Procédé d’immobilisation verticale pour analyse de microscopie accélérée dans des cyanobactéries filamenteuses

Summary

Nous présentons une méthode simple et accessible pour la visualisation filamenteuse des cyanobactéries dans le plan XY. Une matrice d’agarose à bas point de fusion a été utilisée, permettant l’acquisition d’images des protéines impliquées dans la division, dans une orientation verticale. Par conséquent, cette méthodologie peut être appliquée à n’importe quel organisme filamenteux et à différents types de protéines.

Abstract

Un événement principal dans la division cellulaire bactérienne est le processus de septation, où la protéine FtsZ est l’élément clé. FtsZ polymérise en formant une structure en forme d’anneau (anneau Z) au milieu de la cellule qui sert d’échafaudage pour d’autres protéines de division. La microscopie à super-résolution dans les modèles bactériens Escherichia coli et Bacillus subtilis a montré que l’anneau Z est discontinu, tandis que les études d’imagerie sur cellules vivantes ont démontré que FtsZ se déplace le long de l’anneau par un mécanisme connu sous le nom de tapis roulant. Pour étudier la dynamique de FtsZ in vivo, un placement spécial de la cellule en position verticale est nécessaire pour imager la structure complète de l’anneau dans le plan XY. Dans le cas de l’imagerie FtsZ chez les cyanobactéries multicellulaires, telles que Anabaena sp. PCC7120, le maintien des filaments en position verticale est difficile en raison de la taille des cellules et de la longueur des filaments. Dans cet article, nous décrivons une méthode qui permet l’immobilisation verticale des filaments Anabaena sp. PCC 7120 à l’aide d’agarose à bas point de fusion et de seringues, pour enregistrer l’anneau Z dans un mutant qui exprime une protéine de fusion FtsZ-sfGFP. Cette méthode est un moyen rapide et peu coûteux d’enregistrer la dynamique des protéines au site de division en utilisant la microscopie confocale.

Introduction

La division cellulaire bactérienne est le processus par lequel une cellule mère génère deux cellules filles, dans la plupart des cas par le mécanisme connu sous le nom de fission binaire. L’un des premiers événements dans le processus de septation est la localisation de FtsZ au milieu de la cellule¹. Cette protéine, structurellement homologue à la tubuline², est conservée et largement distribuée dans la plupart des bactéries, et sa polymérisation génère une structure contractile connue sous le nom d’anneau Z³. Cet anneau sert d’échafaudage pour d’autres protéines de division et ensemble, elles forment une machinerie moléculaire appelée divisome. Plusieurs études ont montré que l’anneau Z est très dynamique et que les protofilaments FtsZ se déplacent en roulant ^4,5,6. Pour étudier l’anneau Z dans des expériences time-lapse, il est conseillé d’enregistrer le site de division dans le plan XY pour une meilleure résolution et un échantillonnage rapide. Pour ce faire, il est nécessaire de développer des méthodes d’immobilisation cellulaire verticale qui incluent généralement la nanofabrication de pièges cellulaires à microtrous et de dispositifs microfluidiques complexes⁷.

Les cyanobactéries sont des micro-organismes photosynthétiques classés à Gram négatif par leur morphologie cellulaire. Cependant, phylogénétiquement ils sont plus proches des bactéries gram-positives⁸. Ces organismes ont des gènes de division cellulaire qui sont communs chez les bactéries gram-positives et gram-négatives, mais leur divisome contient également des éléments uniques⁹. Anabaena sp. PCC 7120 (ci-après Anabaena sp.) est une cyanobactérie filamenteuse à un plan de division et est un modèle pour l’étude de la division cellulaire chez les cyanobactéries multicellulaires. Dans cette souche, il a été possible de déterminer le positionnement de FtsZ au milieu des cellules¹⁰. Néanmoins, il n’y a pas d’études montrant la dynamique in vivo de FtsZ dans ce modèle. Dans notre laboratoire, grâce à l’accouplement triparental et à la recombinaison homologue, nous avons obtenu un mutant totalement séparé d’Anabaena sp. qui exprime la protéine FtsZ fusionnée au sfGFP, qui a remplacé le gène ftsZ endogène complet. Nous avons développé une méthode d’immobilisation cellulaire rapide et simple qui favorise l’orientation verticale des filaments de souche mutants pour des expériences en accéléré afin de visualiser les protéines de division dans les cyanobactéries filamenteuses. Cette méthode ne nécessite pas de dispositifs microfluidiques qui peuvent être coûteux et difficiles à développer. À titre d’exemple, nous avons utilisé ce protocole pour visualiser l’anneau Z dans le mutant FtsZ-sfGFP par microscopie confocale.

Protocol

1. Considérations et choix du modèle cellulaire

REMARQUE: Les cyanobactéries ont une forte autofluorescence due à la présence de pigments photosynthétiques. Ce signal est dans la partie rouge du spectre, par conséquent, les protéines fluorescentes adaptées à l’imagerie dans les cyanobactéries sont celles qui sont loin de l’émission rouge. Par exemple, GFP, YFP, Vénus, Turquoise et BFP.

1. Sélectionnez un composant divisome présent dans la souche de cyanobactérie filamenteuse cible. Pour les expériences, il est nécessaire de construire un mutant cyanobactérien filamenteux qui exprime le composant divisome sélectionné fusionné à une protéine fluorescente. Dans ce protocole, un mutant Anabaena sp. qui exprime FstZ-sfGFP, à titre d’exemple. Cette souche a été obtenue par accouplement triparental avec E. coli¹¹.
2. Vérifiez le niveau de ségrégation du mutant qui sera utilisé. Dans l’exemple, la ségrégation a été déterminée par amplification par PCR du gène cible. Le mutant FtsZ-sfGFP utilisé dans ce protocole est une souche entièrement séparée dépourvue du gène ftsZ de type sauvage.

2. Conditions de croissance

1. Faire une nouvelle sous-culture du mutant en utilisant une culture de 10 mL en phase stationnaire (cultivée pendant environ 14 jours en lumière constante, à 25°C, pour Anabaena sp.) et en ajoutant à 90 mL de milieu BG11 complété par des antibiotiques (Spectinomycine et Streptomycine 10 μl ml-1 pour le mutant FtsZ-sfGFP).
2. Cultivez la nouvelle culture cellulaire en lumière constante et à la température optimale jusqu’à atteindre la phase exponentielle. Le mutant FtsZ-sfGFP d’Anabaena sp. est cultivé à 25 °C pendant 7 jours avant la préparation de l’échantillon.

3. Préparation de l’échantillon dans une matrice d’agarose

1. Prendre 2 mL de la culture de croissance homogénéisée.
2. Centrifuger à 2 500 x g pendant 10 min à température ambiante.
3. Entre-temps, dans une fiole de 50 mL, chauffer 30 mL de point de fusion bas à 3 % agarose dans un milieu liquide BG11. Utilisez un four à micro-ondes réglé à puissance moyenne et vérifiez la solution toutes les 15 s jusqu’à dissolution complète. Laisser refroidir à 37 °C.
   NOTE: Autoclaver la solution d’agarose pour éviter la contamination.
4. Une fois la centrifugation terminée, jeter 1,9 mL du surnageant et remettre en suspension les cellules dans le volume restant en pipetant au moins trois fois de haut en bas.
5. Mélanger les cellules remises en suspension avec 900 μL de solution d’agarose à 3 % en pipitant de haut en bas au moins trois fois.
   REMARQUE: La solution d’agarose doit être liquide mais pas trop chaude pour éviter d’endommager les cellules. L’étape suivante doit être effectuée rapidement et avant que la solution d’agarose ne forme un gel comme consistance =.
6. Aspirez soigneusement la matrice d’agarose dans une seringue de 1 mL. Il est important d’éviter la génération de bulles pendant que l’échantillon est aspiré avec la seringue.
   REMARQUE: Avant cette étape, assurez-vous que l’embout de la seringue est coupé pour éliminer le trou d’entrée étroit.
7. Laisser le mélange échantillon-agarose se solidifier en plaçant la seringue en position horizontale à température ambiante pendant 2 h.
8. Retirez soigneusement la matrice d’agarose à l’aide du piston et placez-la sur une surface propre et plane.
9. Couper l’échantillon solidifié en tranches, dans une gamme d’épaisseur de 0,5 à 1 mm, en maintenant l’intégrité de la matrice.
   REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, coupez la matrice d’agarose à l’aide d’un scalpel ou de fines lames de rasoir.
10. Placez les tranches côte à côte sur une lamelle de couverture. Le nombre de disques sur une feuille de couverture dépend de ses dimensions.
    REMARQUE: Pour la microscopie accélérée, il est recommandé d’utiliser une chambre cellulaire conçue pour l’analyse microscopique (par exemple, chambres magnétiques Attofluor ou Chamlide). Ces chambres permettent l’acquisition de l’échantillon en évitant la déshydratation. Dans cet exemple, les échantillons sont préparés sur des lamelles arrondies (25 mm) à l’aide de la chambre Attofluor.
11. Ajouter 2 mL de solution d’agarose fondue à 3 % sur l’échantillon placé dans la chambre pour prévenir la déshydratation.
12. Attendez que la solution d’agarose soit complètement solidifiée pour former un gel.

4. Acquisition d’images

1. Normaliser les paramètres pour visualiser la protéine fluorescente d’intérêt dans la souche mutante au microscope confocal. Assurez-vous que le microscope peut détecter à la fois l’autofluorescence et le marqueur fluorescent sélectionné.
2. Visualisez l’échantillon dans la conformation en champ clair avec un grossissement maximal et recherchez un filament orienté verticalement comme illustré à la figure 1.
3. Trouvez le site de division d’intérêt avec un balayage initial en utilisant le signal d’autofluorescence le long du plan Z.
4. Utilisez les paramètres du marqueur protéique fluorescent pour visualiser le signal de la protéine d’intérêt au site de division.
5. Réaliser des expériences time-lapse selon le modèle biologique et la protéine d’intérêt. Par exemple, dans ce cas, des expériences en accéléré de 10 s en 50 s ont été réalisées pour enregistrer la dynamique de FtsZ le long de l’anneau Z chez Anabaena sp. (Figure 2).

Results

Visualisation de l’anneau Z chez Anabaena sp. par la méthode d’immobilisation verticale
Pour étudier la dynamique des composants de l’anneau Z chez les bactéries, il est nécessaire d’acquérir des images dans des cellules orientées verticalement. Dans cette position, il est possible de visualiser l’anneau Z et les principales protéines du divisome pour surveiller la dynamique des protéines par microscopie time-lapse. La préparation classique d’échantillons pour les bactéries ne fonctionne pas ...

Discussion

L’étude de la dynamique des protéines divisomiques est sans aucun doute un défi. En particulier, chez les cyanobactéries filamenteuses, l’un des défis est la visualisation de l’anneau Z dans le plan horizontal, pour lequel les cellules doivent être orientées verticalement. La méthode que nous avons décrite ici permet le positionnement de l’anneau Z dans le plan XY pour effectuer les différentes analyses. C’est la première méthode simple pour les cyanobactéries filamenteuses qui permet la visualisation complète de l’annea...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringue de 1 ml	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	La seringue jetable en plastique médical avec aiguille de 1 ml généralement utilisée pour pomper du liquide ou du liquide d’injection, dans cette expérience elle est utilisée pour aspirer l’échantillon et le faire polymériser.
Chambre cellulaire Attofluor	ThermoFischer Scientific	A7816	La caméra cellulaire Attofluor est un support de lamelle durable et pratique conçu pour visualiser des échantillons de cellules vivantes dans des microscopes droits ou inversés.
Thermocycleur Axygen MaxyGene II avec bloc de 96 puits	CORNING	THERM-1001	Le nouveau thermocycleur MaxyGene II a augmenté la vitesse et les fonctionnalités avancées, offrant les performances haut de gamme que vous attendez des produits de la marque Axygen. Une programmation unique et flexible. Temps de fonctionnement rapide. Flux de travail amélioré par rapport aux cycleurs de gradient traditionnels. Taux de montée en puissance jusqu’à 5° ; C/sec. Le couvercle chauffant réglable peut accueillir des bandes, des tubes et des microplaques.
Fisherbrand Lunettes de protection : Cercles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Fabriqué en verre borosilicate optique de la meilleure qualité, avec une épaisseur et une taille uniformes. Forme circulaire. Résistant à la corrosion.  ;
L’agarose à bas point de fusion	Promega	V3841	, à bas point de fusion, de qualité analytique, est idéale pour les applications qui nécessitent la récupération de fragments d’ADN intacts après électrophorèse sur gel.
Microscope LSM 880 de Zeiss Airyscan	Zeiss	-	Le microscope Zeiss Airyscan LSM 880 est un microscope focal à balayage laser qui peut acquérir des images en dessous de la limite de résolution (résolution latérale ~ 120 nm et résolution axiale ~ 350 nm). Les détecteurs sont très sensibles, ce qui permet d’acquérir des images en super-résolution à grande vitesse.
Microcentrí ; fuga Fresco 17	ThermoFischer	Scientific 75002402	Accélérez les processus de préparation d’échantillons de routine jusqu’à 17 000 fois g grâce à notre microcentrifugeuse standard, disponible avec réfrigération. Ces microcentrifugeuses offrent productivité, polyvalence, sécurité et commodité dans un instrument de laboratoire compact et facile à utiliser.
Microscope timelapse Nikon	Nikon-Le		microscope confocal à balayage laser Nikon C2 est un microscope idéal pour le timelapse à long terme, car grâce à sa chambre d’incubation, il est possible de conserver les échantillons dans des conditions optimales pendant plus de 8 heures.
Lames de rasoir fines Schick Super Chromium	Farmazon	SKU : 401146	; Les lames fines du rasoir sont utilisées pour couper la matrice d’agarose, ce qui nous permet d’obtenir les disques avec l’échantillon tout en maintenant l’intégrité de la matrice.