Production et optimisation de LTE, un système d’expression de protéines acellulaires dérivé de Leishmania tarentolae pour la production de protéines recombinantes

Résumé

L’extrait translationnel de Leishmania (LTE) est un système d’expression de protéines eucaryotes libres dérivé du parasite unicellulaire, Leishmania tarentolae. Ce protocole optimisé rend la fabrication du LTE simple et rentable. Il convient à diverses applications axées sur l’expression multiparallèle et l’étude de protéines eucaryotes complexes et de leurs interactions.

Résumé

Ce protocole décrit la production et l’optimisation d’un système d’expression de protéines acellulaires (CFPS) eucaryote dérivé du flagellé unicellulaire Leishmania tarentolae, appelé extrait translationnel de Leishmania ou LTE. Bien que cet organisme ait évolué à l’origine comme parasite des geckos, il peut être cultivé facilement et à moindre coût dans des flacons ou des bioréacteurs. Contrairement à Leishmania major, il n’est pas pathogène pour l’homme et ne nécessite pas de précautions particulières en laboratoire. Un autre avantage de l’utilisation de Leishmania pour le CFPS est que l’ajout d’un seul oligonucléotide antisens au CFPS, ciblant une séquence leader d’épissage conservée à l’extrémité 5' de tous les ARN codant pour des protéines, peut supprimer l’expression des protéines endogènes. Nous fournissons des procédures pour la rupture cellulaire et le traitement des lysats, qui ont été simplifiées et améliorées par rapport aux versions précédentes. Ces procédures commencent par de simples cultures en flacons. De plus, nous expliquons comment introduire de l’information génétique à l’aide de vecteurs contenant des sites d’initiation de traduction indépendants de l’espèce (SITS) et comment effectuer une optimisation simple des lots et un contrôle de la qualité pour assurer une qualité d’expression protéique constante.

Introduction

Dans les années 1960, les systèmes d’expression des protéines acellulaires ont joué un rôle central dans la découverte du code génétique¹. Cependant, les systèmes d’expression de protéines procaryotes libres de cellules, principalement basés sur E. coli, dominent actuellement les applications de laboratoire et commerciales. Bien que les systèmes à base d’E. coli offrent des avantages tels que la rentabilité, l’évolutivité et des rendements d’expression élevés, ils sont confrontés à des défis lorsqu’ils produisent des protéines multidomaines dans leurs formes actives et facilitent l’assemblage de complexes protéiques ^2,3. De nos jours, les formes couramment utilisées de synthèse eucaryote des protéines libres (CFPS) comprennent l’extrait de germe de blé (WGE), le lysat de réticulocytes de lapin (RRL) et le lysat de cellules d’insectes (ICL)^4,5,6. Ce travail introduit un système alternatif eucaryote sans cellules, à la fois simple et évolutif, basé sur le parasite flagellé unicellulaire Leishmania tarentolae.

Leishmania tarentolae peut être cultivé facilement dans des flacons à l’aide de milieux rentables et peut également être mis à l’échelle dans des bioréacteurs pour obtenir une densité cellulaire plus élevée. La présence d’ARNm endogènes dans le lysat cellulaire, qui pourraient autrement entrer en compétition avec les messages introduits, peut être neutralisée à l’aide d’oligonucléotides antisens ciblant la séquence⁷ de l’épissage de l’ARNm conservée de Leishmania. Contrairement à son proche parent Leishmania major, qui provoque des maladies humaines, L. tarentolae infecte le gecko maure (Tarentolae mauritanica), ce qui le rend apte à la culture dans des environnements de laboratoire PC2 sans qu’il soit nécessaire de prendre des précautions particulières. Il a déjà été utilisé comme organisme transgénique pour l’expression in vivo des protéines⁸.

Pour faciliter l’amorçage de matrice dans les systèmes acellulaires, des séquences universelles ont été conçues sur la base de structures d’ARN polymériques qui améliorent l’initiation de la traduction⁹. Ces séquences de traduction indépendantes de l’espèce (SITS) sont applicables aux systèmes acellulaires procaryotes et eucaryotes et conviennent à l’introduction d’informations génétiques dans LTE. Bien que ce protocole ne fournisse pas d’explication détaillée de la construction vectorielle pour l’expression de protéines acellulaires LTE, l’optimisation et le contrôle de la qualité nécessitent des vecteurs appropriés contenant des fusions de fluorophores des protéines d’intérêt souhaitées en aval du site SITS. À cette fin, des vecteurs LTE appropriés ont été déposés dans le référentiel de gènes Addgene, tels que le vecteur pCellFree_G03, qui code une fusion eGFP N-terminale vers la protéine d’intérêt souhaitée à l’aide de sites de clonage Gateway.

La LTE a prouvé sa valeur dans un large éventail d’applications nécessitant l’expression de protéines, notamment l’analyse de l’auto-assemblage des protéines^10,16, la production de protéines membranaires intégrales humaines¹⁷, la recherche sur des candidats médicaments antiviraux¹⁸, le développement d’enzymes utiles sur le plan biotechnologique¹⁹, le prototypage de biocapteurs de protéines^20,21 et l’étude de produits biologiques à partir d’ankylostomes²². La LTE a également joué un rôle déterminant dans la cartographie des réseaux d’interaction protéine-protéine dans les domaines de la virologie et des structures cellulaires^21,32. La LTE a été évaluée pour fonctionner de manière similaire à celle d’autres systèmes acellulaires eucaryotes dans l’expression de protéines complètes, monodispersées et non agrégées³³, tout en offrant une production plus rentable et évolutive.

Ce protocole fournit des techniques pour cultiver et perturber l’organisme hôte, préparer le lysat et compléter une solution d’alimentation (FS) pour l’expression couplée des protéines de transcription/traduction. De plus, il comprend un protocole d’optimisation des lots de production. Dans la version initiale du système acellulaire Leishmania, des variations indésirables d’un lot à l’autre ont été observées dans les niveaux d’expression, la fraction de protéines pleine longueur et la présence d’agrégats de protéines, conduisant à l’élimination des lots³⁴. Des améliorations ultérieures au protocole ont été apportées pour résoudre ce problème²⁵. Le protocole actuel s’appuie sur ces améliorations, permettant d’optimiser les lots individuels pour l’expression et la taille maximales des protéines. Il y parvient en contrôlant étroitement la charge des perturbateurs cellulaires (mesurée par la densité optique à 600 nm ; OD_{600 nm}) et la normalisation de la sortie de lysat résultante à l’aide de l’absorbance à 280 nm (Abs_{280 nm}). De plus, il intègre une méthode permettant de compléter partiellement le lysat avec du rNTP et du magnésium pendant la fabrication, avec optimisation ultérieure de ces composants de la solution d’alimentation lors des expressions de test. Bien que cette optimisation soit présentée comme une option dans le protocole, elle est fortement recommandée par les auteurs.

Protocole

Ce protocole comprend des recettes et des étapes détaillées qui impliquent la culture, la centrifugation, la mesure de la fluorescence GFP à l’aide d’un lecteur de plaques multimode, la mesure de la DO de culture_{600 nm} et l’évaluation du lysat Abs_{280 nm}. Il couvre également la configuration et l’imagerie des gels protéiques SDS-PAGE. Les matériaux requis ou suggérés pour ce protocole sont répertoriés dans la feuille de calcul des matériaux. Il est important de noter que les ressources de laboratoire typiques telles que les composants de milieux, les centrifugeuses, les tubes, les spectrophotomètres et les configurations d’électrophorèse sur gel peuvent probablement être utilisées de manière interchangeable, sauf indication contraire. La figure 1 fournit un résumé du processus de fabrication LTE.

Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole de fabrication LTE. Cette caricature fournit un résumé concis du protocole de fabrication LTE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Croissance des cultures de Leishmania tarentolae

1. Préparez au moins 3 L de milieu de croissance TBGG (Bactotryptone 12 g/L, extrait de levure 24 g/L, glycérol 8 mL/L, glucose 1 g/L, KH₂PO₄ 2,3 g/L, K₂HPO₄ 2,5 g/L, voir le tableau des matières). Stérilisez le média à l’aide d’un filtre de 0,22 μm sous vide ou dans une configuration similaire.
2. Conservez le milieu à température ambiante (RT), avec les derniers ajouts (Hemin, antibiotiques) ajoutés juste avant l’inoculation avec L. tarentolae. L’héminine (0,25 % v/v dans 50 % de triéthanolamine) est ajoutée à 0,2 % v/v, la pénicilline (10 000 unités/mL) et la streptomycine (10 000 μg/mL) sont mélangées à 0,5 % v/v.
   REMARQUE : Le point de départ de ce protocole est une culture maintenue de 2 x 10 mL de L. tarentolae de type sauvage. Les cultures d’entretien sont cultivées à 27 °C dans des flacons de culture tissulaire standard de 50 mL avec une faible agitation (75 tr/min). De telles cultures de 10 ml peuvent être maintenues indéfiniment avec ~1/20 dilutions dans des stériles (TBGG + hémine, pénicilline, streptomycine) tous les 2-3 jours. Il est recommandé d’installer une enceinte de biosécurité standard dans un laboratoire PC2. cependant, les contaminations bactériennes ont tendance à être évitées par les antibiotiques ajoutés, tandis que les contaminations fongiques sont généralement éliminées par L. tarentolae.
3. Pendant deux jours, augmenter les cultures d’entretien de L. tarentolae à 200 mL (jour 1), puis à 2 L (jour 2) par dilutions de 1:10 avec un volume croissant de TBGG + hémine/antibiotiques chaque jour. Effectuer les deux dilutions dans des flacons en verre de 5 L stérilisés à l’autoclave (remplis jusqu’à un maximum de 1 L). La deuxième dilution doit avoir lieu dans l’après-midi entre 15 et 18 heures, avec l’intention de commencer la production de lysat le lendemain entre 8 et 11 heures.
   REMARQUE : Ce protocole utilise le volume de départ minimum pour la production LTE (2 cultures de 1 L). Il est également possible d’étendre la culture jusqu’à 10 L pour la production LTE en incorporant une étape d’expansion supplémentaire (p. ex., jour 1 : 100 ml ; Jour 2 : 1 L ; Jour 3 : 10 L). Bien que ce protocole utilise des flacons à chicanes (voir le tableau des matériaux) pour cultiver L. tarentolae, en option, des bioréacteurs conventionnels conçus pour la croissance bactérienne avec des roues Rushton peuvent être utilisés, à condition que la vitesse d’agitation soit maintenue en dessous de 100 tr/min. L’amélioration de l’aération et du contrôle du pH dans les bioréacteurs prolonge généralement la croissance en phase logarithmique des cultures de L. tarentolae , ce qui permet d’utiliser une DO de récolte plus élevée de_{600 nm} de 10 à l’étape 1.4.
4. Enregistrer la DO_600nm de la culture en triple exemplaire via une dilution 1:10 dans du TBGG directement dans la cuvette du spectrophotomètre. Une plage de départ appropriée pour la fabrication du lysat est de_{600 nm} OD = 4,0-8,0.
5. Fournir un temps d’incubation supplémentaire si OD_600nm < 4.0. Une culture avec OD_600nm > 8 est utilisable et entraînera un plus grand volume de lysat d’expression acellulaire, mais avec une qualité inférieure en raison du début de la phase de croissance logarithmique. Placez les flacons de culture sur de la glace, en attendant les étapes suivantes.
   REMARQUE : La mesure précise de la DO de culture finale de_{600 nm} est essentielle, car elle est utilisée pour calculer le volume final des cellules concentrées avant la perturbation. Ce calcul remplace une méthode de pesage des granulés utilisée dans les versions antérieures de la fabrication LTE pour calibrer la concentration des cellules avant la perturbation³⁴, afin de simplifier le protocole. Assurez-vous de diluer dans du TBGG pour une mesure de_{600 nm} de diamètre, sinon le choc osmotique modifie la forme de la cellule, provoquant une erreur de mesure. La pipette mélange la dilution 1:10 pour la mesure de_{600 nm} OD (directement dans la cuvette) quelques secondes avant de prendre la lecture spectrophotométrique, car les cellules de L. tarentolae se déposent rapidement avec un aspect trouble distinctif. Si le volume final de l’expression culture est considéré comme approximatif, il est également recommandé de peser les flacons à la récolte (avec une tare de flacon vide appropriée) pour obtenir une meilleure estimation du volume (à 1 g = 1 mL). La DO maximale de_{600 nm} possible à partir de la croissance de L. tarentolae dans des flacons déflecteurs est de 15 à 20, bien que cela soit inapproprié pour la fabrication de lysat en raison de l’atteinte de la phase stationnaire.

2. Concentration des cultures de L. tarentolae

1. Les cellules de Leishmania doivent être lavées et concentrées environ 60 fois avant d’être perturbées. Calculez le volume cible pour la concentration cellulaire sur la base de_{DO 600 nm} = 300 pour le concentré final. L’équation est V = volume de récolte (mL) x (DO de récolte_{600 nm}/300). Par exemple, en utilisant une culture de 2 L avec une DO de_{récolte de 600} = 5, le volume cible est de 33 mL.
   REMARQUE : L’objectif OD_600nm de 300 peut être modifié ; la production LTE précédente a utilisé des valeurs comprises entre 150 et 350. Des concentrations plus élevées de cellules en rupture auront tendance à produire des réactions finales d’expression acellulaire avec des rendements en protéines plus élevés, mais avec une tendance accrue pour les protéines vulnérables à s’agréger. OD_{600 nm} = 300 représente une cible par défaut appropriée pour la production LTE.
2. Transférez les cultures récoltées dans des flacons centrifuges appropriés et faites-les tourner à 2500 x g pendant 10 min à 4 °C. Décanter soigneusement le surnageant dans les déchets de culture.
   REMARQUE : Il est important de minimiser la perte de cellules dans le surnageant mis au rebut, car cela affecte le calcul de la charge de perturbation. Dans les protocoles de production LTE précédents, la concentration de cellules de L. tarentolae pour la rupture a été calibrée en faisant tourner le concentré de cellules dans un tube de microcentrifugation d’essai et en mesurant le poids de la pastille par rapport au poids total³⁴. Ce protocole simplifié utilise plutôt une cible théorique de_{600 nm} de DO pour le concentré, basée sur la DO de récolte mesurée de_{600 nm}, et suppose une faible perte de cellules pendant la concentration et le lavage des cellules.
3. Laver la pastille cellulaire dans un tampon SEB (45 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM de saccharose, 100 mM de KOAc, 3 mM de Mg(_OAc)2, maintenue sur glace) trois fois, en centrifugeant à chaque fois à 2500 x g pendant 10 min à 4 °C. Pour le premier lavage, remettre en suspension chaque 1 L de culture en granulés dans 100 mL de tampon SEB, puis les combiner dans une seule fiole de centrifugation. Pour le deuxième lavage, utilisez également 100 mL de SEB pour 1 L de la culture originale.
   REMARQUE : Pour la remise en suspension finale des granulés, ajoutez un tampon SEB à 50 % du volume de remise en suspension cible final (étape 2.1). Cela permet d’alimenter soigneusement le concentré mélangé jusqu’au volume cible final exactement à l’étape 2.4. Chaque remise en suspension doit être aussi douce que possible pour éviter la lyse prématurée de L. tarentolae, par exemple, en faisant doucement tourner le SEB ajouté autour du granulé décanté ou en pipetant le SEB sur le granulé adhérant à la paroi du tube de centrifugation. Il peut être plus pratique de transférer les surnageants dans des tubes à centrifuger plus petits pour l’étape finale.
4. Versez le concentré remis en suspension dans un cylindre volumétrique en verre lavé approprié, puis complétez le volume jusqu’au volume cible (étape 2.1) à l’aide d’un SEB froid supplémentaire et mélangez délicatement.

3. Lyse du concentré de L. tarentolae

1. Transférez le concentré de cellules dans le dispositif de cavitation d’azote (voir tableau des matériaux) pré-refroidi à 4 °C, pressurisez-le à 70 bars d’azote et incubez pendant 45 min sur de la glace.
   REMARQUE : Bien que les perturbateurs de cavitation d’azote ne soient pas des articles de laboratoire courants, ils sont recommandés pour la production LTE. Des méthodes alternatives telles que la congélation-décongélation cellulaire et les perturbateurs de type presse française ont été essayées ; Cependant, l’activité d’expression des protéines était de <50 % par rapport à l’utilisation de la méthode de cavitation à l’azote. Le dispositif de cavitation à l’azote doit être soigneusement nettoyé avant utilisation et entre les passages, comme tous les récipients réutilisés qui entrent en contact avec le lysat cellulaire à partir de cette étape (comme le ballon récepteur). Un régime de nettoyage approprié implique un lavage avec des détergents de laboratoire suivi d’un rinçage abondant à l’eau déminéralisée.
2. Ouvrez l’évent du dispositif de cavitation d’azote et expulsez le lysat obtenu dans un récipient suffisamment robuste, tel qu’un ballon récepteur à vide sur de la glace. Inclinez le ballon récepteur pour vous assurer que tout le lysat résultant se dépose et peut être pipeté dans un tube à centrifuger frais ou un récipient similaire.
   ATTENTION : Les perturbateurs de cavitation d’azote reposent sur la transition abrupte du concentré de la cellule de 70 bars d’azote à la pression ambiante, obtenue grâce à un fort écoulement d’abord de liquide puis d’azote à travers la soupape de sortie de l’appareil. La ventilation doit se faire à l’aide d’un équipement de protection individuelle (EPI) approprié dans une cagoule de sécurité chimique. Il y a un risque de briser le récipient de destination et de perdre le lysat, c’est pourquoi nous utilisons un récepteur à vide robuste au lieu d’une fiole générique. Si la soupape de sortie de l’appareil est un tube, évitez de placer le tube directement à l’intérieur du récepteur pour éviter une accumulation excessive de pression au point de ventilation.

4. Centrifugation du lysat cellulaire

1. Transférez le lysat dans des tubes à centrifuger appropriés à force g et centrifugez à 10 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Retirez le surnageant dans des tubes à centrifuger frais et similaires.
2. Centrifugez le lysat à 30 000 x g pendant 15 min à 4 °C, puis retirez le surnageant final dans un tube de centrifugation frais ou un récipient similaire placé sur de la glace. Estimez le volume total.

5. Filtration sur gel du lysat cellulaire

REMARQUE : La filtration sur gel est utilisée pour éliminer le saccharose inclus dans le tampon SEB. Alors que le saccharose aide à stabiliser la machinerie cellulaire lors de la perturbation cellulaire, il diminue le rendement s’il est conservé dans les réactions d’expression des protéines.

1. Installez un nombre suffisant de colonnes de filtration sur gel alimentées par gravité-10 (voir le tableau des matériaux) dans un format de rack qui leur permet de s’égoutter dans un bac de collecte ou un récipient similaire situé en dessous, en s’assurant qu’elles peuvent filtrer tout le volume de lysat à 2,5 ml par colonne. Prééquilibrez les colonnes en y faisant passer au préalable 10 mL de tampon EB à 4 °C (45 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(_OAc)2).
   REMARQUE : Toutes les étapes à partir de ce point bénéficient d’être effectuées dans une chambre froide à 4 °C. Cependant, il convient également de conserver tous les lysats et réactifs sur un bac à glaçons de paillasse. Une exception est l’étape de filtration sur gel, dans laquelle les auteurs placent un rack de colonnes à l’intérieur d’un réfrigérateur à 4 °C pendant le rebuffering. Dans les versions originales de ce protocole, les nouvelles colonnes de filtration sur gel étaient « bloquées » en tamponnant initialement le lysat et en éliminant la première sortie. Bien que cela ne soit pas considéré comme nécessaire, les colonnes doivent être rincées avec un tampon EB et stockées à 4 °C entre les lots de lysat. Le premier lysat de sortie peut avoir une activité d’expression protéique plus faible que les sorties suivantes en raison d’une certaine rétention de fond des composants du lysat sur la nouvelle colonne.
2. Ajoutez 2,5 ml de lysat dans chaque colonne et attendez qu’il passe dans la colonne. Ajouter 0,5 mL supplémentaire d’EB pour déposer le lysat dans la colonne tout en jetant l’éluat.
3. Elutez le lysat filtré sur gel en ajoutant 2,5 ml supplémentaires d’EB dans chaque colonne, en recueillant la sortie en plaçant un plateau frais et propre ou un autre récipient sous les colonnes.

6. Supplémentation en lysat cellulaire

1. Utilisez le spectrophotomètre nanodrop (voir Tableau des matériaux) pour mesurer l’Abs_280nm du lysat filtré sur gel. S’il dépasse 60, diluez-le pour atteindre Abs_280nm = 60 en utilisant un tampon EB supplémentaire de 4 °C.
   REMARQUE : Alors que le contrôle de l’entrée de densité cellulaire dans la perturbation à l’aide de_{l’OD 600 nm} détermine approximativement l’intensité de sortie du lysat, la normalisation de l’Abs_{280 nm} après la perturbation et le traitement du lysat améliore encore la cohérence des performances du lysat. Le Lysate Abs_280nm peut être ajusté à la hausse et à la baisse, avec des conséquences sur le rendement et l’agrégation de l’expression des protéines (voir la section Discussion). Si le lysat non supplémenté indique un Abs_{de 280 nm} < 60, il peut être nécessaire d’inclure plus de biomasse de Leishmania dans l’étape de perturbation, c’est-à-dire d’augmenter la charge de perturbateur cellulaire à_{600 nm} > 300 à l’étape 2.1.
2. Ajoutez 5 fois la solution d’alimentation (5 x FS, tableau 1) au lysat dans un rapport de 2:5 et mélangez soigneusement au vortex. Mettez-le dans des contenants appropriés (p. ex., des tubes de microfuge de 1,5 ml) et congelez-le dans de l’azote liquide. Si l’on suit les étapes facultatives 7.1 à 7.3 pour l’optimisation de l’expression LTE ci-dessous, utilisez la rNTP.Mg réduite de 5x FS du Tableau 1 au lieu de la valeur par défaut de 5x FS. Inclure 5 aliquotes de 100 μL pour la congélation à utiliser dans les expériences d’optimisation.
   REMARQUE : La congélation avec la valeur par défaut de 5x PE dans un rapport de 2:5 crée une LDE complétée prête à l’expression, utilisée à une expression de 7 μL/10 μL (par conséquent, la 5x PE devient 1x PE dans la réaction finale). Cependant, les auteurs recommandent de suivre les étapes facultatives supplémentaires où la quantité par défaut de rNTP et de magnésium est fournie dans le FS 5x. S’ensuit une étape d’optimisation au cours de laquelle un mélange équimolaire des deux (appelé rNTP.Mg) est ajouté pour compléter les réactions de test à une valeur optimisée. Le FS 5x partiel contient également un oligonucléotide qui arrête l’expression endogène de l’ARNm (voir la section Introduction). La séquence de l’oligonucléotide est CAATAAAGTACAGAAACTGATACTTATATAGCGTT.

7. CQ et optimisation du LTE complété final

REMARQUE : Les étapes minimales nécessaires pour déterminer l’ajout « complémentaire » approprié de rNTP.Mg au rNTP réduit et au lysat supplémenté en magnésium impliquent l’expression de l’eGFP ou d’un fluorophore similaire (par exemple, sfGFP) sans partenaire de fusion. Des concentrations croissantes de rNTP.Mg sont ajoutées aux réactions pour déterminer le point auquel le niveau d’expression (mesuré en RFU eGFP via un lecteur de plaques multimode) est optimisé. Les terminaisons prématurées de l’eGFP, qui ne sont pas fluorescentes, deviennent évidentes en diminuant les RFU eGFP à des concentrations de rNTP.Mg trop élevées. Cependant, les dysfonctionnements du produit court de LTE se produisent plus fréquemment dans les protéines exprimées plus grandes (>50 kDa). Par conséquent, il est possible d’effectuer cette optimisation en utilisant un modèle plus grand que l’eGFP, en particulier s’il est disponible dans un vecteur d’expression approprié, fournissant une fusion de fluorophores que l’on souhaite produire par LTE pour une application ou une étude particulière (voir la section Résultats représentatifs).

1. Décongeler une aliquote de 100 μL et mettre en place six réactions d’expression de 10 μL, chacune composée de 7 μL de lysat partiellement supplémenté à l’étape 6.2, de 1 μL de solution d’appoint conformément au tableau 2 et de 2 μL d’eau ultrapure contenant suffisamment de matrice de contrôle de l’ADN pour atteindre une concentration finale de 50 ng/μL dans la réaction.
2. Incuber les réactions pendant 2 h à 25 °C et surveiller l’augmentation de la fluorescence GFP à l’aide d’un lecteur de plaques multimode.
   REMARQUE : Les valeurs de configuration appropriées pour la GFP sont l’excitation à 485 nm (bande passante 5 nm), l’émission à 516 nm (bande passante 5 nm), avec un intervalle de lecture de 1 min pendant 2 h.
3. Classez les valeurs d’expression finales pour déterminer la concentration rNTP.Mg correspondant à l’UFR eGFP la plus élevée. Si des données cinétiques sont disponibles, un excès de rNTP.Mg sera également indiqué par une augmentation biphasique de la RFU eGFP pendant la période d’expression de 2 h (voir la section Résultats représentatifs).
4. Une fois que la concentration rNTP.Mg d’appoint optimisée est déterminée, ajoutez-la à toutes les expressions protéiques ultérieures en utilisant le lot de LTE qui a été partiellement complété dans les étapes précédentes.
   REMARQUE : Si l’aliquote à l’étape 6.2 est effectuée avec soin avec des volumes fixes, l’appoint peut être ajouté rétrospectivement à chaque aliquote sans décongélation, par exemple, avec les aliquotes placées sur de la glace sèche. Ces aliquotes sont maintenant entièrement complétées, car le bon complément de rNTP.Mg sera mélangé à chacune d’elles lorsqu’elles seront décongelées et mélangées pour être utilisées.

Résultats

Le but de l’expression des protéines acellulaires est de produire des protéines de pleine longueur sous une forme active repliée adaptée à un large éventail d’applications. L’extrait de LTE (Leishmania tarentolae ) a déjà été comparé à d’autres systèmes d’expression acellulaire procaryotes et eucaryotes, démontrant une grande capacité à éviter la troncature et l’agrégation lorsqu’il fonctionne de manière optimale, en particulier par rapport à l’expression acellulaire basée sur E. coli ³³. Cependant, cela s’accompagnait auparavant d’une variation significative de la qualité de sortie d’un lot à l’autre. La méthode actuelle intègre d’autres améliorations pour garantir une qualité de sortie constante, principalement par une supplémentation partielle de la solution d’alimentation nécessaire avant la congélation initiale du LTE dans les aliquotes. S’ensuit l’optimisation de la rNTP.Mg d’entrée transcriptionnelle dans une solution d’appoint qui peut être ajoutée à chaque réaction ultérieure ou utilisée pour compléter directement les aliquotes congelées. Il convient de noter que les réactions d’optimisation représentent également une utilisation typique de la LTE pour exprimer concrètement les protéines, avec des réactions effectuées à 25 °C pendant 2 h.

Les données issues de l’optimisation de la concentration de rNTP.Mg dans les réactions acellulaires fournissent un ensemble de données représentatif. Les niveaux d’expression augmentent généralement à mesure que l’entrée transcriptionnelle (rNTP.Mg) augmente, ce qui indique une expression réussie. Cependant, un seuil est atteint où le système tend vers l’expression non productive de produits tronqués, en particulier dans le cas de protéines plus grandes (>50 kDa). Cette expression sous-optimale entraîne une perte du signal de fluorescence avec l’augmentation de la rNTP.Mg, particulièrement évidente avec les fusions de fluorophores C-terminaux, où la traduction du polypeptide n’atteint pas le fluorophore lui-même. Pour les fusions N-terminales, bien qu’une réduction des RFU (unités de fluorescence relatives) globales ne se produise pas nécessairement avec un excès de rNTP.Mg, l’échec de l’expression est visiblement apparent sur les gels SDS-PAGE sous la forme de plusieurs produits fluorescents de tailles décroissantes. Cette approche tire parti de la capacité de la GFP (Green Fluorescent Protein) à maintenir la fluorescence même lorsqu’elle est visualisée sur un gel SDS-PAGE conventionnel, à condition que les échantillons ne soient pas chauffés après le mélange. Au lieu de cela, ils sont mélangés avec un tampon de chargement de gel et chargés directement sur le gel. Bien que les matériaux et les équipements en gel SDS-PAGE soient généralement interchangeables, l’imageur sur gel doit être capable de visualiser la fluorescence GFP. Une configuration typique pour la visualisation GFP est fournie avec une excitation à 485 nm (bande passante 5 nm), une émission à 516 nm (bande passante 5 nm) et un intervalle de lecture de 1 min sur 2 h.

Il est possible d’optimiser le système en utilisant uniquement l’expression d’eGFP. Les figures 2A, B (encadré) représentent les sorties d’expression typiques des réactions d’optimisation pour deux lots LTE, avec une RFU eGFP augmentant avec l’augmentation des concentrations de rNTP.Mg, atteignant un niveau optimal de +0,6x rNTP.Mg (Figure 2A) et +0,3x rNTP.Mg (Figure 2B) pour une RFU maximale. La solution d’alimentation rNTP réduite comprend 0,6 fois rNTP.Mg, ce qui permet d’obtenir des niveaux de rNTP.Mg totaux de 1,2 fois et 0,9 fois la quantité par défaut pour ces lots LTE. La figure 2C illustre la cinétique de l’augmentation de la RFU pendant la réaction pour le lot LTE de la figure 2B, démontrant une réaction biphasique avec deux phases discrètes sur la durée de la réaction.

Figure 2 : Optimisation de l’ajout de rNTP.Mg complément dans LTE avec rNTP réduit 5x FS. (A) Niveaux d’expression de l’eGFP après 140 min d’expression à partir d’un plasmide témoin à différents niveaux de complément rNTP.Mg dans la réaction d’expression acellulaire (n = 3, moyenne ± SD tracée). (B) Optimisation d’un autre lot de production LTE, montrant une expression réduite au-delà d’un certain seuil rNTP.Mg. (C) Cinétique d’accumulation de l’eGFP dans les mêmes réactions que (B), avec augmentation de rNTP.Mg l’appoint. Ces données représentent également la cinétique typique de l’accumulation de protéines dans l’expression de lots LTE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cependant, il convient de noter que l’eGFP, étant une petite protéine (27 kDa) facile à replier, est susceptible d’être exprimée, repliée et mûrie quel que soit le système d’expression acellulaire utilisé. La défaillance du système est plus probable lors de l’expression de protéines d’intérêt plus grandes, les produits tronqués devenant plus apparents à des tailles de protéines d’entrée supérieures à 70 kDa³³. Par conséquent, l’optimisation du système avec la ou les protéines destinées à une utilisation réelle est supérieure, avec l’eGFP toujours présente pour la quantification mais sous la forme d’une fusion N-terminale avec la protéine d’intérêt.

La figure 3 représente une optimisation typique du niveau d’appoint rNTP.Mg lors de l’utilisation d’un modèle protéique plus grand enclin à livrer des produits tronqués (eGFP-Sox18). En utilisant un format SDS-PAGE de gel semi-natif (c’est-à-dire sans chauffer les échantillons), il est possible de visualiser l’échec progressif de l’expression. L’ajout optimal de rNTP.Mg à +0,1x (combiné à la rNTP.Mg 0,6x dans la solution d’alimentation partielle, totalisant 0,7x) réduit clairement la fraction de la bande protéique pleine longueur dans le cadre des produits d’expression fluorescente totale, ce qui signifie une défaillance du système avec un excès de rNTP.Mg addition.

Comme mentionné dans le protocole, il est possible de sauter l’étape d’optimisation rNTP.Mg et d’ajouter directement la quantité totale de rNTP.Mg dans la solution d’alimentation « par défaut » lors de la supplémentation immédiatement après la filtration sur gel à l’étape 6.2. Ce faisant, le protocole revient essentiellement aux méthodes publiées d’origine pour créer LTE³⁴. Cependant, les auteurs estiment que l’adaptation du système pour des performances optimales, comme le démontre la figure 3 (voie D à voie E), l’emporte sur la complexité supplémentaire du protocole et augmente la valeur de LTE en tant qu’outil d’expression protéique.

Figure 3 : Effet de l’augmentation de l’augmentation de la supplémentation en rNTP.Mg sur l’expression d’eGFP-Sox18 dans le LTE partiellement supplémenté. Gel semi-natif SDS-PAGE illustrant l’impact de l’augmentation de la recharge rNTP.Mg sur l’expression d’eGFP-Sox18. Couloir A : +0,1x (rNTP.Mg) recharge, couloir B : +0,2x (rNTP.Mg), couloir C : +0,3x (rNTP.Mg), couloir D : +0,4x (rNTP.Mg). La fusion N-terminale eGFP est visualisée par balayage de fluorescence du gel. La bande principale de la voie A représente l’eGFP-Sox18 sur toute la longueur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Composant	Concentration des stocks	Solution d’alimentation 5x	μL de stock/mL 5x Solution d’alimentation
		Par défaut (rNTP réduit)	Par défaut (rNTP réduit)
Spermidine	100 millions d’euros	1,25 million d’euros	12
La TNT	500 mM	10 millions d’euros	20
Créatine phosphate	1000 mM	200 millions d’euros	200
HEPES-KOH pH7.6	2500 millions de mètres cubes	100 millions d’euros	40
PEG3000	0,5 v/v	0,05 V/V	100
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	120 fois	5 fois	43
Acides aminés	3,6 mM (ch)	0,68 mM (ch)	190
ATP	100 millions d’euros	8,5 (5,1) millions d’euros	85 (51)
GTP	100 millions d’euros	3,2 (1,9) millions d’euros	32 (19)
UTP	100 millions d’euros	2,5 (1,5) millions d’euros	25 (15)
CTP	100 millions d’euros	2,5 (1,5) millions d’euros	25 (15)
Mg(OAc)2	1 Mois	16,7 (10) millions d’euros	16,7 (10)
Oligo leader anti-épissure	1 million d’euros	0,05 million d’euros	50
ARN polymérase T7	5 mg/mL	0,5 mg/mL	100
Créatine phosphokinase	5 unités/μL	0,2 unités/μL	42
Eau ultra-pure			19 (93)

Tableau 1 : Composition de la solution d’alimentation 5x (5x FS) pour LTE. 1 mL de 5x FS est nécessaire pour chaque 2,5 mL de lysat non supplémenté après filtration sur gel. L’ajout de la fonction FS 5x par défaut crée un LTE prêt à l’expression pour une utilisation dans les réactions d’expression à un rapport de 7 μL/10 μL. La recette à rNTP.Mg réduite (quantités en italique) est recommandée pour l’optimisation de l’expression LTE et contient 0,6 fois les niveaux par défaut de rNTP et de magnésium. Ceux-ci peuvent être ajustés à des niveaux variables (0,6 à 1,1 fois) dans l’expérience d’optimisation ultérieure à l’aide des ajouts décrits dans le tableau 2.

Recharge rNTP	ATP (100 mM)	GTP (100 mM)	UTP (100 mM)	CTP (100 mM)	MgOAc (1 M)	Eau ultra-pure
(1 μL/10 μL rxn)	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL
+0x	0	0	0	0	0	200
+0,1x	3.4	1.3	1	1	0.7	193
+0,2x	6.8	2.5	2	2	1.3	185
+0,3x	10.2	3.8	3	3	2	178
+0,4x	13.6	5.1	4	4	2.7	171
+0,5x	17	6.4	5	5	3.3	163

Tableau 2 : Composition des (rNTP.Mg) solutions de recharge pour l’optimisation LTE. Ces solutions sont utilisées pour optimiser la LTE en ajoutant 1 μL de solution d’appoint par 10 μL de réaction d’expression protéique. Une fois qu’un niveau d’appoint est déterminé dans l’expérience d’optimisation, il peut être ajouté de manière cohérente à toutes les réactions d’expression protéique ultérieures en utilisant les mêmes aliquotes de lot LTE. Alternativement, il peut être ajouté directement aux aliquotes elles-mêmes à raison de 1 μL d’addition par 7 μL (sans décongélation). Après décongélation et mélange, ces lysats sont utilisés à 8 μL LTE par 10 μL d’expression protéique, ce qui permet de maintenir le niveau de remplissage rNTP.Mg établi lors de l’optimisation.

Discussion

Des protocoles de création de LTE ont été publiés au cours de la dernière décennie⁷ et ont fait l’objet de mises à jour périodiques^25,34. Cependant, les nouveaux venus dans la technique rencontrent souvent une courbe d’apprentissage abrupte, ce qui entraîne des retards dans l’obtention d’une expression protéique de haute qualité et à haut rendement. Des défis similaires ont été signalés par d’autres groupes de recherche travaillant avec LTE³⁵, en particulier en ce qui concerne les variations importantes d’un lot à l’autre. Le format de protocole basé sur la vidéo peut potentiellement fournir des connaissances de configuration supplémentaires et moins évidentes qui profitent aux utilisateurs potentiels³⁴. Des modifications ont été apportées au protocole, dans le but d’augmenter les chances de succès, de simplifier la procédure, de réduire le temps et de minimiser les erreurs liées à la complexité.

Dans le cas de la perturbation cellulaire, un contrôle précis du chargement des cellules dans le perturbateur de cellule de cavitation d’azote est crucial³⁴. Il peut être difficile d’y parvenir en raison de la densité cellulaire élevée après la concentration et le lavage des cellules. Dans les protocoles originaux, diverses méthodes ont été utilisées, telles que la rotation d’un petit volume de la culture concentrée finale et la quantification de la pastille de cellules fractionnées. Toutefois, dans ce protocole, une approche plus simple est adoptée. Le volume de récolte de la culture et la DO_{de 600 nm} sont mesurés, et ces mesures sont utilisées pour calculer un volume cible pour le concentré de cellules en millilitres, visant une DO finale souhaitée de_{600 nm} de 300. Ce calcul suppose qu’il n’y a pas de perte significative de cellules pendant le lavage. S’il y a suspicion de perte de cellule, une autre méthode impliquant des dilutions en série triplées de 1/10 des cellules concentrées après le lavage est utilisée, ce qui aboutit finalement à une dilution de 1/1000. Cela permet de mesurer la DO réelle de_{600 nm} du concentré, en s’assurant qu’il atteint la DO cible_{600 nm} = 300 avant de le charger dans le disrupteur.

Même avec un contrôle minutieux de la charge en perturbateurs cellulaires, une variabilité significative de la teneur en protéines du lysat post-perturbation peut se produire, comme l’indique l’Abs_280nm du lysat³⁴ non supplémenté filtré sur gel. Par conséquent, une mesure d’Abs_280nm avant l’introduction de la supplémentation en lysat est introduite, et le lysat est dilué pour obtenir un Abs_280nm = 60. Étant donné que les réactions d’expression des protéines incluent finalement un lysat de 0,5 v/v, il en résulte un lysat de réaction standardisé avec Abs_280nm = 30. Les performances du lysat configurées avec une expression inférieure à Abs_{280 nm} = 30 ont tendance à produire des réactions de longue durée et à faible expression, tandis que les valeurs supérieures à Abs_{280 nm} = 30 ont tendance à produire une expression plus élevée mais une tendance accrue à l’agrégation des protéines de sortie.

L’optimisation des performances du lysat consiste à ajuster les entrées transcriptionnelles dans la solution d’alimentation qui complète le lysat, en particulier les rNTP et le magnésium, dans les étapes de réaction facultatives 7.0-7.3. Il est important de noter que les rNTP et le magnésium ont des rôles complexes et multiples dans un système couplé de transcription-traduction comme LTE²⁵. Cependant, il a été démontré que LTE a un optimum d’expression du magnésium approximatif à rNTP (mM) + 1,5. Comme le lysat lui-même contribue à hauteur de 1,5 mM Mg au mélange réactionnel final, il s’agit d’un moyen simple de varier et d’optimiser l’entrée rNTP sans co-optimiser le Mg en faisant varier les rNTP.Mg équimolaires.

Les performances du lysat présentent des variations significatives lors de l’augmentation de la rNTP.Mg, l’expression des protéines augmentant généralement jusqu’à un seuil où l’optimisation s’inverse, entraînant des dysfonctionnements d’expression sous la forme de produits courts au lieu de protéines de pleine longueur²⁵. Par conséquent, l’optimisation finale du système pour identifier ce seuil est bénéfique. Le protocole LTE original utilisait une recette de solution d’alimentation fixe, avec une optimisation du Mg suggérée³⁴. Cette approche a ensuite été modifiée avec une optimisation rNTP plus étendue. Cependant, cette méthode nécessitait une congélation instantanée du lysat sous forme non supplémentée pour permettre l’optimisation sur une aliquote, ce qui avait tendance à diminuer les niveaux d’expression du lysat. Cette réduction a été attribuée à la perte des propriétés cryoprotectrices de la solution d’alimentation lors de la congélation instantanée du lysat non supplémenté immédiatement après l’étape de filtration sur gel. Le protocole actuel établit un équilibre en complétant avec une solution d’alimentation contenant du rNTP.Mg réduit avant la congélation, qui peut être complétée au niveau optimisé au point d’expression.

Ces améliorations de protocole devraient accroître l’utilité du système LTE pour les utilisateurs novices en atténuant les principales sources de variation et en améliorant la cohérence de la production d’expression des protéines.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
-10 SuperDex 25 Colonnes	Cytiva	17085101	Colonnes de filtration Gel
Nitrogen Cavitation Perturbateur cellulaire	Parr Industries	4635 ou 4639	Perturbateur cellulaire
Hemin	Sigma-Aldrich	H5533	Additif de culture
Pénicilline/Streptomycine 10000U/ml	Thermo-Fisher	15140122	Mélange
d’antibiotiquesOptiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	Plaque multipuits pour les expressions 10ul
Synthèse		IDT d’oligonucléotides	; Oligo avec séquence CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT
Créatine Phosphokinase	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Enzyme
Tecan Spark	Tecan		ou similaire Lecteur de plaques multimode
Chemidoc MP Imager	Biorad		ou similaire Gel SDS-PAGE Imager
4-12 % Bis-Tris Gels	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE gels
Biophotomètre	Eppendorf		ou similaire Cuvette Specrophotomètre
Nanodrop One	Thermofisher		Spectrophotomètre Nanodrop
Centrifugeuse Avanti JXN-26	Beckman Coulter		ou centrifugeuse similaire, avec rotors/tubes de 10K et 50K g
Microcentrifugeuse 5424R Microcentrifugeuse	Eppendorf		ou similaire, avec tubes
de microcentrifugation de 1,5 mlIncubateur à flacons Inova S44i	Eppendorf		ou similaire Agitateur d’incubateur à flacons adapté aux flacons de 5L
Flacons			Flacons en verre à chicanes pour la croissance de la culture
Bactotryptone	BD	211705	Milieu de croissance
Extrait de levure	Merck	VM930053	Milieu de croissance
Glycérol			N’importe quelle qualité analytique
Glucose			N’importe quelle qualité analytique
KH2PO4			Toute qualité analytique
K2HPO4			Toute qualité analytique
Eau UltraPure	Invitrogen	10977-015	Ou sortie de n’importe quel distributeur d’eau de type MilliQ