/mL
Générateur HaccpperTechnoMaxCH-400-5QB50 ppm eau acide hypochloreuse
Cellules souches mésenchymateuses humainesLonzaPT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold KitMerckHYS020
IL-1ß ;PeproTechAF-200-01B
Supplément ITS-GFUJIFILM Wako Pure Chemical  ;090-06741&Times ; 100
L-Alanyl-L-GlutamineFUJIFILM Wako Pure Chimique  ;016-21841200mmol/L (&fois ; 100)
L-prolineNacalai Tesque29001-42
L-ThyroxineMerckT1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		LonzaPT-3001
paraffineFUJIFILM Wako Pure Chemical  ;165-13375
PBS / pH7.4 100mlMedicago09-2051-100
TGF-&beta ; 3  ;ProteintechHZ-1090
VetorphaleMeiji Seika Kaisha
Visiocare PommadeSAVAVET/SAVA Healthcare
&beta ;-glycérophosphateFUJIFILM Wako Pure Chemical  ;Référence 048-34332
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Références

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