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Article de méthode

Microdialyse intradermique : une approche pour étudier les nouveaux mécanismes du dysfonctionnement microvasculaire chez l’homme

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DOI :

10.3791/65579

⸱

21 juillet 2023

 ,  ,  , 
1Department of Kinesiology, The Pennsylvania State University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La microdialyse intradermique est une technique peu invasive utilisée pour étudier la fonction microvasculaire dans la santé et la maladie. Les protocoles dose-réponse et de chauffage local peuvent être utilisés pour cette technique afin d’explorer les mécanismes de vasodilatation et de vasoconstriction dans la circulation cutanée.

Résumé

Le système vasculaire cutané est un tissu accessible qui peut être utilisé pour évaluer la fonction microvasculaire chez l’homme. La microdialyse intradermique est une technique peu invasive utilisée pour étudier les mécanismes de la fonction vasculaire des muscles lisses et de l’endothélium dans la circulation cutanée. Cette technique permet de disséquer pharmacologiquement la physiopathologie de la dysfonction endothéliale microvasculaire telle qu’elle est indexée par la diminution de la vasodilatation médiée par l’oxyde nitrique, un indicateur du risque de développement d’une maladie cardiovasculaire. Dans cette technique, une sonde de microdialyse est placée dans la couche dermique de la peau, et une unité de chauffage local avec une sonde de débitmétrie laser Doppler est placée sur la sonde pour mesurer le flux de globules rouges. La température locale de la peau est bloquée ou stimulée par l’application directe de chaleur, et des agents pharmacologiques sont perfusés à travers la sonde pour stimuler ou inhiber les voies de signalisation intracellulaires afin d’induire une vasodilatation ou une vasoconstriction ou d’interroger des mécanismes d’intérêt (cofacteurs, antioxydants, etc.). La conductance vasculaire cutanée est quantifiée et les mécanismes de dysfonctionnement endothélial dans les états pathologiques peuvent être délimités.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès aux États-Unis1. L’hypertension (HTN) est un facteur de risque indépendant d’accident vasculaire cérébral, de maladie coronarienne et d’insuffisance cardiaque et on estime qu’elle affecte plus de ~ 50 % de la population des États-Unis2. L’HTN peut se développer sous la forme d’une MCV indépendante (HTN primaire) ou à la suite d’une autre affection, telle qu’une polykystose rénale et/ou des troubles endocriniens (HTN secondaire). L’étendue des étiologies de l’HTN complique les recherches sur les mécanismes sous-jacents et les lésions des organes terminaux observées avec l’HTN. Des approches de recherche diverses et novatrices sur la physiopathologie des lésions des organes terminaux associées à l’HTN sont nécessaires.

L’un des premiers signes pathologiques des MCV est le dysfonctionnement endothélial, caractérisé par une altération de la vasodilatation médiée par l’oxyde nitrique (NO) 3,4,5. La dilatation médiée par le flux est une approche couramment utilisée pour quantifier le dysfonctionnement endothélial associé aux MCV, mais le dysfonctionnement endothélial dans les lits microvasculaires peut être à la fois indépendant et précurseur de celui des grosses artères conduitives 6,7,8. De plus, les artérioles résistantes sont plus directement agies par les tissus locaux que les artères conduitives et ont un contrôle plus immédiat sur l’apport de sang riche en oxygène. La fonction microvasculaire est prédictive de la survie sans événement cardiovasculaire indésirable 9,10,11. La microvascularisation cutanée est un lit vasculaire accessible qui peut être utilisé pour examiner les réponses à des stimuli physiologiques et pharmacologiques vasoconstricteurs ou vasodilatateurs. La microdialyse intradermique est une technique peu invasive dont l’objectif est d’étudier les mécanismes du muscle lisse vasculaire et de la fonction endothéliale dans la microvascularisation cutanée avec dissection pharmacologique ciblée. Cette méthode contraste avec d’autres techniques, telles que l’hyperémie réactive post-occlusive, qui ne permet pas de dissection pharmacologique, et l’ionophorèse, qui permet une administration pharmacologique mais est moins précise dans son mécanisme d’action (revue en détail ailleurs12).

La raison d’être de la mise au point et de l’utilisation de cette technique est examinée en détail ailleurs13. Cette approche a été développée à l’origine pour être utilisée dans la recherche neurologique chez les rongeurs, puis a été appliquée pour la première fois à l’homme pour étudier les mécanismes sous-jacents à la vasodilatation active d’un point de vue thermorégulateur. À la fin des années 1990, cette méthode a été utilisée pour examiner les mécanismes neuronaux et endothéliaux en ce qui concerne l’échauffement local de la peau. Depuis lors, la technique a été utilisée pour étudier un certain nombre de mécanismes de signalisation neurovasculaire dans la peau.

À l’aide de cette technique, notre groupe et d’autres ont interrogé les mécanismes de dysfonctionnement endothélial dans la microvascularisation de plusieurs populations cliniques, y compris, mais sans s’y limiter, la dyslipidémie, le vieillissement primaire, le diabète, l’insuffisance rénale chronique, le syndrome des ovaires polykystiques, la prééclampsie, le trouble dépressif majeur 14,15,16,17,18,19 et l’hypertension 20,21,22,23,24. Par exemple, une étude antérieure a révélé que les femmes normotendues ayant des antécédents de prééclampsie, qui présentent un risque accru de MCV, présentaient une vasodilatation réduite de la circulation cutanée médiée par le NO par rapport aux femmes ayant des antécédents de grossesse normotendue20. Dans une autre étude, les adultes diagnostiqués avec une HTN primaire ont démontré une sensibilité accrue à l’angiotensine II dans la microvascularisation par rapport aux témoins sains21, et il a été démontré que la pharmacothérapie antihypertensive chronique donneuse de sulfhydryle chez les patients atteints d’HTN primaire diminue la pression artérielle et améliore à la fois la vasodilatation médiée par le sulfure d’hydrogène et le NO22. Wong et al.23 ont constaté une altération de la vasodilatation à médiation sensorielle et à médiation par le NO chez les adultes préhypertendus, coïncidant avec notre constatation d’une progression de la dysfonction endothéliale avec l’augmentation des stades HTN, telle que catégorisée par les lignes directrices de 2017 de l’American Heart Association et de l’American College of Cardiology24.

La technique de microdialyse intradermique permet d’effectuer des investigations mécanistiques étroitement contrôlées sur la fonction microvasculaire dans les états de santé et de maladie. Par conséquent, cet article vise à décrire la technique de microdialyse intradermique telle qu’elle est appliquée par notre groupe et d’autres. Nous détaillons les procédures de stimulation pharmacologique de l’endothélium avec de l’acétylcholine (ACh) afin d’examiner la relation dose-réponse et la stimulation physiologique de la production endogène de NO avec un protocole de stimulation par chauffage local à 39 °C ou 42 °C. Nous présentons des résultats représentatifs pour chaque approche et discutons des implications cliniques des résultats qui ont découlé de cette technique.

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Protocole

Toutes les procédures sont approuvées par l’Institutional Review Board de l’Université d’État de Pennsylvanie avant le recrutement des participants.

1. Configuration de l’équipement

  1. Allumez l’unité de chauffage local et le débitmètre laser Doppler.
    REMARQUE : Les deux doivent être étalonnés avant la collecte des données conformément aux instructions du fabricant. Le débitmètre laser Doppler doit être connecté à un matériel d’acquisition de données avec échantillonnage à 100 Hz (100 échantillons/min) et enregistrement continu dans un logiciel d’acquisition de données. Bien que d’autres matériels et logiciels d’acquisition de données puissent être utilisés, pour plus de simplicité, les instructions restantes reflètent les capacités matérielles du matériel PowerLab et du logiciel LabChart.
  2. Ouvrez un fichier du logiciel LabChart.
    REMARQUE : Un fichier de référence avec les capacités d’entrée de données souhaitées et de collecte continue de données doit être créé à l’avance. Il doit y avoir un panneau pour chaque Doppler laser et chaque réchauffeur local qui correspond à chaque site de microdialyse, et les panneaux doivent correspondre aux entrées de canal appropriées dans l’unité matérielle d’acquisition de données.

2. Mise en place des fibres de microdialyse

  1. Identifiez les gros vaisseaux sanguins visibles de la peau dans la face ventrale de l’avant-bras et indiquez-les à l’aide d’un marqueur permanent (utilisez un garrot pour visualiser les vaisseaux si nécessaire ; l’identification des vaisseaux dans une peau à pigmentation foncée peut nécessiter une plus grande confiance à la palpation).
  2. Écouvillonnez la zone englobant les marques et une partie généreuse de la zone environnante à l’aide d’écouvillons à la bétadine. Essuyez la bétadine avec des tampons imbibés d’alcool. Couvrez la zone stérilisée de la peau avec un champ stérile et appliquez de la glace pendant ~5 min pour engourdir la zone.
  3. Retirez la glace et insérez une aiguille d’introduction (23 G, longueur 25 mm), biseau vers le haut, dans la couche dermique de la peau à une profondeur de 2 à 3 mm (selon l’épaisseur de la peau). Avancez l’aiguille en faisant attention de rester dans la couche dermique, et sortez de la peau à ~20 mm du point d’insertion.
    REMARQUE : Pour confirmer la bonne profondeur de placement dans la peau, la forme de l’aiguille doit être visible et facilement palpable, mais la couleur de l’aiguille doit être cachée. Si plus d’une sonde de microdialyse est nécessaire pour l’expérience, deux aiguilles d’introduction devront être placées à ≥2,5 cm l’une de l’autre et positionnées avant l’insertion de la sonde de microdialyse. Les sondes ne doivent pas être placées le long du même vaisseau principal.
  4. En laissant l’aiguille en place, connectez la sonde (via le verrou Luer) à une seringue contenant la solution de Ringer lactée. Faites passer l’extrémité opposée de la sonde à travers l’aiguille d’introduction jusqu’à ce que la membrane semi-perméable de la sonde soit proche de l’ouverture de l’aiguille d’introduction, mais toujours à l’extérieur de celle-ci. Perfusez lentement une petite quantité de solution de Ringer à travers la fibre jusqu’à ce que la solution soit visiblement perfusée à travers les pores de la membrane pour confirmer l’intégrité de la membrane.
  5. Si vous utilisez une sonde de microdialyse Harvard Bioscience et une aiguille d’introduction, suivez les étapes 2.5.1 à 2.5.2.
    1. Après confirmation de la fonction de la sonde, faites passer la sonde à travers l’aiguille d’introduction jusqu’à ce que la membrane soit complètement contenue dans la couche dermique de la peau à l’intérieur de l’aiguille d’introduction.
    2. À l’aide d’un doigt, fixez la sonde en place à proximité de l’aiguille et retirez l’aiguille dans le sens opposé à l’insertion. Collez la partie externe de la fibre en place sur la peau pour empêcher le déplacement de la membrane semi-perméable pendant l’expérience.
  6. Si vous utilisez une sonde de microdialyse Bioanalytical Systems et une aiguille d’introduction, suivez les étapes 2.6.1 à 2.6.2.
    1. Après confirmation de la fonction de la sonde, saisissez le moyeu de l’aiguille d’introduction et la partie distale de la sonde de microdialyse d’une main, puis retirez simultanément l’aiguille opposée à la direction d’insertion, en déplaçant la sonde de microdialyse en place.
    2. Ajustez la sonde au besoin pour vous assurer que la membrane semi-perméable est complètement enfouie dans la peau. Collez la fibre externe en place sur la peau pour empêcher le déplacement de la membrane semi-perméable pendant l’expérience.

3. Hyperémie

  1. En attendant que la réponse hyperémique à l’insertion de l’aiguille s’atténue (~60-90 min), placez la seringue à usage unique dans le plateau porte-seringue des pompes à micro-perfusion. Perfuser la solution de Ringer, la solution saline ou la solution de véhicule (la solution dans laquelle l’agent pharmacologique expérimental est dissous ; 2 μL/min) pendant la phase d’hyperémie.
    REMARQUE : Bien que les sondes de microdialyse ne puissent pas être retirées pendant cette phase de ~60 à 90 minutes, le participant peut ajuster la position de son corps ou bouger sa main, ou le verrou Luer de la sonde peut être retiré de la seringue et fixé avec du ruban adhésif au bras du participant pour lui permettre de se tenir debout brièvement. Une fois instrumentées avec des réchauffeurs locaux et des sondes de débitmétrie laser Doppler (LDF) et une fois que la collecte de données a commencé, les sondes LDF ne peuvent pas être déplacées.
  2. Lorsque la rougeur de la peau, qui est un indicateur de la réponse hyperémique au traumatisme de l’aiguille, s’est atténuée, fixez l’unité de chauffage local à la peau recouvrant la membrane semi-perméable via le disque adhésif de la sonde, en veillant à ce que le centre de l’appareil de chauffage s’aligne avec la trajectoire de la sonde de microdialyse.
  3. Placez la sonde LDF dans l’ouverture au centre de l’appareil de chauffage local de manière à ce que le laser soit directement perpendiculaire à la surface de la peau. Une fois les sondes LDF placées et sécurisées, cliquez sur démarrer sur le logiciel d’acquisition de données pour enregistrer et afficher en continu les valeurs de flux de globules rouges (flux de globules rouges, unités de perfusion, PU). Si l’hyperémie a complètement disparu, le flux de globules rouges sera stable à ~5-20 PU (la pulsatilité des vaisseaux sous la sonde LDF peut être réfléchie par de légères élévations dans le PU qui coïncident avec les battements cardiaques).
  4. Placez un brassard de tensiomètre automatique sur le bras d’un sujet qui n’a pas été instrumenté.
  5. Réglez les réchauffeurs locaux à 33 °C pour maintenir la température de la peau dans une plage thermoneutrede 25, éliminant ainsi toute variation de l’influence des stimuli thermiques. Pour ajouter un commentaire à l’enregistrement continu dans le logiciel d’acquisition de données afin de désigner les événements de l’expérience, cliquez sur la zone de texte dans le coin supérieur droit de l’écran, tapez un commentaire, sélectionnez les canaux qui doivent recevoir le commentaire, puis cliquez sur ajouter.

4. Protocole dose-réponse à l’acétylcholine

  1. Une fois que le flux de globules rouges s’est stabilisé en réponse à la chaleur locale de 33 °C, commencez la collecte des données de base, distinguées dans le fichier du logiciel d’acquisition de données par un commentaire de début de référence. Au moins 5 à 10 minutes de base stable sont nécessaires pour l’analyse des données. redémarrez la ligne de base à tout moment à ce stade de la collecte de données si nécessaire, et marquez-le dans le fichier LabChart. Dans la dernière minute de la ligne de base, collectez une mesure de la pression artérielle et entrez les valeurs dans un commentaire dans le fichier LabChart.
  2. À la fin des 5 à 10 minutes de collecte des données de base, mesurez et enregistrez la pression artérielle de base, puis entrez la ligne de base de fin de commentaire dans le logiciel d’acquisition de données.
  3. Éteignez les pompes à micro-perfusion et remplacez les seringues remplies de solution de Ringer lactée par la seringue remplie de la plus faible concentration d’ACh (10-10 M).
  4. Fixez les nouvelles seringues en place et confirmez la perfusion du liquide à travers l’extrémité de la sonde avant de remettre les pompes à micro-perfusion en marche. Entrez le commentaire début −10 dans l’enregistrement du logiciel d’acquisition de données.
  5. Chaque concentration d’ACh sera perfusée pendant 5 à 10 minutes à 2 μL/min. Dans la dernière minute de la perfusion, pour chaque concentration, mesurez et enregistrez la pression artérielle. Une fois que le temps de perfusion pour une concentration donnée est terminé, remplacez la seringue par la concentration la plus élevée suivante (par exemple, une solution de 10 à 10 M d’ACh est remplacée par une solution de 10 à 9 M d’ACh), comme décrit aux étapes 4.2 à 4.4.
  6. Immédiatement après avoir perfusé la concentration finale d’ACh (10−1 M), remplacer la seringue d’ACh par une seringue contenant la solution de Ringer et augmenter la température du chauffage local à 43 °C. Une fois que le flux de globules rouges s’est stabilisé, remplacer la solution de Ringer par du nitroprussiate de sodium (28 mM) pour produire une vasodilatation locale maximale induite par la chaleur et pharmacologiquement induite. Mesurez et enregistrez la pression artérielle toutes les ~3 minutes pendant cette phase de vasodilatation maximale.
  7. Une fois qu’un plateau de flux maximal de globules rouges s’est produit (~5 min de PU stable), terminez l’expérience. Sélectionnez arrêter dans le coin inférieur droit du logiciel d’acquisition de données pour mettre fin à la collecte continue des données.

5. Protocole de chauffage local

  1. Une fois que le flux de globules rouges s’est stabilisé à la suite d’une hyperémie, commencez la collecte des données de base et indiquez-le dans le fichier du logiciel d’acquisition de données avec un commentaire. Dans la dernière minute de la ligne de base, collectez une mesure de la pression artérielle et entrez les valeurs dans un commentaire dans le fichier du logiciel d’acquisition de données.
  2. Augmentez les réchauffeurs locaux à 39 °C ou 42 °C, selon les besoins du protocole (expliqué dans la section de discussion).
  3. Une fois que le flux de globules rouges a atteint un plateau en réponse à l’application de chaleur locale (~40-60 min de chauffage), perfusez l’ester méthylique de N G-nitro-l-arginine (L-NAME ; 15 mM dissous dans la solution de Ringer ; 2 μL/min ; un inhibiteur de la NO synthase) à travers la ou les sondes de microdialyse.
  4. Une fois que le flux de globules rouges a atteint un plateau en réponse à L-NAME (~15-25 min de perfusion), augmenter les réchauffeurs locaux à 43 °C.
  5. Une fois que le flux de globules rouges a atteint un plateau en réponse à 43 °C (un plateau de ~2 à 5 minutes se produit après ~20 à 45 minutes de chauffage), perfusez le nitroprussiate de sodium (28 mM dissous dans la solution de Ringer) à travers la ou les sondes de microdialyse.
  6. Une fois qu’un plateau de flux maximal de globules rouges s’est produit (~5 min de PU stable), terminez l’expérience. Sélectionnez arrêter dans le coin inférieur droit du logiciel d’acquisition de données pour mettre fin à la collecte de données.

6. Retrait des sondes de microdialyse

  1. Après la fin de l’expérience, utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux pour couper les sondes de microdialyse. Retirez soigneusement les sondes LDF des radiateurs et retirez les radiateurs de la peau. Retirez délicatement le ruban adhésif qui maintient les sondes en place sur la peau.
  2. Identifiez visuellement le site de ponction de chaque côté de la sonde qui a formé le plus petit caillot sanguin. Coupez la partie de la sonde près du site avec le plus petit caillot, en laissant ~1 po de la sonde à l’extérieur de la peau non coupée.
  3. Nettoyez la partie de la peau entourant les sites d’entrée et de sortie de la sonde avec un tampon imbibé d’alcool, ainsi que la longueur de ~1 po de la sonde laissée sur le site moins coagulé.
  4. Laissez sécher l’alcool sur la peau. Ensuite, saisissez la partie de la sonde qui s’étend du site de ponction avec le plus grand caillot, à l’opposé de la partie ~1 po à l’extrémité la moins coagulée. Tirez lentement la sonde vers le plus gros caillot de sang.
  5. Placez une gaze stérile sur tout saignement résultant du retrait de la sonde et appliquez une pression.

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Résultats

Protocole dose-réponse à l’acétylcholine

La figure 1A illustre un schéma détaillant le protocole dose-réponse de l’ACh. La figure 1B illustre des tracés représentatifs des valeurs de flux de globules rouges (unités de perfusion, PU ; moyennes de 30 s) à partir du protocole dose-réponse ACh standardisé pour un sujet au fil du temps. La figure 1C illustre un fichier de données brutes d’un p...

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Discussion

La technique de microdialyse intradermique est un outil polyvalent dans la recherche vasculaire humaine. Les chercheurs peuvent modifier le protocole afin de diversifier davantage ses applications. Par exemple, nous décrivons un protocole dose-réponse ACh, mais d’autres recherches sur les mécanismes de vasoconstriction ou de tonus vasomoteur, plutôt que sur la vasodilatation seule, ont utilisé des approches dose-réponse à la noradrénaline ou au nitroprussiate de sodium 26,27,28,29,30,31.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts et n’ont rien à divulguer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringues de 1 mLSeringues BD302100
AcetlycholinePharmacopée des États-Unis1424511Les données pilotes recueillies dans notre laboratoire indiquent que le séchage de l’acétylcholine augmente la variabilité de la réponse CVC ; ne pas sécher, stocker dans un dessiccateur
Tampons imbibés d’alcoolMckesson191089
Baby Bee Seringue DriveBioanalytical Systems, IncorporatedMD-1001Dans cette étude, le support de 3 seringues en option (numéro de catalogue MD-1002) a été utilisé
sondes de microdialyse linéaires CMA 30appareil de Harvard, moniteur
Connex, moniteur de pressionartérielle automatiséWelchAllyn74CT-B
contrôleur de pompe à seringue de ruche, systèmes bioanalytiques MD-1020 intégrés,commandes jusqu’à 4 entraînements de seringue Baby Bee
LabChart 8AD Instruments**Le matériel PowerLab et le logiciel LabChart doivent être des versions compatibles
Lactated Ringer’s SolutionAvantor (VWR)76313-478
Laser Doppler Blood FlowMeterMoor InstrumentsMoorVMS-LDF
Kit d’étalonnage de sonde laser DopplerMoor InstrumentsCAL
Laser Doppler VP12 SondeMoor InstrumentsVP12
Bioanalytical Systems, Inc.MD-2000
NG-nitro-l-arginine méthyl esterSigma Aldrich483125-ML-NAME
Povidone-iode / bétadineDynarex1202
PowerLab C Dispositif d’acquisition de donnéesAD InstrumentsPLC01**
Interface d’instrument PowerLab C ADInstrumentsPLCI1**
Disques adhésifs de sondeMoor Instrumentsfixe l’unité de chauffage local à la peau
Skin Heater ControllerMoor InstrumentsmoorVMS-HEAT 1.3
Petite sonde chauffanteMoor InstrumentsVHP2
Champs stérilesHalyard89731
Gaze stérileDukal Corporation2085
Gants chirurgicaux stérilesEsteem Numéro de catalogue Cardinal Health8856Nsuivi des initiales de la taille du gant, puis de la lettre « B » (par exemple, 8856NMB pour moyen)
Ciseaux chirurgicauxCole-ParmerUX-06287-26
: , de point CMA8010460 , Sondes de microdialyse linéaires

Références

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