Article de méthode

Isolement et purification de vésicules extracellulaires bactériennes à partir de matières fécales humaines à l’aide d’une centrifugation à gradient de densité

DOI :

10.3791/65574

⸱

1 septembre 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude décrit une méthode permettant d’isoler et de purifier les vésicules extracellulaires bactériennes (VEB) enrichies à partir de matières fécales humaines par centrifugation à gradient de densité (DGC), identifie les caractéristiques physiques des VEB à partir de la morphologie, de la taille des particules et de la concentration, et discute des applications potentielles de l’approche DGC dans la recherche clinique et scientifique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les vésicules extracellulaires bactériennes (VEB) sont des nanovésicules dérivées de bactéries qui jouent un rôle actif dans la communication bactérie-bactérie et bactérie-hôte, en transférant des molécules bioactives telles que des protéines, des lipides et des acides nucléiques hérités de la bactérie mère. Les VEB dérivés du microbiote intestinal ont des effets dans le tractus gastro-intestinal et peuvent atteindre des organes éloignés, ce qui a des implications importantes pour la physiologie et la pathologie. Les recherches théoriques qui explorent les types, les quantités et les rôles des VEB dérivés des matières fécales humaines sont cruciales pour comprendre la sécrétion et la fonction des VEB à partir du microbiote intestinal. Ces recherches nécessitent également une amélioration de la stratégie actuelle d’isolement et d’épuration des VEB.

Cette étude a permis d’optimiser le processus d’isolement et de purification des VEB en établissant deux modes de centrifugation à gradient de densité (DGC) : Top-down et Bottom-up. La distribution enrichie des VEB a été déterminée dans les fractions 6 à 8 (F6-F8). L’efficacité de l’approche a été évaluée en fonction de la morphologie, de la taille, de la concentration et de la teneur en protéines des particules. Les taux de récupération des particules et des protéines ont été calculés, et la présence de marqueurs spécifiques a été analysée pour comparer la récupération et la pureté des deux modes DGC. Les résultats ont indiqué que le mode de centrifugation descendante avait des niveaux de contamination plus faibles et atteignait un taux de récupération et une pureté similaires à ceux du mode ascendant. Un temps de centrifugation de 7 h a été suffisant pour atteindre une concentration fécale de 108/mg.

Outre les matières fécales, cette méthode pourrait être appliquée à d’autres types de fluides corporels avec une modification appropriée en fonction des différences de composants et de viscosité. En conclusion, ce protocole détaillé et fiable faciliterait l’isolement et la purification standardisés des BEV et jetterait ainsi les bases d’analyses multi-omiques ultérieures et d’expériences fonctionnelles.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’intestin est largement reconnu comme l’organe abritant les communautés microbiennes les plus abondantes dans le corps humain, avec plus de 90% des bactéries impliquées dans la colonisation et la multiplication 1,2. De nombreuses preuves ont démontré que le microbiote intestinal module le microenvironnement intestinal et interagit simultanément avec le dysfonctionnement d’organes distants, principalement par le biais d’une barrière intestinale altérée 3,4. De plus en plus de preuves indiquent une corrélation entre le déséquilibre du microbiote intestinal et la progression des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI)5,6, ainsi que des troubles cognitifs à travers l’axe intestin-cerveau 5,6,7,8. Les vésicules extracellulaires bactériennes (VEB) produites par les bactéries jouent un rôle important dans ces processus pathologiques.

Les BEV sont des particules à l’échelle nanométrique encapsulant des dérivés bactériens, avec des diamètres allant de 20 à 400 nm. Il a été démontré qu’ils facilitent les interactions entre les bactéries et leurs organismes hôtes 9,10. Malgré leur invisibilité, ces particules ont attiré de plus en plus l’attention des chercheurs en raison de leurs vastes applications potentielles en tant que biomarqueurs diagnostiques, cibles thérapeutiques et véhicules d’administration de médicaments11. Les excréments humains, souvent utilisés comme échantillons biologiques pour l’étude des VEB, provenant principalement de bactéries intestinales, contiennent un mélange complexe d’eau, de bactéries, de lipides, de protéines, de résidus alimentaires non digérés et de cellules épithéliales exfoliées, entre autres. La composition complexe des matières fécales pose des défis à l’isolement et à la pureté des VEB, ce qui empêche une analyse complète, objective et réaliste des VEB. Par conséquent, des stratégies efficaces visant à minimiser les interférences causées par des composants contaminants et à améliorer le rendement des VEB sont apparues comme des problèmes critiques nécessitant une attention immédiate.

Les stratégies d’isolement existantes reposent en grande partie sur des techniques telles que la centrifugation à ultra-haute vitesse (UC), la centrifugation à gradient de densité (DGC) et la chromatographie d’exclusion de taille (SEC)12,13,14,15,16,17. À l’heure actuelle, la DGC est l’une des méthodes les plus largement appliquées dans le domaine de la séparation des VEB, englobant deux modes de sédimentation-flottement, « Top-down » et « Bottom-up », qui sont déterminés par la position de chargement initiale de l’échantillon. Ces méthodologies différencient les vésicules extracellulaires (VE) des autres composants en fonction des disparités de taille et de densité, ce qui permet d’obtenir des taux de pureté et de récupération variables. Des recherches antérieures ont indiqué que les stratégies à approche unique sont insuffisantes pour séparer adéquatement les VE des protéines solubles dans les échantillons de fluides corporels, telles que la lipoprotéine dans le sang18 et la protéine Tamm-Horsfall dans l’urine19. De plus, la distribution de la taille des vésicules extracellulaires eucaryotes (EEV) chevauche souvent celle des BEV, ce qui nécessite d’autres améliorations méthodologiques pour optimiser le rendement des BEV. Par conséquent, l’avancement de l’étude des VEB repose sur le développement de méthodologies efficaces de séparation et de purification. En particulier, Tulkens et al15 ont utilisé une stratégie biophysique orthogonale pour séparer les VEB fécaux des VEE, dans laquelle le temps de centrifugation d’un mode DGC ascendant était jusqu’à 18 h. En revanche, cette étude l’a réduit à 7 h, ce qui a permis de gagner considérablement le temps d’ultracentrifugation par gradient et de simplifier le processus.

Dans la présente étude, nous avons isolé et purifié des VEB fécaux en utilisant deux modes DGC dans des conditions tampons optimisées, après avoir enrichi les VEB avec une gamme de vitesses de centrifugation différentielles, allant de faible à extrêmement élevée vitesse. Des évaluations basées sur la morphologie, la taille des particules et la concentration ont indiqué une performance louable de cette méthode améliorée. Cette étude pourrait servir de base à de futures recherches, en étendant ses applications à un domaine plus large et en offrant un aperçu de l’hétérogénéité des VEB dans le corps humain. Il contribue également à la standardisation des techniques de séparation et d’analyse des VEB.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le comité d’éthique de l’hôpital de Nanfang, Southern Medical University, a approuvé cette étude, qui a été menée avec le consentement éclairé des participants. Toutes les méthodes employées dans le présent document ont respecté les directives opérationnelles standard fournies par les Normes internationales sur le microbiome humain (IHMS : http://www.microbiome-standards.org/). Toutes les procédures subséquentes de manipulation des liquides devaient être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique ou un banc ultra-propre.

1. Collecte et aliquotage d’échantillons fécaux

  1. Distribuez un échantillonneur de selles, un sac scellé et une boîte glacée, et fournissez des instructions complètes aux participants sur la façon de se procurer et de conserver les échantillons.
  2. Demandez à chaque participant de prélever son échantillon de selles à l’aide de l’échantillonneur fourni et de le transporter au laboratoire à une température de 4 °C dans un délai de 24 heures.
  3. À la réception au laboratoire, utiliser une cuillère stérile pour aliquoter moins de 3,5 g de matières fécales dans un tube à centrifuger de 50 ml pré-pesé. Notez le poids de l’échantillon fécal sur le tube pour les procédures de prétraitement ultérieures.
    POINT DE PAUSE : S’il n’est pas possible de traiter immédiatement les échantillons, allouer l’échantillon pour un stockage à long terme à -80 °C après une notation appropriée.

2. Préparation des échantillons de matières fécales

  1. Réfrigérer 500 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 °C. Filtrer le PBS pré-refroidi à travers un filtre en polyéthersulfone (PES) de 0,22 μm à l’aide d’une seringue de 50 ml dans dix tubes à centrifuger de 50 ml.
  2. Placez deux tubes de 50 ml sur de la glace, chacun contenant 3,5 g d’échantillons fécaux. Ajouter 35 mL de PBS dans chaque tube.
    REMARQUE : Calculer la quantité requise de PBS pour la dissolution des matières fécales, en veillant à ce que la concentration maximale de l’échantillon soit de 10 % (p/v). Si vous traitez des échantillons supplémentaires, utilisez plus de tubes au besoin.
  3. Agiter les échantillons à 300 tr/min pendant 2 h à 4 °C, ou les placer pendant 8 h au moins à 4 °C jusqu’à ce que les matières fécales soient complètement en suspension visible.

3. Centrifugation à vitesse différentielle

  1. Refroidir la centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse à 4 °C.
  2. Ajustez le poids des deux tubes contenant les échantillons préparés à l’étape 2.3 avec du PBS pour atteindre un poids total de 0,1 g.
  3. Centrifuger les échantillons à 3 000 × g pendant 20 min à 4 °C.
  4. Pipeter délicatement le surnageant dans deux tubes à centrifuger propres de 50 mL, en laissant environ 1 mL au-dessus de la pastille. Utilisez une pipette Pasteur jetable en plastique pour ce processus.
  5. Ajustez le poids des deux tubes avec du PBS pour atteindre un poids total à moins de ± 0,1 g.
  6. Centrifuger le surnageant transféré à 12 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
  7. Aspirer le surnageant à l’aide d’une seringue de 20 ml, retirer l’aiguille de la seringue et le filtrer à travers des filtres de 0,22 μm dans des tubes de 50 ml. À ce stade, le volume surnageant devrait être d’environ 30 mL.
    REMARQUE : Si une quantité importante d’impureté est encore visible après la centrifugation de 12 000 × g, il est nécessaire de répéter l’étape de centrifugation à 12 000 × g pendant 30 min à 4 °C. Le non-respect de cette consigne peut entraîner une perte importante de VEB en raison de l’obstruction des pores pendant la filtration.

4. Centrifugation à ultra-haute vitesse

  1. Nettoyez le rotor et le godet en les essuyant avec de l’alcool à 75 % (v/v) pour éliminer toute contamination résiduelle.
  2. Placez un tube d’ultracentrifugation de 38,5 ml dans le porte-tube.
    REMARQUE : Sélectionnez le tube d’ultracentrifugation approprié en fonction du volume d’échantillon. Évitez les rayons ultraviolets et les réactifs chimiques inappropriés pour la stérilisation des tubes centrifuges, comme indiqué dans le manuel du produit.
  3. Transvaser environ 30 mL du surnageant fécal filtré de l’étape 3.7 dans le tube d’ultracentrifugation.
  4. Remplissez le tube d’ultracentrifugation avec environ 8 mL de PBS, en laissant un espace de 3 mm par rapport à l’ouverture du tube.
  5. Placez les deux tubes d’ultracentrifugation avec les échantillons dans des seaux d’ultracentrifugation opposés, par exemple, le seau 1 correspond à 4 (1-4), 2-5, 3-6.
  6. Ajustez le poids des deux seaux avec PBS pour obtenir un poids total à moins de ± 0,005 g.
  7. Installez tous les godets sur le rotor, que les tubes soient chargés ou non.
  8. Lancer le vide et centrifuger les échantillons à 160 000 × g pendant 70 min à 4 °C.
  9. Relâchez le vide de la chambre et ouvrez la porte une fois que Ready (Prêt) s’affiche sur la page d’accueil de l’instrument.
  10. Retirez le rotor de l’ultracentrifugeuse.
  11. Déplacez les godets du rotor vers le rack et récupérez les tubes à l’aide d’une pince.
  12. Jetez le surnageant, qui contiendra des pastilles brunes visibles au fond.
  13. Remettre les pastilles en suspension à plusieurs reprises à l’aide d’une pipette de 1 000 μL avec 1 mL de PBS prérefroidi (4 °C) jusqu’à ce qu’elles soient complètement suspendues. Remplissez le tube avec environ 37 mL de PBS, en laissant un espace de 3 mm à partir de l’ouverture.
  14. Effectuez une autre ultracentrifugation en suivant les étapes 4.5 à 4.11 à 160 000 × g pendant 70 min à 4 °C pour éliminer les composants contaminants partiellement attachés des parois du tube.
  15. Jetez le surnageant, retournez les deux tubes d’ultracentrifugation pendant 5 min et éliminez toute solution restante sur la paroi intérieure avec des essuie-glaces.
    REMARQUE : Le nettoyage de la paroi intérieure minimise les interférences dues à la contamination résiduelle adhérant à la paroi du tube d’ultracentrifugation. Choisissez des essuie-glaces qui n’influenceront pas l’analyse du BEV, notamment en ce qui concerne la taille des particules.
  16. Remettre les pastilles en suspension dans chaque tube en les pipetant de haut en bas avec 1,2 mL de PBS pré-refroidi (4 °C) à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
  17. Transférez 1,2 mL de la solution PBS/BEV d’un tube d’ultracentrifugation vers un microtube propre de 1,5 mL.
    POINT DE PAUSE : La solution PBS/BEV recueillie à partir d’un tube d’ultracentrifugation peut passer à l’étape 6. Conservez la solution de l’autre tube à -80 °C.

5. Préparation de la solution pour la centrifugation à gradient de densité

  1. Préparation d’un tampon HEPES de 0,02 M
    1. Mélanger 0,477 g de poudre HEPES et 0,8 g de NaCl avec 90 mL d’eau déminéralisée autoclavée.
    2. Ajustez le pH à 7,2 en ajoutant 1 M d’hydroxyde de sodium (NaOH). Porter le volume à 100 mL avec de l’eau déminéralisée et filtrer la solution à travers des membranes PES de 0,22 μm.
      ATTENTION : L’hydroxyde de sodium est un alcali caustique puissant. Les opérateurs doivent le manipuler et le préparer soigneusement dans une sorbonne.
  2. Préparation du tampon de gradient de densité
    1. Calculer le volume requis de chaque tampon de gradient de densité en fonction du nombre de tubes d’ultracentrifugation pour la centrifugation par gradient de densité (étape 6) (Dans ce protocole, les volumes des solutions de gradient de 60 %, 50 %, 40 %, 20 % et 10 % étaient respectivement de 2,5 mL, 3 mL, 6 mL, 6 ml et 6 mL).
    2. Pour la préparation d’une solution de travail d’iodixanol à 50 % (p/v), mélanger le tampon HEPES à 0,02 M et la solution mère d’iodixanol à 60 % (p/v) dans un rapport volumique de 1 :5 (0,5 mL :2,5 mL).
      REMARQUE : Utilisez une seringue jetable de 20 ml pour prélever la solution mère d’iodixanol et éviter d’introduire de l’air.
    3. Pour préparer des tampons d’iodixanol avec des concentrations différentes, combiner la solution de travail d’iodixanol à 50 % de l’étape 5.2.2 avec le tampon HEPES obtenu à l’étape 5.1 à l’aide d’une pipette de 1 000 μL selon les proportions indiquées dans le tableau 1.
      REMARQUE : Effectuez l’étape 5 sur un banc ultra-propre avec les lumières éteintes. Conservez la solution mère d’iodixanol ouverte au réfrigérateur à 4 °C pour éviter la croissance bactérienne. Conservez la solution d’iodixanol et le tampon HEPES à l’abri de la lumière.

6. Mise en place d’un système de centrifugation à gradient de densité

  1. Mode DGC de haut en bas
    1. Combiner 500 μL de solution PBS/BEV isolée de l’étape 4 avec 3 mL de PBS. Mélangez délicatement les solutions à l’aide d’une pipette de 1 000 μL pour obtenir 3,5 mL de solution PBS/BEV.
    2. Placez un tube d’ultracentrifugation de 31 mL sur une plaque de mousse percée de trous et étiquetez-le comme « ↓ ».
    3. Ajouter verticalement 3 mL de la solution d’iodixanol à 50 % au fond du tube à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
    4. Inclinez le tube à un angle de 70° et positionnez un support de tube ou un autre support légèrement au-dessus du niveau de la plaque de mousse, sous l’ouverture du tube.
    5. Ajouter 3 mL de solution d’iodixanol à 40 % par-dessus la solution d’iodixanol à 50 % à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
    6. Ajouter 3 mL de solution d’iodixanol à 20 % par-dessus la solution d’iodixanol à 40 % à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
    7. Ajouter 3 mL de solution d’iodixanol à 10 % par-dessus la solution d’iodixanol à 20 % à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
    8. Ajouter 3,5 mL de solution PBS/BEV de l’étape 6.1.1 au-dessus de la solution d’iodixanol à 10 % à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
    9. Remettez délicatement les tubes en position verticale.
      REMARQUE : Après le pipetage, la stratification doit être visible.
  2. Mode DGC ascendant
    1. Placez un tube d’ultracentrifugation de 31 mL sur une plaque de mousse percée de trous et étiquetez-le comme « ↑ ».
    2. Ajouter verticalement 2,5 mL de la solution mère d’iodixanol à 60 % au fond du tube. Mélangez-le délicatement avec 500 μL de solution PBS/BEV isolée de l’étape 4 à l’aide d’une pipette de 1 000 μL pour obtenir 3 mL de solution d’iodixanol/BEV à 50 %.
    3. Inclinez le tube à un angle de 70° et positionnez un support de tube ou un autre support légèrement au-dessus du niveau de la plaque de mousse, sous l’ouverture du tube.
    4. Ajouter 3 mL de la solution d’iodixanol à 40 % par-dessus la solution d’iodixanol/VEB à 50 % à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
    5. Ajouter 3 mL de la solution d’iodixanol à 20 % par-dessus la solution d’iodixanol à 40 % à l’aide d’une pipette de 1000 μL.
    6. Ajouter 3 mL de la solution d’iodixanol à 10 % par-dessus la solution d’iodixanol à 20 % à l’aide d’une pipette de 1000 μL.
    7. Ajouter 3,5 mL de PBS sur la solution d’iodixanol à 10 % à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
    8. Remettez délicatement les tubes en position verticale.
    9. À ce stade, il restait 200 μL de la suspension obtenue à l’étape 4.17, qui peut être analysée ultérieurement sous la forme d’un groupe nommé « UC ».
      REMARQUE : Lors du transfert des solutions à l’étape 6, gardez toujours la pointe de la pipette contre la paroi du tube d’ultracentrifugation perpendiculaire à l’axe du tube.

7. Centrifugation à gradient de densité et collecte de fractions

  1. Ajustez le poids des deux tubes avec du PBS pour obtenir un poids total inférieur à ± 0,005 g.
  2. Placez les tubes dans les seaux selon l’étape 4.5 et soumettez-les à une centrifugation à 160 000 × g pendant 7 h à 4 °C.
  3. Prélever les fractions à l’aide d’une pipette (1000 μL) de haut en bas contre la paroi latérale dans l’ordre suivant : 3 mL, 2 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1,5 ml et 3 mL dans un tube d’ultracentrifugation de 38,5 mL.
    REMARQUE : Maintenez la ligne de visée au même niveau que la surface du liquide.
  4. Effectuer une ultracentrifugation pour chaque fraction obtenue à l’étape 7.3 selon l’étape 4 à 160 000 × g pendant 70 min à 4 °C.
  5. Retirez le surnageant et inversez les tubes d’ultracentrifugation pendant 5 min.
  6. Remettre les pastilles en suspension dans 200 μL de PBS pré-refroidi (4 °C) à l’aide d’une pipette de 200 μL.
  7. Transférez la solution PBS/BEV dans un microtube propre de 1,5 ml.
  8. Étiquetez les fractions de F1 à F10 et analysez-les en fonction de l’étape 8.
    POINT DE PAUSE : Si les échantillons obtenus à l’étape 7.8 ne peuvent pas être traités immédiatement, conservez-les à -80 °C.

8. Caractérisation et analyse quantitative des fractions collectées

  1. Déterminer les valeurs d’absorbance (OD 340 nm) de chaque fraction à l’aide d’un détecteur de microplaques avec une commande à blanc pour calculer leur densité correspondante.
    REMARQUE : Remplacez la solution PBS/BEV (étapes 6.1.1 et 6.2.2) par PBS pour établir un contrôle vide.
    1. Préparer 100 μL de solution d’iodixanol à 0 %, 5 %, 10 %, 12,5 % et 20 % diluée par 0,02 M HEPES à base de solution mère à 50 % (étape 5.2.2) comme étalons, correspondant à des densités de 1,0058 g/mL, 1,0318 g/mL, 1,058 g/mL, 1,0708 g/mL et 1,111 g/mL, respectivement.
    2. Ajouter 50 μL de chaque fraction du témoin à blanc (préparé à l’étape 7.3) et 50 μL de chaque solution étalon (préparée à l’étape 8.1.1) pour dupliquer les puits d’une plaque à 96 puits.
    3. Réglez la longueur d’onde sur 340 nm, mesurez la densité optique du point final et calculez la densité de chaque fraction.
    4. Identifiez F4-F9 comme la plage de fractions BEV en fonction de leur densité.
  2. Déterminer la concentration en protéines des fractions du VEB à l’aide du dosage de l’acide bicinchoninique (BCA).
    1. Diluer dix fois la substance dans le PBS fourni par le fabricant pour préparer une solution protéique standard à 0,5 μg/μL.
    2. Ajouter la solution protéique étalon (préparée à l’étape 8.2.1) avec des volumes variables selon les instructions du réactif, et compléter chaque puits d’une plaque à 96 puits avec du PBS jusqu’à un volume total de 20 μL.
    3. Ajouter 20 μL des échantillons préparés à l’étape 7.8 et les échantillons laissés après la CU définie à l’étape 6.2.9 dans chaque puits.
    4. Mélanger les réactifs A et B dans un rapport de 50 :1 et transférer 200 μL dans chaque puits.
    5. Incuber l’assiette au bain-marie à 37 °C pendant 30 min.
    6. Mesurer la valeur d’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques, calculer la concentration en protéines (μg/μL) et déterminer la teneur en protéines (μg) des échantillons en fonction de la courbe standard (x : densité optique ; y : concentration en protéines) générée à partir des valeurs des solutions étalons diluées à l’étape 8.2.2.
  3. Caractériser les fractions de VEB définies à l’étape 8.1.4 à l’aide de la microscopie électronique à transmission (MET) pour vérifier la présence de VEB. Toutes les procédures ci-dessous doivent être effectuées sur la glace.
    1. Appliquer 10 μL de chaque fraction F4-F9 isolée de l’étape 7.8 et les échantillons laissés après la CU définie à l’étape 6.2.9 sur les grilles de cuivre supportées par Formvar/Carbon pendant 20 min, et éponger avec du papier filtre.
    2. Rincez les échantillons avec 100 μL de PBS trois fois pendant 1 minute chacun, puis épongez avec du papier filtre.
    3. Fixez les échantillons avec 100 μL de glutaraldéhyde à 1 % (p/v) pendant 5 min et épongez avec du papier filtre.
    4. Lavez les grilles avec 100 μL de PBS dix fois pendant 2 min chacune, et épongez avec du papier filtre.
    5. Teindre les grilles avec 50 μL d’acétate d’uranyle à 1,5 % (p/v) pendant 10 min et éponger avec du papier filtre.
      ATTENTION : L’acétate d’uranyle est radioactif et extrêmement toxique lorsqu’il est en contact avec la peau ou inhalé. Manipulez les solutions contenant de l’acétate d’uranyle dans une sorbonne et suivez les mesures de sécurité appropriées.
    6. Transférez les grilles sur une goutte de méthylcellulose à 1 % (p/v) pendant 5 min et épongez avec du papier filtre.
    7. Conservez les grilles séchées à l’air dans un environnement sombre et sans poussière jusqu’à l’observation.
    8. Capturez des images et analysez-les à l’aide d’un MET.
  4. Caractériser les fractions BEV définies à l’étape 8.1.4 à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) pour compter le nombre de particules.
    1. Calibrer le système à l’aide de particules de polystyrène de 110 nm.
    2. Lavez le bassin d’échantillons à l’aide de PBS.
    3. Diluer les échantillons provenant de différentes fractions acquises à l’étape 7.8 et les échantillons laissés après la CU définie à l’étape 6.2.9 à une concentration comprise entre 105 et 109 particules/mL, avec une concentration optimisée de 10à 7 particules/mL.
    4. Enregistrez et analysez à 11 positions avec trois réplications, en maintenant la température autour de 23-30 °C.
  5. Analyser la teneur en protéines des échantillons par coloration au bleu brillant de Coomassie (CBBS) et Western blot (WB).
    1. Diluer les échantillons de VEB provenant de différentes fractions obtenues à l’étape 7.8 et les échantillons laissés après la CU définie à l’étape 6.2.9 à l’aide de PBS et d’un tampon de chargement de 5 × jusqu’à une concentration finale de 0,5 ou 1 μg/μL, si une quantification est nécessaire, en veillant à ce que la charge de l’échantillon soit suffisante de 20 μL (10 μg ou 20 μg) de chaque puits à l’étape 8.5.2. Faites bouillir les échantillons à 95 °C pendant 10 min.
    2. Assemblez le gel de polyacrylamide préfabriqué dans le réservoir d’électrophorèse et transférez les échantillons dans les puits.
    3. Effectuer une électrophorèse verticale avec les paramètres suivants : 160 V pendant 50 min.
    4. Colorez le gel dans une solution bleu brillant Coomassie pendant 1 h, rincez à l’eau déminéralisée jusqu’à ce que le fond bleu s’éclaircisse et capturez des images avec un appareil photo.
    5. Effectuer des procédures de transfert de protéines pour d’autres gels avec les paramètres suivants : 400 mA pendant 20 min.
    6. Bloquer les membranes buvards avec une solution BSA à 5 % (p/v) pendant 1 h à température ambiante.
    7. Lavez les membranes dans un tampon TBST trois fois pendant 5 min chacune.
    8. Incuber les membranes avec des anticorps primaires (marqueurs BEV : LPS, OmpA, LTA ; Marqueurs EEV : CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrine β1 ; Autres marqueurs de contamination : Flagellin, Calnexin) pendant 8-12 h à 4 °C.
    9. Lavez les membranes dans un tampon TBST trois fois pendant 10 min chacune.
    10. Incuber les membranes avec des anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante.
    11. Effectuez l’étape 8.5.9.
    12. Développer le buvard à l’aide d’un appareil de chimiluminescence.
    13. Remplacer la solution PBS/BEV (étapes 6.1.1 et 6.2.2) par des BEV d’Escherichia coli afin d’établir un contrôle positif (voir le tableau des matériaux pour la procédure d’isolement des E. coli-BEV bruts) et effectuer toutes les expériences ci-dessus pour caractériser les BEV.
      POINT DE PAUSE : Déterminer F6-F8 comme la distribution des fractions enrichies en VEB en fonction des résultats de la caractérisation décrite ci-dessus pour les VEB fécaux, et utiliser cette plage réduite pour l’analyse subséquente.
  6. Calculer les taux de récupération en termes de particules et de protéines pour évaluer l’efficacité des deux modes DGC. Les résultats ci-dessous sont présentés sous forme de pourcentages.
    1. Calculez les taux de récupération des particules en mode descendant : nombre total de particules dans F6-F8/particules après UC défini à l’étape 6.2.9.
    2. Calculez les taux de récupération des particules en mode ascendant : nombre total de particules dans F6-F8/particules après UC défini à l’étape 6.2.9.
    3. Calculer les taux de récupération des protéines en mode Top-down : teneurs totales en protéines F6-F8 (μg)/teneur en protéines après CU définies à l’étape 6.2.9 (μg).
    4. Calculer les taux de récupération des protéines en mode ascendant : teneurs totales en protéines F6-F8 (μg)/teneur en protéines après CU définies à l’étape 6.2.9 (μg).
  7. Calculez le rapport particule/protéine pour évaluer la pureté traditionnellement définie de la CU et des deux modes DGC, et les résultats ci-dessous ont tous été présentés sous forme de pourcentages.
    1. Rapport particules/protéines après UC défini à l’étape 6.2.9 : particules après UC/teneur en protéines après UC (μg).
    2. Rapport particules/protéines en mode Top-down : particules totales en F6-F8/teneur en protéines en F6-F8 (μg).
    3. Rapport particules/protéines en mode ascendant : nombre total de particules en F6-F8/teneur en protéines en F6-F8 (μg).
  8. Sélectionnez le mode de centrifugation le plus approprié (le mode descendant a été sélectionné dans le protocole) pour la purification des matières fécales par VEB et l’analyse future.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Déterminer la distribution des fractions enrichies en VEB
Pour déterminer la distribution des fractions enrichies en vésicules extracellulaires bactériennes (VEB), un témoin à blanc a été établi pour mesurer les valeurs d’absorbance à OD 340 nm, et la densité de chaque fraction a été calculée sur la base des mesures et des lignes directrices sur l’iodixanol (étape 8.1). Le tableau 2 présente les résultats de densité, démontrant que les fractions F4 à F9 présentaient des densités dans ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les vésicules extracellulaires bactériennes (VEB) sont des nanoparticules bicouches lipidiques sécrétées par les bactéries, transportant une richesse de protéines, de lipides, d’acides nucléiques et d’autres molécules bioactives, contribuant à la médiation des effets fonctionnels des bactéries20. Il a été prouvé que les VEB dérivés de l’intestin sont impliqués dans le développement de maladies, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin, la maladie de Crohn et le cancer colorectal, et af...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024) ; le projet clé de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82230080) ; le Programme national de R-D clé de la Chine (2021YFA1300604) ; la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81871735, 82272438 et 82002245) ; Fonds des sciences naturelles du Guangdong pour les jeunes chercheurs distingués (2023B1515020058) ; la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (2021A1515011639) ; le Programme de développement de la recherche fondamentale de la Fondation des sciences naturelles de la province du Shandong en Chine (ZR2020ZD11) ; la Fondation des sciences postdoctorales (2022M720059) ; le programme de développement exceptionnel des jeunes de l’hôpital de Nanfang, Université médicale du Sud (2022J001).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 % (p/v) de glutaraldéhyde (préparé à partir d’une solution mère à 2,5 % dans de l’eau désionisée)ACMECAP1126Observation morphologique des VEB à l’aide du TEM à l’étape 8.3.3
Méthylcellulose à 1 % (p/v) (préparée à partir de la poudre d’origine dans de l’eau désionisée)Sigma-AldrichM7027Observation morphologique des VEB à l’aide du TEM à l’étape 8.3.6
Acétate d’uranyle à 1,5 % (p/v) (préparé à partir de poudre d’origine dans de l’eau désionisée)Polysciences21447-25Observation morphologique des VEB à l’aide de la MET à l’étape 8.3.5
1000 &mu ; L, 200 &mu ; L, 10 &mu ; L PipetteKIRGENKG1313, KG1212, KG1011Transférer la solution
5 % (p/v) de solution d’albumine sérique bovine (préparée à partir de la poudre d’origine dans un tampon TBST)Fdbio scienceFD0030Utilisé dans le western blot pour le blocage à l’étape 8.5.6
5 & times ; tampon de chargementFdbio scienceFD006Utilisé dans le western blot et la coloration au bleu brillant Coomassie à l’étape 8.5.1
75 % (v/v) d’alcoolLIRCONLIRCON-500 mLDésinfection
de surface Plaque 96 puitsRarA8096Mesurer les valeurs d’absorbance  ;
Anticorps anti-calnexineAbcamab92573Western blot (anticorps primaire)
Anticorps anti-CD63Abcamab134045Western blot (anticorps primaire)
Anticorps anti-CD9Abcamab236630Western blot (anticorps primaire)
Anticorps anti-flagellineSino Biological40067-MM06Western blot (anticorps primaire)
Anticorps anti-intégrine bêta 1Abcamab30394Western blot (anticorps primaire)
Anticorps anti-LPSThermo FisherMA1-83152Western blot (anticorps primaire)
Anticorps anti-LTAThermo Fisher  ;MA1-7402Western blot (anticorps primaire)
Anticorps anti-OmpACUSABIOCSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/Western blot (anticorps primaire)
Anticorps anti-synténineAbcamab133267Western blot (anticorps primaire)
Anticorps anti-TSG101Abcamab125011Western blot (anticorps primaire)
AutoclaveZEALWAYGR110DPStérilisation des fournitures et des milieux utilisés dans l’expérience
BalanceMettler ToledoAL104Équilibrer l’échantillon de tube chargé avec le dosage de l’acide
bicchoninique PBS  ;Fdbio scienceFD2001Mesurer la teneur en protéines des VEB à l’étape 8.2
BioRenderBioRenderhttps://app.biorender.comRéaliser le flux de travail schématique de l’isolement et de la purification des VEB illustré à la figure 1
Enceinte de sécurité biologiqueHaierHR1200- II B2Exécuter les procédures relatives à la manipulation des échantillons de matières fécales
Centrifugeuse 5810 R ; Rotor F-34-6-38Eppendorf5805000092 ; 5804727002, adaptateur :5804774000 Prétraitement pour VEB (Étape 3)
Appareil de chimiluminescenceBIO-OIOI600SE-MFUtilisé en western blot pour la détection de signaux à l’étape 8.5.12
Cytation 5BioTekF01Détecteur de microplaques pour la mesure des valeurs d’absorbance (étape 8.1) et de fluorescence (Figure 6)  ;
Lipoprotéines de basse densitéDAMECAC12038Définition de la distribution des composants interférents
Équipement d’électrophorèseBio-rad1658033Utilisé dans le transfert western pour la séparation et le transfert de protéines aux étapes 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Kit de chimiluminescence améliorée HRP  ;Fdbio scienceFD8020Utilisé en western blot pour la détection de signaux à l’étape 8.5.12
Escherichia coli  ; American Type Culture CollectionATCC8739Isolez les BEV en tant que témoin positif. Protocole : Dissoudre 25 g de poudre LB dans 1 L d’eau désionisée et l’autoclave. Transférer le 800 &mu ; L d’Escherichia coli conservé dans le milieu. Cultiver à 37 ° ; C dans l’agitateur de l’incubateur. Puis centrifuger à 3 000 & fois ; g pendant 20 min à 4 ° ; C, 12 000 & fois ; g pendant 30 min à 4 ° ; C, filtrer le surnageant à travers 0,22 &mu ; m membrane, et effectuer une centrifugation ultra-rapide à 160, 000 & fois ; g pendant 70 min à 4 °C. Les pastilles définies comme des VEB brutes d’Escherichia coli ont été suspendues dans 1,2 mL de PBS (étapes 3 et 4).   ;   ;   ;
Falcon tubes 50 mLKIRGENKG2811Prétraitement pour BEV (Étape 3)
Feto Protein Staining BufferAbsciab.001.50Coomassie brilliant blue staining à l’étape 8.5.4
Papier filtreBiosharpBS-TFP-070BObservation morphologique des BEV à l’aide de TEM à l’étape 8.3 (Blotting de la solution)
Grilles en cuivre soutenues par Formvar/Carbon  ;Sigma-AldrichTEM-FCF200CU50Observation morphologique des VEB à l’aide de la TEM à l’étape 8.3
HEPES poudreMeilunbioMB6078Préparer des tampons d’iodixanol avec différentes concentrations pour la centrifugation à gradient de densité
HRP AffiniPure Goat Anti-souris IgG (H+L)Fdbio scienceFDM007Western blot (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Fdbio scienceFDR007Western blot (anticorps secondaire)
Agitateur d’incubateurQiangwenDHZ-LCultiver Escherichia coli  ;
Kimwipes&commerce ; Lingettes Delicate TaskKimtech Science34155Essuyez la paroi interne du tube de l’ultracentrifugeuse à l’étape 4.15
LB bouillonHopebioHB0128Cultiver Escherichia coli  ;
Congélateur à basse température (-80 ° ; C)HaierDW-86L338JStocker les échantillons
MéthanolAlalddinM116118Utilisé dans le western blot pour l’activation de la membrane PVDF à l’étape 8.5.5
Microtubes 1,5 mLKIRGENKG2211Récupérer les fractions après centrifugation par gradient de densité
2 mLKIRGENKG2911Récupérer les fractions après centrifugation par gradient de densité
Micro tubes 5 mLBBI F610888-0001Récupérer les fractions après centrifugation par gradient de densité
Lecteur de microplaques  ;Thermo Fisher  ;Multiskan MK3Mesurer la teneur en protéines des VEB à l’étape 8.2
Filtre Millipore 0,22 &mu ; mMerck milliporeSLGP033RBStérilisation par filtration ; Matériau : polyéthersulfone, PES
NaClGHTECH1.01307.040Solution de centrifugation à gradient de densité
NaOHGHTECH1.01394.068Solution de centrifugation à gradient de densité (ajustement du pH)
Optima&trade ; XPN-100Beckman CoulterA94469Ultracentrifugation pour l’isolement des BEV aux étapes 4, 7
OptiPrep&trade ;Serumwerk Bernburg AG1893Gradient de densité centrifugation solution mère
Agitateur orbitalYouningCS-100Dissoudre les matières fécales à l’étape 2
Solution saline tamponnée au phosphateProcellPB180327Dissoudre les matières fécales à l’étape 2
PipetteEppendorf3120000267, 3120000259Transférer la solution
Pipette pasteur en plastiqueABCbioABC217003-4Éliminer le surnageant lors du prétraitement à l’étape 3.4
Membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF)MilliporeISEQ00010, IPVH00010Utilisé dans le transfert western pour le transfert de protéines à l’étape 8.5.5
Gel de polyacrylamide préfabriqué, 4&ndash ; 20 % 15 WellsACEF15420GelUtilisé dans le western blot pour la séparation des protéines à l’étape 8.5.2, 8.5.3
Diluant d’anticorps primaireFdbio scienceFD0040Utilisé dans le western blot à l’étape 8.5.8
Échelle protéiqueFdbio scienceFD0672Utilisé dans le western blot et la coloration au bleu brillant de Coomassie à l’étape 8.5
Solution de transfert rapide de protéinesUBIOUW0500Utilisé dans le western blot pour le transfert de protéines à l’étape 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Rotor à godets oscillantsBeckman Coulter369650Ultracentrifugation pour l’isolement des VEB à l’étape 4, 7
Seringue 20 mL, 50 mL  ;JetwayZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mLTampons de transfert et élimination du surnageant dans le prétraitement
de la poudre TBSFdbio scienceFD1021Utilisé dans le western blot à l’étape 8.5
Microscope électronique à transmission (MET)Hitachi  ;H-7650Observation morphologique des VEB à l’étape 8.3
Tween-20Fdbio scienceFD0020Utilisé dans le transfert western à l’étape 8.5
Tube ultracentrifugeBeckman326823, 355642Ultracentrifugation pour l’isolement des VEB à l’étape 4, 7
Banc ultra-propreAIRTECHSW-CJ-2FDExécuter les procédures de manipulation des liquides
Bain-marieBluepardCU600Utilisé pour la mesure de la teneur en protéines des VEB à l’étape 8.2.5
ZetaViewParticle MetrixS/N 21-734, Logiciel ZetaView (version 8.05.14 SP7)Analyse de suivi des nanoparticules (NTA) pour la mesure de la taille des particules et de la concentration des VEB à l’étape 8.4
à Microtubes

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  2. Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
  3. de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
  4. Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359(2022).
  5. Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
  6. Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277(2019).
  7. Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
  8. Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  9. Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
  10. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  11. Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
  12. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  13. Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208(2022).
  14. Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359(2022).
  15. Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
  16. Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
  17. Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520(2013).
  18. Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
  19. Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184(2022).
  20. Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689(2022).
  21. Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
  22. Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
  23. Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442(2022).
  24. Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107(2020).
  25. Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
  26. Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
  27. Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
  28. Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
  29. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  30. Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829(2016).
  31. Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
  32. Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046(2023).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Isolement des BEV f cauxv sicules du microbiote intestinalpurification des BEVultracentrifugationgradient d iodixanolr cup ration des particulesanalyse de la teneur en prot ineschantillons f caux humains

Articles connexes