Application de l’analyse cytométrique en flux pour mesurer plusieurs paramètres mitochondriaux dans des organoïdes cérébraux 3D

Sharika Marjan; Tsering Yangzom; Cecilie Katrin Kristiansen; Anbin Chen; Laurence A. Bindoff; Kristina Xiao Liang

doi:10.3791/65621

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Article de méthode

Application de l’analyse cytométrique en flux pour mesurer plusieurs paramètres mitochondriaux dans des organoïdes cérébraux 3D

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DOI :

10.3791/65621

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4 août 2023

Sharika Marjan¹^,² , Tsering Yangzom¹^,² , Cecilie Katrin Kristiansen¹^,³ , Anbin Chen⁴ , Laurence A. Bindoff¹^,⁵^,⁶ , Kristina Xiao Liang¹^,³

¹Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, ²Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, ³Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, ⁴Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, ⁵Department of Neurology, Haukeland University Hospital, ⁶National Advisory Unit for Congenital Metabolic Diseases, Oslo University Hospital

Dans cet article

Résumé

Ce protocole fait état d’une méthode unique d’utilisation d’un cytomètre en continu et de plusieurs anticorps pour l’évaluation simultanée de plusieurs paramètres fonctionnels mitochondriaux, y compris les modifications du volume mitochondrial, les quantités de sous-unités complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale (MRC) et la réplication de l’ADN mitochondrial (ADNmt).

Résumé

Le dysfonctionnement mitochondrial est un contributeur primaire ou secondaire commun à de nombreux types de neurodégénérescence, et des modifications de la masse mitochondriale, des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale (MRC) et du nombre de copies de l’ADN mitochondrial (ADNmt) figurent souvent dans ces processus. Les organoïdes du cerveau humain dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) récapitulent l’arrangement cytoarchitectural tridimensionnel (3D) du cerveau et offrent la possibilité d’étudier les mécanismes de la maladie et de cribler de nouvelles thérapies dans un système humain complexe. Ici, nous rapportons une approche unique basée sur la cytométrie en flux pour mesurer plusieurs paramètres mitochondriaux dans les organoïdes corticaux dérivés d’iPSC. Ce rapport détaille un protocole pour générer des organoïdes cérébraux corticaux à partir d’iPSC, la dissociation unicellulaire des organoïdes générés, la fixation, la coloration et l’analyse cytométrique en flux ultérieure pour évaluer plusieurs paramètres mitochondriaux. La double coloration avec des anticorps contre la sous-unité du complexe MRC NADH : la sous-unité B10 (NDUFB10) de l’ubiquinone oxydoréductase ou le facteur de transcription mitochondrial A (TFAM) associée au canal sélectif des anions 1 dépendant de la tension (VDAC 1) permet d’évaluer la quantité de ces protéines par mitochondrie. Étant donné que la quantité de TFAM correspond à la quantité d’ADNmt, elle fournit une estimation indirecte du nombre de copies d’ADNmt par contenu mitochondrial. L’ensemble de cette procédure peut être complété en l’espace de 2 à 3 heures. De manière cruciale, il permet la quantification simultanée de plusieurs paramètres mitochondriaux, y compris les niveaux totaux et spécifiques relatifs à la masse mitochondriale.

Introduction

Les mitochondries sont des organites cellulaires essentiels et le principal site de production de l’adénosine triphosphate (ATP). En plus de fournir de l’énergie aux cellules, les mitochondries participent également à de multiples processus cellulaires, notamment la transmission de l’information cellulaire, la différenciation cellulaire et l’apoptose, et ont la capacité de réguler la croissance cellulaire et le cycle cellulaire. Des modifications de la fonction mitochondriale ont été identifiées dans diverses maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Parkinson (MP)^1,2