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Pince hyperglycémique et pince hypoglycémique chez la souris consciente

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DOI :

10.3791/65581

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26 janvier 2024

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1Department of Neuroscience for Metabolic Control, Graduate School of Medical Science, Kumamoto University

Dans cet article

Résumé

Une pince hyperglycémique est utilisée pour mesurer la libération d’insuline avec une concentration de glucose sanguin plus élevée. Un clamp hypoglycémique sert à mesurer la production de glucose induite par des réponses contre-régulatrices. Les deux méthodes utilisent la même procédure chirurgicale. Ici, nous présentons une technique de clamp pour évaluer le métabolisme systémique du glucose.

Résumé

Le diabète sucré (DS) est causé par une libération insuffisante d’insuline par les cellules β pancréatiques (diabète de type 1) et une sensibilité à l’insuline dans les muscles, le foie et les tissus adipeux (diabète de type 2). L’injection d’insuline traite les patients atteints de diabète sucré mais entraîne une hypoglycémie comme effet secondaire. Le cortisol et les catécholamines sont libérés pour activer la production de glucose du foie afin de récupérer l’hypoglycémie, appelée réponse contre-régulatrice (CRR). Dans la recherche sur le diabète à l’aide de modèles de rongeurs, des tests de tolérance au glucose et l’injection de 2-désoxyglucose sont utilisés pour mesurer la libération d’insuline et la CRR, respectivement. Cependant, les concentrations de glucose dans le sang changent constamment au cours des expériences, ce qui rend difficile l’évaluation de la libération nette d’insuline et de la CRR. Cet article décrit une méthode dans laquelle la glycémie est maintenue à 250 mg/dL ou 50 mg/dL chez des souris conscientes pour comparer la libération d’insuline et d’hormones CRR, respectivement.

Un tube en polyéthylène est implanté dans l’artère carotide et la veine jugulaire des souris, et les souris sont autorisées à se remettre de la chirurgie. Le tube de la veine jugulaire est relié à une seringue Hamilton avec un pousse-seringue pour permettre la perfusion d’insuline ou de glucose à un débit constant et variable. Le tube de l’artère carotide sert à la collecte de sang. Pour le clamp hyperglycémique, 30 % de glucose est perfusé dans la veine et la glycémie est mesurée à partir du sang artériel toutes les 5 ou 10 minutes. Le débit de perfusion de 30 % de glucose est augmenté jusqu’à ce que la glycémie atteigne 250 mg/dL. Le sang est prélevé pour mesurer les concentrations d’insuline. Pour le clamp hypoglycémiant, 10 mU/kg/min d’insuline sont perfusés avec 30% de glucose, dont le débit de perfusion est variable pour maintenir 50 mg/dL de glycémie. Le sang est prélevé pour mesurer les hormones contre-régulatrices lorsque la perfusion de glucose et la glycémie atteignent un état d’équilibre. Les pinces hyperglycémiques et hypoglycémiques ont la même procédure chirurgicale et les mêmes configurations expérimentales. Ainsi, cette méthode est utile pour les chercheurs sur le métabolisme systémique du glucose.

Introduction

Le glucose est une source d’énergie importante pour les cellules, et un manque de glucose peut entraîner divers symptômes et complications. En cas d’hypoglycémie (hypoglycémie, généralement inférieure à 70 mg/dL de glycémie à jeun, mais ne doit pas être déterminée par une seule valeur1), les symptômes les plus courants sont la faiblesse, la confusion, la transpiration et les maux de tête. Il peut également perturber la fonction cérébrale et augmenter le risque d’événements cardiovasculaires et de mortalité2. À l’inverse, l’hyperglycémie est une condition médicale dans laquelle la concentration plasmatique de glucose dépasse les niveaux normaux (généralement > 126 mg/dL en glycémie à jeun3). Cela peut se produire chez les personnes atteintes de diabète qui présentent un déficit de production ou d’utilisation d’insuline. L’hyperglycémie peut entraîner une acidocétose diabétique, qui se produit lorsque le corps ne peut pas utiliser le glucose comme énergie mais décompose les acides gras comme carburant. L’état hyperosmolaire hyperglycémique augmente également la mortalité4. L’hyperglycémie à long terme peut endommager les vaisseaux sanguins, les nerfs et les organes, entraînant le développement de plusieurs complications chroniques telles que les maladies cardiovasculaires, les rétinopathies et les maladies rénales. Ainsi, la glycémie doit être maintenue dans une fourchette étroite entre 100 mg/dL et 120 mg/dL.

La glycémie est régulée par l’équilibre entre l’entrée et la sortie de glucose dans un modèle à un compartiment (Figure 1A). L’apport en glucose comprend le glucose absorbé par les aliments et la production de glucose par le foie, les reins et l’intestin grêle. La production de glucose comprend l’absorption du glucose dans les tissus et l’élimination du glucose par les reins. La quantité de glucose entrant et sortant est régulée par les hormones endocriniennes. Par exemple, le glucagon, la corticostérone et les catécholamines, connus sous le nom d’hormones contre-régulatrices, sont libérés lorsque la glycémie diminue5. Ils stimulent la dégradation du glycogène et la synthèse du glucose, principalement du foie ; Ces processus sont connus sous le nom de glycogénolyse et de gluconéogenèse, respectivement. L’hyperglycémie augmente la libération d’insuline par les cellules β pancréatiques et stimule l’absorption du glucose dans les muscles, les tissus adipeux et le cœur 6,7,8,9. L’exercice augmente l’absorption de glucose indépendante de l’insuline10. Le système nerveux sympathique augmente l’absorption du glucose dans les muscles et le tissu adipeux brun 6,11. Pour mesurer la capacité à réguler le métabolisme du glucose dans les tissus périphériques, les chercheurs utilisent généralement le test de tolérance au glucose (GTT) et le test de tolérance à l’insuline (ITT) (Figure 1B,C). Dans le GTT, deux facteurs doivent être pris en compte : la libération d’insuline et la sensibilité à l’insuline (Figure 1B). Cependant, la courbe de concentration de glucose pendant le test de 120 minutes est différente chez chaque souris, ce qui peut affecter différentes quantités de libération d’hormones. Dans le cas de l’ITT, la glycémie est régulée à la fois par la sensibilité à l’insuline et la libération d’hormones contre-régulatrices. Par conséquent, il est difficile de déterminer la signification précise du métabolisme du glucose, de la libération d’insuline et de la sensibilité à l’insuline dans les situations où la glycémie n’est pas constante.

Pour surmonter ces problèmes, il est souhaitable de maintenir la glycémie à un niveau constant (ou « clamp »). Dans le clamp hyperglycémique, le glucose est infusé dans la circulation sanguine pour augmenter la glycémie à un niveau spécifique, puis maintenu à ce niveau pendant un certain temps. La quantité de glucose infusé est ajustée en fonction des mesures de la glycémie toutes les 5 à 10 minutes pour maintenir un état d’équilibre. Cette technique est particulièrement utile pour comprendre les paramètres de la sécrétion d’insuline à un taux de glucose clampé. Le clamp hypoglycémique est une méthode pour maintenir une glycémie basse en perfusant de l’insuline. Le glucose est perfusé à un rythme variable pour maintenir un taux de glucose sanguin spécifique. Si la souris ne peut pas se remettre de l’hypoglycémie, plus de glucose doit être perfusé.

Bien qu’il y ait de nombreux avantages à effectuer des pinces hyperglycémiques et hypoglycémiques, les procédures chirurgicales et expérimentales sont considérées comme techniquement difficiles. Ainsi, peu de groupes de recherche ont pu les faire. Nous avons cherché à décrire ces méthodes pour les chercheurs ayant des contraintes financières et de main-d’œuvre afin de démarrer ces expériences avec un budget inférieur.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Kumamoto.

REMARQUE : Pour soulager la douleur, l’ibuprofène a été administré dans l’eau potable (0,11 mg/mL) pendant 48 h, et la buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg i.p.) a été administrée 30 min avant la chirurgie. Les conditions stériles comprennent les gants, les masques et les instruments autoclavés stérilisés à l’oxyde d’éthylène entre les animaux. L’opération a été réalisée sur un coussin chauffant réglé à 37 °C et recouvert d’un nouveau tapis de laboratoire pour chaque animal. Avant l’opération, la zone chirurgicale a été nettoyée avec une solution de bétadine et de l’alcool. Tous les instruments chirurgicaux ont été stérilisés à l’autoclave (pour un maximum de deux chirurgies). Avant de faire l’incision, les souris ont été vérifiées pour s’assurer qu’elles étaient complètement anesthésiées. La profondeur de l’anesthésie pour chaque souris a été évaluée avant et pendant la chirurgie par pincement des orteils. La période d’acclimatation ne dépassait pas 5 minutes à chaque fois. Suivez les instructions de l’IACUC de l’institution concernée.

1. Préparation des tubes pour la veine jugulaire et l’artère carotide

  1. Stérilisez tous les tubes, les fournitures en polypropylène (p. ex., les pointes de pipette) et les sutures avec un autoclave ou de l’oxyde d’éthylène. Pour la veine jugulaire, raccorder 8 cm de tube1 (voir Matériaux) et 3 cm de tube2 à l’aide de colle (figure 2A). Mettez 2 mm de tubulure 1 sur le dessus car la tubulure 2 (polyéthylène) est trop dure et peut endommager les vaisseaux sanguins (tubulure 1.1).
  2. Sonde d’extension pour la veine jugulaire (Tubulure 1.2) pour perfuser du glucose et de l’insuline
    1. Préparez deux tubes de 30 cm et un tube de 10 cm avec un tube2 (Figure 2A). Coupez l’extrémité pointue d’une pointe de pipette de 20 μL (ou tout ce qui a une extrémité étroite avec un diamètre extérieur < 0,5 mm pour se connecter à la tubulure 1,1) et placez-y trois tubulures2 (30 cm, 30 cm et 10 cm) ensemble. Sceller avec de la colle adhésive.
    2. Placez 5 cm de tube1 à l’autre extrémité du tube2.
  3. Pour l’artère carotide (Tubulure 1.3) : Étirez la tubulure 2 pour la rendre plus fine. Connectez 8 cm de tube1 et 3 cm de tube étiré2 à l’aide de colle (Figure 2A). Faites une marque à 9 mm de la pointe.
  4. Aiguille à extrémité non tranchante qui relie le tube à la seringue : Faites une égratignure près de l’extrémité pointue de l’aiguille (23 G) avec une lime métallique, pliez-la doucement d’avant en arrière plusieurs fois avec une pince et cassez-la. Faites la même coupe au milieu de l’aiguille pour faire un morceau de connecteur métallique (Figure 2A).
  5. Tube d’extension pour l’artère pour prélever du sang (Ensemble de tubulures 1.4) : Connectez 10 cm de tube1 avec le connecteur métallique et l’aiguille non tranchante qui a été fabriquée à l’étape 1.4.
    REMARQUE : Tous les tubes et sutures sont stérilisés avec un autoclave ou de l’oxyde d’éthylène

2. Chirurgie

  1. Anesthésier une souris avec de l’isoflurane (1,5-2,0 %) ou de la kétamine/xylazine (kétamine 10 mg/mL, xylazine 1 mg/mL dans une solution saline stérile à 0,9 %, 0,1 mL/10 g de poids corporel (PC) par injection intrapéritonéale [ip]). Gardez la souris sur le tapis chaud (37 °C) pour réduire le stress physique. Attendez une anesthésie profonde pendant 5 à 10 minutes. Confirmez la profondeur de l’anesthésie par le réflexe de la pédale, la respiration et la fréquence cardiaque, et la réponse aux stimuli par pincement des orteils. Pendant la chirurgie, du ruban chirurgical doit être utilisé pour fixer le capuchon nasal à la table d’opération pour une inhalation continue de l’anesthésie. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
  2. Remplir une solution saline héparinée (100 U/mL) dans les tubes 1.1 et 1.3 et les raccorder avec une seringue de 1 mL avec une aiguille non tranchante (figure 2B). Fermez l’extrémité du tube3 (voir Tableau des matériaux) en le faisant fondre avec un fer à souder, qui servira de capuchons pour les tubes1.1 et les tubes1.3.
  3. Rasez et essuyez la première (interscapulaire sur le dos) et la deuxième (cou à l’avant) zone d’incision avec trois cycles de bétadine à 10 % suivis d’une préparation préopératoire avec de l’alcool stérile à 70 %. Faites une petite incision verticale de 5 mm céphalique sur la ligne médiane du sternum, disséquez les tissus et exposez l’artère. Séparez le nerf vague de l’artère. Cela réduit les effets négatifs de l’ablation du nerf vague sur le métabolisme du glucose.
    REMARQUE : L’étape de l’incision ventrale à l’étape où le cathéter est inséré dans la veine et fixé avec des sutures en soie est réalisée au microscope.
  4. Placez deux sutures en soie sous l’artère. Arrêtez le flux sanguin en attachant fermement une suture du côté crânien (Figure 2C-1) et l’autre lâchement du côté caudal (Figure 2C-2), ce qui est suffisant pour arrêter le flux sanguin mais suffisant pour s’ouvrir à nouveau plus tard. Placez une autre suture sous l’artère (Figure 2C-3).
  5. Coupez l’artère près de la figure 2C-1 avec des ciseaux à ressort et placez le tube 1.3 dans l’artère. Faites une attache lâche sur l’artère et la tubulure (Figure 2C-3, ne l’attachez pas fermement. Le tube sera inséré plus profondément dans l’artère). Ouvrez le nœud du côté caudal (figure 2C-2) pour insérer le tube jusqu’à ce que la marque de 9 mm atteigne le nœud du milieu (figure 2C-3). Attachez solidement toutes les ligatures et rincez avec une solution saline stérile héparinisée.
  6. Exposez la veine jugulaire droite à partir de la même incision que l’artère carotide droite pour le cathéter jugulaire. Isolez l’extrémité crânienne et ligaturez-la avec une suture en soie (Figure 2D-1, Tableau des matières). Placez un autre morceau de suture à l’extrémité caudale de la veine exposée (figure 2D-2). Coupez la veine près de la marque Figure 2D-1 avec des ciseaux à ressort.
  7. Insérez le cathéter (pas trop profondément pour éviter de pénétrer dans les vaisseaux), attachez-le et confirmez visuellement qu’il prélève du sang. Rincer avec une solution saline stérile héparinée (0,2 ml) et confirmer visuellement qu’il ne reste pas de sang dans le cathéter.
  8. Placez la souris sur le nouveau champ chirurgical stérile pour éviter l’infection de la première plaie. Retournez la souris, essuyez avec trois cycles de bétadine suivis d’une préparation préopératoire avec de l’alcool stérile et faites une petite incision entre les omoplates.
  9. Passez un porte-aiguille sous la peau de l’incision à l’arrière vers la face ventrale. Clampez les cathéters avec le porte-aiguille, passez-les sous la peau et ramenez-les. Nettoyez le site d’incision et fermez les incisions ventrales avec une suture synthétique (diamètre 0,15-0,2 mm). Clamper le cathéter veineux avec une micro serrefine au site d’incision entre les omoplates.
  10. Coupez le cathéter à 1 cm au-dessus de la pince, rincez-le avec une solution saline héparinisée et fermez-le avec un capuchon (étape 2.4). Suivez la même procédure pour le cathéter artériel. Fermez l’incision dorsale avec une suture synthétique (diamètre 0,15-0,2 mm).
  11. Placez la souris dans une cage chaude et propre (Figure 2E). Effectuez des soins postopératoires quotidiennement.

3. Récupération

  1. Isolez la souris parce qu’une autre souris peut mordre le cathéter dans le logement de groupe.
    1. Pour réduire le stress lié à l’isolement social, gardez les souris avec des enrichissements environnementaux (par exemple, des abris). Effectuez des soins postopératoires quotidiennement. Pour soulager la douleur, la détresse et l’inconfort, prodiguez des soins postopératoires, y compris une analgésie (ibuprofène dans l’eau potable (0,11 mg/mL).
    2. Observez les souris pour détecter des signes d’infection, tels que des pourritures, une léthargie ou une douleur au site d’incision. La plupart des souris en bonne santé commencent à marcher et à se nourrir environ 2 heures après la chirurgie. Une posture voûtée, une fourrure ébouriffée et une diminution de la consommation de nourriture peuvent indiquer une douleur. Si ces signes sont observés, euthanasier immédiatement les souris en les décapitant sous anesthésie profonde ou asphyxie au dioxyde de carbone.
  2. Le sang pénètre dans le cathéter de l’artère et forme un caillot. Pour maintenir les lignes du cathéter, retirez le caillot quotidiennement, en suivant les étapes 3 à 6.
  3. Remplir une seringue de 1 mL et une aiguille de 23 G (extrémité non pointue) avec une solution saline héparinisée (100 U/mL). À l’aide d’une chambre à induction, anesthésier légèrement la souris avec de l’isoflurane (1,0 % à 1,5 %). Ensuite, retirez la souris de la chambre et effectuez l’élimination du caillot sous anesthésie à l’isoflurane avec un capuchon nasal.
  4. Clamp le tube de l’artère sur le dos de la souris avec micro serrefine, retirer le capuchon et extraire le sang et les caillots. Rincer le cathéter avec une solution saline héparinisée à l’aide d’une autre seringue de 1 mL avec une aiguille de 23 G (extrémité non pointue) et le reboucher. Nettoyez la ligne veineuse comme la ligne artérielle en cas de coagulation sévère.
  5. Faites la même procédure pour nettoyer le cathéter une fois par jour pendant 3 à 5 jours.
  6. Vérifiez le poids corporel de la souris. Si le poids corporel diminue de plus de 10 % par rapport au jour de la chirurgie, appliquez des soins de soutien et essayez d’améliorer le score d’état corporel normal, et utilisez la souris pour une autre expérience.
    NOTE : La perte de poids des animaux était inférieure à 10 % dans les expériences de cette étude. La perte de poids affectera fortement le métabolisme systémique du glucose. Ainsi, il est recommandé d’attendre la récupération du poids corporel ou de retirer de l’expérience de la pince.

4. Installez le système de pompe (pour pince hypoglycémique)

  1. Préparez 1 U/mL d’insuline dans une solution saline à 0,1 % de BSA, 30 % de glucose dans une solution saline et une solution saline héparinisée.
  2. Mesurez le poids corporel de la souris. Calculer le volume d’insuline à 1 U/mL pour faire perfuser l’insuline (10 mU/kg/min). Perfuser 1,7 μL/min de solution d’insuline dans les souris de l’expérience clamp. Pour faire 300 μL de perfusion d’insuline, le volume requis pour 1 U/mL d’insuline (μL) est de 2,647 (μL/g) x poids corporel (g). Un volume de 300 μL de perfusion d’insuline suffit pour terminer l’expérience de pince sur 1 souris. Le tableau 1 montre un exemple de perfusion d’insuline.
  3. Remplissez la perfusion d’insuline et le glucose à 30 % dans chaque seringue Hamilton, connectez-les avec la tubulure 1.2 et placez la seringue sur le pousse-seringue (Figure 3A). Remplir chaque solution dans un tube 1.2. Remplir une solution saline dans un ensemble seringue et tubulure de 1 mL 1.4 (figure 2A).
  4. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane (1,0 % à 1,5 %) et connecter la tubulure1.2 au cathéter veineux et l’ensemble de tubulures1.4 au cathéter artériel (Figure 3A). Utilisez du ruban de cellophane pour maintenir les tubes ensemble.
  5. Placez la souris dans un bécher vide de 500 ml.
    REMARQUE : Pour une pince hyperglycémique, utilisez une solution saline au lieu de 1 U/mL d’insuline.

5. Pince hypoglycémique

  1. Mesurez la glycémie toutes les 5 à 10 minutes, comme le montre la figure 3B, et prélevez des échantillons de sang pour les mesures hormonales à -15 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 40 minutes, 60 minutes, 80 minutes, 100 minutes et 120 minutes. Suivez l’étape 5.2 pour mesurer la glycémie.
    REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de mesurer la glycémie à tout moment, mais il est recommandé de la mesurer au moins toutes les 10 minutes. Mesurez la glycémie toutes les 5 minutes lorsque son taux et son débit de perfusion de glucose ne sont pas stables.
  2. Clamp l’extrémité supérieure du jeu de tubulures1.4 et connectez une nouvelle seringue, extrayez 50 μL de sang et placez-le dans un tube de 1,5 mL pour le lavage. Mesurez la glycémie.
    REMARQUE : Il s’agit du sang dilué par la solution saline dans le tube en raison du lavage du cathéter après le prélèvement précédent. Un volume de 50 μL suffit pour remplacer le sang dilué par du sang pur.
  3. Conservez le sang dilué (globules rouges). Lavez le sang accumulé (~500 μL) avec une solution saline (voir les étapes 5.11-5.12) et retournez-le dans le corps pour éviter l’hypoxie.
  4. Le cathéter est connecté à l’artère avec une pression artérielle élevée, donc lorsque la pince est desserrée, le sang s’écoule et est utilisé pour mesurer le glucose avec un glucomètre pratique. Perfuser 50 μL de solution saline pour conserver une quantité suffisante de liquide sanguin.
  5. Pour le prélèvement sanguin, prélevez 50 μL de sang supplémentaire et placez-le dans un tube de 1,5 mL sur de la glace. Perfuser 100 μL (50 μL de remplacement + 50 μL d’échantillonnage) de solution saline.
  6. Après 0 min de mesure de la glycémie, démarrez la pompe à seringue à insuline. Perfuser d’abord 30 mU/kg/min en bolus pendant 2 min (5,1 μL/min), puis 10 mU/kg/min (1,7 μL/min) en perfusion pendant le reste de la durée.
  7. Mesurez la glycémie et modifiez le débit de perfusion de glucose toutes les 5 à 10 minutes pendant 120 minutes.
  8. Créez un état d’équilibre où le débit de perfusion de glucose ne change pas et où la glycémie est de 50 mg/dL.
  9. Après avoir prélevé l’échantillon de sang à t = 120 min, perfuser un agent euthanasique dans la veine jugulaire et prélever des tissus pour analyse de l’ARN ou des protéines.
  10. Centrifugez le sang à 1000 x g pendant 5 min et mesurez la concentration d’hormones telles que l’insuline ou le peptide c à l’aide d’un kit ELISA selon le protocole du fabricant.
  11. Pour laver le sang, centrifuger le sang à 1000 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant, ajouter 500 μL de solution saline héparinée et effectuer un pipetage.
  12. Répétez le lavage et placez les globules rouges lavés dans une seringue de 1 mL pour l’artère. Les cellules sanguines seront réinjectées automatiquement lorsque 50 ou 100 μL de solution saline sont perfusés aux étapes 5.2 et 5.3. Surveillez attentivement l’hématocrite pour prévenir l’hypoxie.
    REMARQUE : Pour la mesure de la glycémie, un glucomètre pratique commercial a été utilisé.

6. Pince hyperglycémique

  1. Suivez les étapes de la technique du clamp hypoglycémique, mais sans perfusion d’insuline et avec une glycémie ajustée à 250-300 mg/dL. Mesurez la glycémie toutes les 5 à 10 minutes, comme le montre la figure 3B, et prélevez des échantillons de sang pour les mesures hormonales à -15 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 40 minutes, 60 minutes, 80 minutes, 100 minutes et 120 minutes.
  2. Connectez une nouvelle seringue au jeu de tubulures1.4, extrayez 50 μL de sang et placez-la dans un tube de 1,5 mL pour le lavage.
  3. Pour le prélèvement sanguin, prélevez 50 μL de sang supplémentaire et placez-le dans un tube de 1,5 mL sur de la glace. Perfuser 100 μL (50 μL de remplacement + 50 μL d’échantillonnage) de solution saline.
  4. Après 0 min de mesure de la glycémie, démarrez le pousse-seringue à glucose. Perfusez d’abord 30 g/kg/min en bolus pendant 2 min (5,1 μL/min), puis 10 g/kg/min (1,7 μL/min) pendant le reste de la durée.
  5. Mesurez la glycémie et modifiez le débit de perfusion de glucose toutes les 5 à 10 minutes pendant 120 minutes. Créez un état stable où le débit de perfusion de glucose ne change pas et où la glycémie est de 250 à 300 mg/dL, un état hyperglycémique serré.

Résultats

L’étude sur l’hypoglycémie clamp a été réalisée chez des souris C57BL/6N mâles (âgées de 8 semaines, plus de 25 g p.c.) à jeun 3 h au début de l’expérience (figure 4A, B). La glycémie initiale était de 136 mg/dL (t = -15 min). S’il est inférieur à 90 mg/dL, cela peut être dû au fait que la chirurgie ne s’est pas bien déroulée, ou que le cathéter artériel a été inséré trop profondément, ou que des caillots sanguins ont pénétré dans le flux sanguin. L’état de la souris après la chirurgie affecte le métabolisme énergétique de la souris. Le métabolisme physiologique du glucose ne peut pas être mesuré dans de mauvaises conditions de santé. C57BL est plus sujet à la coagulation après la chirurgie ; Les souris qui ont un poids corporel plus élevé, comme les souris FVB ou ICR, sont moins susceptibles de perdre du poids en raison du lavage des caillots après la chirurgie. Ainsi, il est préférable pour les débutants d’utiliser des souris FVB pour pratiquer les procédures de clamp. Les souris C57BL nécessitent des soins plus intensifs. L’insertion d’un cathéter de 9 mm dans l’artère ne nous a posé aucun problème pour prélever du sang, même chez les souris FVB et ICR. L’insuline a commencé à t = 0 min et la glycémie a diminué (figure 4A). Le GIR n’avait pas été stable entre t = 0 min et t = 70 min. Par la suite, il est devenu stable après 80 minutes.

L’étude sur le clamp hyperglycémique a également été réalisée chez des souris C57BL/6N mâles (âgées de 8 semaines, plus de 25 g p.c.) à jeun de 3 h au début de l’expérience (figure 4C,D). Après avoir mesuré la glycémie et prélevé des échantillons de sang à t = -15 et t = -5 min, le glucose a été perfusé à partir de t = 0 min. La glycémie est passée à 250 mg/dL à t = 40 min. L’état d’équilibre s’est poursuivi de t = 30 min jusqu’à la fin.

figure-results-1
Figure 1 : Régulation de la glycémie. (A) Schéma conceptuel illustrant la régulation de la glycémie dans le corps. (B, C) Régulation du métabolisme du glucose dans (B) test de tolérance au glucose (GTT) et (C) test de tolérance à l’insuline (ITT). Plusieurs facteurs régulent la glycémie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Préparation des tubes et étapes de la chirurgie. (A) Images des tubes pour l’artère carotide et la veine jugulaire. Les numéros de tubulure correspondent aux numéros d’étape du protocole. (B) Méthode de préparation des tubes pour la chirurgie. (C, D) Les positions numérotées où les fils de soie sont ligaturés pour insérer le cathéter dans l’artère (C) et la veine (D). Positions des fils de soie dans le crâne (C-(1)) et la face caudale de l’artère (C-(2)), et un autre au milieu d’eux (C-(3)) (procédure 2-4). Positions des fils de soie dans le crâne (D-(1)) et le côté caudal de la veine (D-(2)), et un autre au milieu d’eux (D-(3)) (procédure 2-6). (E) Schéma des canules artérielles et veineuses sortant par l’arrière Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Réglage de la pince. (A) Schéma montrant la configuration des tubes, des pompes, des seringues et de la souris. (B) Feuille pour enregistrer les niveaux de glucose dans le sang et le débit de perfusion de glucose. 50 μL de sang sont prélevés à t = -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min et 120 min. Le débit de perfusion d’insuline était de 5,1 μL/min de t = 0 à 2 min et est passé à 1,7 à t = 2 min. La glycémie a été mesurée toutes les 10 minutes. La glycémie a été mesurée toutes les 5 minutes lorsque son taux n’était pas stable. Le débit de perfusion de glucose a été modifié chaque fois que la glycémie a été mesurée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Résultats représentatifs du clamp hypoglycémique et du clamp hyperglycémique. (A) Taux de glucose dans le sang et (B) débit de perfusion du clamp hypoglycémique. (C) Glycémie et (D) Taux de perfusion de glucose du clamp hyperglycémique. Les données représentent la moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

SolutionCalculPour souris de 20 g
1 U/mL d’insuline(2,647 x poids corporel) μL52,9 μL
0,1 % de solution saline BSA300 μL - volume d’insuline (μL)247,1 μL

Tableau 1 : Exemple de calcul pour la préparation de la perfusion d’insuline.

Discussion

La méthode décrite ici est simple et peut être réalisée avec des pointes de pipette, des seringues et d’autres articles trouvés dans les laboratoires ordinaires. Bien que les chercheurs puissent avoir besoin d’acheter des tubes et des pompes supplémentaires, aucun équipement coûteux n’est nécessaire. Ainsi, ce protocole de cathétérisme et de clampage est plus facile à démarrer par rapport aux rapports précédents 12,13,14.

La technique de la pince a été développée vers 1970 et a été utilisée chez la souris et l’homme15. C’est une méthode utile pour mesurer avec précision le métabolisme du glucose et on dit qu’il s’agit de l’étalon-or. Cependant, ce n’est pas une technique courante utilisée par de nombreux chercheurs. La technique de clamp hyperinsulinémique-euglycémique a été rapportée chez les souris13 et les rats14, mais la méthode de cathétérisme ici est différente, et les lecteurs peuvent choisir la plus facile pour leurs expériences. L’un des objectifs de cet article est de réduire l’obstacle au démarrage d’une expérience. Par conséquent, nous avons fourni des informations détaillées sur les matériaux des cathéters faits à la main, les procédures chirurgicales et un exemple de parcours expérimental. Ceux-ci sont instructifs pour le chercheur qui tente d’effectuer une pince dans la première fois.

La sécrétion d’insuline dans l’obésité et le diabète dépend du stade. De nombreux rapports suggèrent que la sécrétion d’insuline est augmentée dans l’obésité pour réduire la glycémie dans l’état de résistance à l’insuline16, mais la fonction des cellules β sera endommagée dans le diabète de type 217,18. En fait, le nombre et la surface des îlots pancréatiques et de la sécrétion d’insuline ont été signalés comme étant augmentés dans des modèles de souris obèses, telles que les souris nourries avec un régime riche en graisses19 ou les souris déficientes en leptine20. Dans ces modèles murins, qui ont un phénotype évident, les différences peuvent être déterminées en examinant les niveaux d’insuline dans le sang 15 à 30 minutes après l’administration de glucose dans le GTT. Cependant, dans certains cas, il n’est pas facile de déterminer les différences de sécrétion d’insuline. Par exemple, si les souris transgéniques (Tg) ont un taux de glycémie de 500 mg/dL alors qu’une souris WT a 300 mg/dL et que les deux souris ont le même taux d’insuline dans le sang, peut-on dire que la sécrétion d’insuline diminue en Tg ? Dans ce cas, nous ne pouvons pas comparer la capacité de sécrétion d’insuline à moins que la glycémie ne soit la même en utilisant la méthode présentée ici. C’est l’une des raisons pour lesquelles il n’existe aucune théorie établie sur le moment où la fonction des cellules β commence à se détériorer lors de la transition de l’obésité au diabète. Nous pouvons également mesurer la sécrétion d’insuline par culture primaire du pancréas21 ou ex vivo22. Cependant, cela ruinera l’effet du système nerveux central sur la libération d’insuline car l’innervation du nerf vague sera supprimée. La sécrétion d’insuline post-absorption est bien connue, mais le cerveau et le système nerveux autonome régulent également la libération d’insuline23. L’expérience d’analyse de ce dernier doit être réalisée dans un prélèvement sanguin non anesthésié, sans retenue et indolore. C’est aussi pourquoi le nerf vague doit être séparé de l’artère carotide à l’étape 2.3.

Il a été rapporté que le diabète sucré provoque une hyperglycémie due à la résistance à l’insuline et à l’augmentation des sécrétions de glucagon24 et d’autres hormones contre-régulatrices25. De plus, des épisodes répétés d’hypoglycémie chez les humains diabétiques dus à des échecs de dosage d’insuline ou à d’autres causes peuvent entraîner une affection appelée hypoglycémie récurrente, dans laquelle les patients sont sujets à l’hypoglycémie26. Il a été suggéré que le taux de baisse de la glycémie dans le clamp hypoglycémique affecte la détection périphérique ou centrale de l’hypoglycémie27. L’hypoglycémie à évolution lente peut être appropriée pour étudier le rôle des capteurs de glucose dans les veines portales-mésentériques, tandis qu’une diminution très rapide de la glycémie peut être appropriée pour l’étude des capteurs de glucose dans le cerveau27. 1 U/mL d’insuline est utilisée chez les souris maigres C57BL. Mais, une concentration d’insuline plus élevée sera nécessaire chez les souris obèses car elles ont une résistance à l’insuline, et 1 U/mL n’est pas suffisant pour diminuer la glycémie.

Dans le modèle à un compartiment du pool de glucose sanguin (Figure 1A), la quantité de glucose absorbée peut affecter le taux d’apport de glucose14. Ainsi, le taux de production de glucose, l’un des principaux objectifs de la mesure du clamp hyperinsulinémique-euglycémique, peut être affecté par la durée du jeûne. Cependant, un long temps de jeûne peut augmenter la libération d’hormones contre-régulatrices. Par conséquent, les chercheurs fixent le temps de jeûne en fonction de leur objectif d’analyse. Une autre méthode de clamp comprend un prélèvement sanguin de la queue, ce qui est simple car seule une canule intraveineuse doit être insérée14. Cependant, le sang est prélevé dans une contention, ce qui provoque une quantité modérée de stress de contention et une augmentation des catécholamines plasmatiques et d’autres hormones de stress14. De plus, il est préférable de mesurer les concentrations d’hormones dans le flux sanguin au centre du corps plutôt que dans le sang aux extrémités. Par conséquent, le prélèvement sanguin dans les artères chez les souris en mouvement libre est le meilleur pour mesurer physiologiquement le métabolisme du glucose. Les souris ne bougent pas et le pivotement n’est pas nécessaire lorsqu’elles sont acclimatées à l’environnement expérimental. Cependant, il est recommandé d’utiliser un pivot pour éviter d’emmêler les lignes de perfusion et d’échantillonnage. Les tubes 1.2 et 1.4 (Figure 3A) ne sont pas bons pour l’utilisation d’un pivot. Le système devrait être amélioré si le chercheur doit utiliser un pivot. La réinjection de cellules sanguines n’influence pas l’état d’équilibre établi de la glycémie et de l’insuline. La présente méthode peut également être appliquée aux études métabolomiques utilisant des isotopes. Par exemple, si le 13C-glucose est perfusé en continu dans la veine, le taux de renouvellement métabolique systémique et les métabolites intermédiaires intracellulaires peuvent être mesurés28. Il s’agit donc d’une méthode utile pour analyser le métabolisme du glucose.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Leading Initiative for Excellent Young Researchers (du MEXT) ; une subvention pour la recherche scientifique (B) (numéro de subvention JP21H02352) ; Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED-RPIME, numéro de subvention JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901) ; la Fondation commémorative d’Uehara ; Fondation Astellas pour la recherche sur les troubles métaboliques ; Fondation commémorative Suzuken, Fondation des sciences de la vie Akiyama et Fondation de recherche en neurosciences de Narishige. Nous remercions également Nur Farehan Asgar, Ph.D, pour avoir édité une ébauche de ce manuscrit.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Colle adhésiveHenkel AG & Co. KGaALOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)Morinaga Institute of Bilogical Science IncM1304Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA (insuline)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation633-03411LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (type U)
Lecteur de glycémie maniableNipro Co.11-777Insuline Free Style Freedom Lite
(100U/ml)Eli Lilly & Co.428021014Humulin R (100U/ml)
SourisJapon SLC Inc.C57BL / 6NCrSlcC57BL
SutureNatsume seisakushoC-23S-560 No.2Systèmes
de pompe àseringueNE-1000
Suture synthétiqueVÖ ; Tube MELHR-171
AS ONE Corporation9-869-01Tube en silicone LABORAN(R)
2Fisher Scientific427400Tube BD Intramedic PE3
IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.size5Tube en polyéthylène size5
stérilisée Inc.

Références

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R gulation de la glyc miesensibilit l insuliner ponses contre r gulatricesperfusion de glucosecath ter de la veine jugulairecath ter de l art re carotidem tabolisme du glucose
Pince hyperglycémique et pince hypoglycémique chez la souris consciente
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