Procédé d’immobilisation verticale pour analyse de microscopie accélérée dans des cyanobactéries filamenteuses

Summary

Nous présentons une méthode simple et accessible pour la visualisation filamenteuse des cyanobactéries dans le plan XY. Une matrice d’agarose à bas point de fusion a été utilisée, permettant l’acquisition d’images des protéines impliquées dans la division, dans une orientation verticale. Par conséquent, cette méthodologie peut être appliquée à n’importe quel organisme filamenteux et à différents types de protéines.

Abstract

Un événement principal dans la division cellulaire bactérienne est le processus de septation, où la protéine FtsZ est l’élément clé. FtsZ polymérise en formant une structure en forme d’anneau (anneau Z) au milieu de la cellule qui sert d’échafaudage pour d’autres protéines de division. La microscopie à super-résolution dans les modèles bactériens Escherichia coli et Bacillus subtilis a montré que l’anneau Z est discontinu, tandis que les études d’imagerie sur cellules vivantes ont démontré que FtsZ se déplace le long de l’anneau par un mécanisme connu sous le nom de tapis roulant. Pour étudier la dynamique de FtsZ in vivo, un placement spécial de la cellule en position verticale est nécessaire pour imager la structure complète de l’anneau dans le plan XY. Dans le cas de l’imagerie FtsZ chez les cyanobactéries multicellulaires, telles que Anabaena sp. PCC7120, le maintien des filaments en position verticale est difficile en raison de la taille des cellules et de la longueur des filaments. Dans cet article, nous décrivons une méthode qui permet l’immobilisation verticale des filaments Anabaena sp. PCC 7120 à l’aide d’agarose à bas point de fusion et de seringues, pour enregistrer l’anneau Z dans un mutant qui exprime une protéine de fusion FtsZ-sfGFP. Cette méthode est un moyen rapide et peu coûteux d’enregistrer la dynamique des protéines au site de division en utilisant la microscopie confocale.

Introduction

La division cellulaire bactérienne est le processus par lequel une cellule mère génère deux cellules filles, dans la plupart des cas par le mécanisme connu sous le nom de fission binaire. L’un des premiers événements dans le processus de septation est la localisation de FtsZ au milieu de la cellule¹. Cette protéine, structurellement homologue à la tubuline², est conservée et largement distribuée dans la plupart des bactéries, et sa polymérisation génère une structure contractile connue sous le nom d’anneau Z³. Cet anneau sert d’échafaudage pour d’autres protéines de division et ensemble, elles for....

Protocol

1. Considérations et choix du modèle cellulaire

REMARQUE: Les cyanobactéries ont une forte autofluorescence due à la présence de pigments photosynthétiques. Ce signal est dans la partie rouge du spectre, par conséquent, les protéines fluorescentes adaptées à l’imagerie dans les cyanobactéries sont celles qui sont loin de l’émission rouge. Par exemple, GFP, YFP, Vénus, Turquoise et BFP.

1. Sélectionnez un composant divisome présent dans la souche de cyanobactérie filamenteuse cible. Pour les expériences, il est nécessaire de construire un mutant cyanobactérien filamenteux qui exprime le composant divisome sélectionné ....

Results

Visualisation de l’anneau Z chez Anabaena sp. par la méthode d’immobilisation verticale
Pour étudier la dynamique des composants de l’anneau Z chez les bactéries, il est nécessaire d’acquérir des images dans des cellules orientées verticalement. Dans cette position, il est possible de visualiser l’anneau Z et les principales protéines du divisome pour surveiller la dynamique des protéines par microscopie time-lapse. La préparation classique d’échantillons pour les bactéries ne fonctionne pas .......

Discussion

L’étude de la dynamique des protéines divisomiques est sans aucun doute un défi. En particulier, chez les cyanobactéries filamenteuses, l’un des défis est la visualisation de l’anneau Z dans le plan horizontal, pour lequel les cellules doivent être orientées verticalement. La méthode que nous avons décrite ici permet le positionnement de l’anneau Z dans le plan XY pour effectuer les différentes analyses. C’est la première méthode simple pour les cyanobactéries filamenteuses qui permet la visualisation complète de l’annea.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringue de 1 ml	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	La seringue jetable en plastique médical avec aiguille de 1 ml généralement utilisée pour pomper du liquide ou du liquide d’injection, dans cette expérience elle est utilisée pour aspirer l’échantillon et le faire polymériser.
Chambre cellulaire Attofluor	ThermoFischer Scientific	A7816	La caméra cellulaire Attofluor est un support de lamelle durable et pratique conçu pour visualiser des échantillons de cellules vivantes dans des microscopes droits ou inversés.
Thermocycleur Axygen MaxyGene II avec bloc de 96 puits	CORNING	THERM-1001	Le nouveau thermocycleur MaxyGene II a augmenté la vitesse et les fonctionnalités avancées, offrant les performances haut de gamme que vous attendez des produits de la marque Axygen. Une programmation unique et flexible. Temps de fonctionnement rapide. Flux de travail amélioré par rapport aux cycleurs de gradient traditionnels. Taux de montée en puissance jusqu’à 5° ; C/sec. Le couvercle chauffant réglable peut accueillir des bandes, des tubes et des microplaques.
Fisherbrand Lunettes de protection : Cercles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Fabriqué en verre borosilicate optique de la meilleure qualité, avec une épaisseur et une taille uniformes. Forme circulaire. Résistant à la corrosion.  ;
L’agarose à bas point de fusion	Promega	V3841	, à bas point de fusion, de qualité analytique, est idéale pour les applications qui nécessitent la récupération de fragments d’ADN intacts après électrophorèse sur gel.
Microscope LSM 880 de Zeiss Airyscan	Zeiss	-	Le microscope Zeiss Airyscan LSM 880 est un microscope focal à balayage laser qui peut acquérir des images en dessous de la limite de résolution (résolution latérale ~ 120 nm et résolution axiale ~ 350 nm). Les détecteurs sont très sensibles, ce qui permet d’acquérir des images en super-résolution à grande vitesse.
Microcentrí ; fuga Fresco 17	ThermoFischer	Scientific 75002402	Accélérez les processus de préparation d’échantillons de routine jusqu’à 17 000 fois g grâce à notre microcentrifugeuse standard, disponible avec réfrigération. Ces microcentrifugeuses offrent productivité, polyvalence, sécurité et commodité dans un instrument de laboratoire compact et facile à utiliser.
Microscope timelapse Nikon	Nikon-Le		microscope confocal à balayage laser Nikon C2 est un microscope idéal pour le timelapse à long terme, car grâce à sa chambre d’incubation, il est possible de conserver les échantillons dans des conditions optimales pendant plus de 8 heures.
Lames de rasoir fines Schick Super Chromium	Farmazon	SKU : 401146	; Les lames fines du rasoir sont utilisées pour couper la matrice d’agarose, ce qui nous permet d’obtenir les disques avec l’échantillon tout en maintenant l’intégrité de la matrice.