Préparation d’échantillons alimentaires par homogénéisation et digestion humide assistée par micro-ondes pour la détermination multi-éléments avec ICP-MS

L’analyse élémentaire est un processus analytique permettant de déterminer la composition élémentaire de divers échantillons. Il peut être utilisé pour contrôler l’absorption de métaux dans le corps humain (en particulier les métaux lourds¹) car leurs concentrations élevées peuvent causer des problèmes de santé indésirables. Les métaux lourds sont également l’un des principaux contaminants environnementaux, il est donc nécessaire de contrôler leur présence dans l’environnement². De plus, l’analyse élémentaire peut être utilisée pour déterminer l’origine géographique des produits alimentaires³ et pour contrôler la qualité des ressources alimentaires et hydriques⁴. En outre, il est utilisé pour la détermination des micronutriments et macronutriments dans les sols⁵ et pour mieux comprendre les processus géologiques à travers l’histoire en examinant la composition chimique des minéraux et des sédiments⁶. Des études ont également été menées pour déterminer la présence de métaux rares dans les déchets électriques et électroniques en vue d’une régénération ultérieure^{des métaux 7}, pour évaluer le succès des traitements médicamenteux⁸ et pour vérifier la composition élémentaire des implants métalliques⁹.

La spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) et la spectroscopie d’émission optique à plasma à couplage inductif (ICP-OES) sont des techniques couramment utilisées pour l’analyse élémentaire de divers échantillons¹⁰. Ils permettent la détermination simultanée de plusieurs éléments avec des limites de détection (LOD) et des limites de quantification (LOQ) aussi basses que ng/L. En général, l’ICP-MS a des valeurs LOD¹¹ plus faibles et une plage de concentration linéaire plus large que l’ICP-OES¹². D’autres techniques pour déterminer la composition élémentaire sont la spectrométrie d’émission optique à plasma induit par micro-ondes¹³ et plusieurs variantes de spectroscopie d’absorption atomique (AAS), y compris la spectroscopie d’absorption atomique de flamme, la spectroscopie d’absorption atomique électrothermique², la spectroscopie d’absorption atomique de vapeur froide et la spectroscopie d’absorption atomique de génération d’hydrure¹⁴. De plus, la détermination élémentaire avec une faible LOD et LOQ est possible avec différentes méthodes électroanalytiques, en particulier avec la voltampérométrie de décapage anodique^15,16. Bien sûr, il existe d’autres méthodes pour déterminer la composition élémentaire des échantillons, mais elles ne sont pas aussi fréquemment utilisées que les méthodes mentionnées ci-dessus.

La détermination élémentaire directe des échantillons solides est possible à l’aide de la spectroscopie de claquage induite par laser et de la fluorescence X¹⁷. Cependant, pour la détermination élémentaire avec ICP-MS, ICP-OES et AAS, il est nécessaire de convertir les échantillons solides à l’état liquide. Pour cela, la digestion acide est réalisée à l’aide d’acides et de réactifs auxiliaires (dans la plupart des cas H₂O₂). La digestion acide est effectuée à température et pression élevées, convertissant la partie organique de l’échantillon en produits gazeux et convertissant les éléments métalliques en sels solubles dans l’eau, les dissolvant ainsi dans la solution¹⁸.

Il existe deux principaux types de digestion acide, la digestion à récipient ouvert et la digestion à récipient fermé. La digestion en récipient ouvert est rentable¹⁴ mais présente des limites, telles que la température maximale de digestion, qui coïncide avec la température d’ébullition des acides à pression atmosphérique. L’échantillon peut être chauffé sur des plaques chauffantes, des blocs chauffants, des bains-marie, des bains de sable² et par micro-ondes¹⁹. En chauffant l’échantillon de cette manière, une grande partie de la chaleur générée est perdue dans l’environnement²⁰, ce qui prolonge le temps de digestion¹⁴. D’autres inconvénients de la digestion en récipient ouvert incluent une plus grande consommation de produits chimiques, une plus grande possibilité de contamination par l’environnement environnant et une perte possible d’analytes due à la formation de composants volatils et à leur évaporation du mélange réactionnel²¹.

Les systèmes à récipients fermés sont plus pratiques pour la digestion d’échantillons organiques et inorganiques que les systèmes à récipients ouverts. Les systèmes à cuve fermée utilisent diverses sources d’énergie pour chauffer les échantillons, telles que le chauffage par conduction et les micro-ondes²². Les méthodes de digestion qui utilisent des micro-ondes comprennent la combustion induite par micro-ondes²³, les systèmes à chambre de réaction unique²⁴ et la digestion acide humide assistée par micro-ondes (MAWD) couramment ^{utilisée25,26}. MAWD permet la digestion à des températures de fonctionnement plus élevées, comprises entre 220 °C et 260 °C et des pressions maximales allant jusqu’à 200 bars, selon les conditions de fonctionnement de l’instrument²⁷.

L’efficacité et le taux de MAWD dépendent de plusieurs facteurs, notamment la composition chimique des échantillons, la température maximale, le gradient de température, la pression dans la cuve de réaction, la quantité d’acides ajoutés et la concentration d’acides utilisés²⁸. Dans le MAWD, la digestion acide complète peut être réalisée en quelques minutes en raison des conditions de réaction élevées par rapport aux digestions plus durables dans les systèmes à cuves ouvertes. Des volumes et des concentrations d’acides plus faibles sont nécessaires dans la MAWD, ce qui est conforme aux directives actuelles en matière de chimie verte²⁹. Dans le cas de la MAWD, une plus petite quantité d’échantillon par rapport à la digestion en vaisseau ouvert est nécessaire pour effectuer la digestion acide, généralement jusqu’à 500 mg d’échantillon suffisent 30,31,32. De plus grandes quantités d’échantillons peuvent être digérées, mais elles nécessitent une plus grande quantité de produits chimiques.

Étant donné que l’instrument de MAWD contrôle automatiquement les conditions de réaction et que la personne n’entre pas en contact direct avec les produits chimiques pendant le chauffage, la MAWD est plus sûre à utiliser que les digestions en récipient ouvert. Cependant, la personne doit toujours procéder avec prudence lorsqu’elle ajoute des produits chimiques dans les vaisseaux de réaction pour éviter qu’ils n’entrent en contact avec le corps et ne causent des dommages. Les récipients de réaction doivent également être ouverts lentement car la pression s’accumule à l’intérieur pendant la digestion acide.

Bien que la digestion acide soit une technique utile pour préparer les échantillons pour la détermination élémentaire, la personne qui l’effectue doit être consciente de ses limites possibles. La digestion acide peut ne pas convenir à tous les échantillons, en particulier ceux qui ont des matrices complexes et ceux qui sont très réactifs ou qui pourraient réagir de manière explosive. Par conséquent, la composition de l’échantillon doit toujours être évaluée pour sélectionner les produits chimiques et les conditions de réaction appropriés pour une digestion complète qui dissout tous les éléments souhaités dans la solution. D’autres préoccupations que l’utilisateur doit prendre en compte et traiter sont les impuretés et la perte d’analytes à chaque étape de la préparation de l’échantillon. La digestion acide doit toujours être effectuée selon des règles spécifiques ou à l’aide de protocoles.

Le protocole décrit ci-dessous fournit des instructions pour l’homogénéisation des échantillons d’aliments dans un mélangeur de laboratoire, une procédure pour nettoyer les composants du mélangeur, peser correctement l’échantillon, ajouter des produits chimiques, effectuer la digestion acide par MAWD, nettoyer les récipients de réaction une fois la digestion terminée, préparer les échantillons pour la détermination élémentaire et effectuer une détermination quantitative multi-éléments avec ICP-MS. En suivant les instructions données ci-dessous, on devrait être en mesure de préparer un échantillon adapté à la détermination élémentaire et d’effectuer les mesures des échantillons digérés.

1. Homogénéisation des échantillons

1. À l’aide d’un couteau en céramique propre, coupez manuellement les échantillons d’aliments (brocoli, champignons, saucisses et nouilles) en petits morceaux pour accélérer le processus de séchage. Préparez suffisamment d’échantillons pour un minimum de 6 répétitions de la digestion acide (assurez-vous que la masse minimale des échantillons séchés est de 1500 mg).
   REMARQUE : L’augmentation de la surface de l’échantillon expose une plus grande partie de l’échantillon à l’air ambiant chauffé, ce qui augmente le taux d’évaporation de l’eau.
2. Placer l’échantillon dans un bécher en verre de 250 mL et le sécher à 105 °C à un poids constant à l’aide d’un sécheur.
3. Retirez le bécher en verre avec l’échantillon du sécheur et insérez-le dans le dessiccateur.
4. Laissez l’échantillon refroidir à température ambiante.
   REMARQUE : Les échantillons doivent être pesés à une température constante pour s’assurer que le poids reflète fidèlement la masse. Les variations de température peuvent affecter le volume et la densité des échantillons mesurés.
5. Ouvrez le dessiccateur et transférez le bécher en verre avec l’échantillon sur la balance analytique. Mesurez le poids du bécher en verre avec l’échantillon.
6. Une fois la pesée terminée, remettez l’échantillon dans le sécheur.
   REMARQUE : Si l’échantillon a rétréci de manière significative pendant le séchage, on peut le transférer dans un bécher en verre plus petit à l’aide d’une spatule en plastique pour une pesée plus pratique.
7. Répéter le processus décrit aux étapes 1.3 à 1.6 jusqu’à ce que le poids de l’échantillon soit constant.
8. Placer l’échantillon hétérogène séché dans le bécher du mélangeur (voir le tableau des matériaux), en veillant à ce qu’il ne dépasse pas le volume maximum du bécher mélangeur.
9. Insérez le bécher du mélangeur dans le mélangeur et fermez la porte de protection (Figure 1).
10. Appuyez sur le bouton de démarrage pour activer les lames pour le broyage et le mélange de l’échantillon.
11. Effectuez le broyage jusqu’à ce que l’échantillon se transforme en une poudre fine ou en une pâte homogène. Pour obtenir un tel produit, répétez le processus de broyage plusieurs fois.
12. Lorsque l’échantillon est homogénéisé, éteignez le mélangeur, ouvrez la porte de protection et retirez le bécher du mélangeur.
13. Retirer l’échantillon homogénéisé du bécher du mélangeur et le transférer dans un bécher en verre propre de 50 ml à l’aide d’une spatule en plastique propre (figure 2).
    REMARQUE : Si l’échantillon est trop dur et risque d’endommager les composants du mélangeur, tels que les lames et le bécher du mélangeur, il peut être homogénéisé par d’autres moyens, comme l’écraser dans des mortiers. Les mélangeurs ne conviennent généralement pas à l’homogénéisation de matériaux durs, d’échantillons congelés ou d’échantillons facilement inflammables, ce qui pourrait endommager les composants du mélangeur. L’utilisation de solvants organiques dans le mélangeur est déconseillée.
    ATTENTION : Utilisez un équipement de sécurité et assurez-vous que la porte du mélangeur est correctement fermée car les lames du mélangeur tournent à grande vitesse.

2. Nettoyage du mélangeur

1. Ajoutez de l’eau ultrapure (voir tableau des matériaux) à la marque du bécher du mélangeur vide.
2. Insérez le bécher du mélangeur dans le mélangeur et effectuez la procédure de mélange standard.
3. Sortez le bécher du mélangeur et versez les eaux usées. Si nécessaire, répétez le processus avec de l’eau ultra-pure plusieurs fois jusqu’à ce que l’eau reste propre même après le mélange.
4. Retirez les lames et le diaphragme contaminés du mélangeur et nettoyez-les soigneusement avec de l’eau ultra-pure.
   REMARQUE : Utilisez des détergents neutres pour améliorer l’efficacité du nettoyage, en particulier lorsqu’il s’agit d’échantillons à forte teneur en matières grasses, car la graisse adhère facilement à la surface de l’inventaire du laboratoire.
   ATTENTION : Portez un équipement de protection approprié, tel que des gants, lorsque vous retirez et nettoyez les lames afin de réduire le risque de blessures potentielles dues à leurs bords tranchants.
5. Séchez les composants nettoyés dans le sécheur à 105 °C et réinsérez-les dans le mélangeur.
   REMARQUE : Assurez-vous que les composants du mélangeur sont complètement secs avant de les réinstaller dans le mélangeur, afin d’éviter que l’eau ne soit transférée à l’échantillon suivant.

3. Pesée de l’échantillon

1. Retirez le couvercle du couvercle de la cuve de réaction TFM-PTFE de 100 mL de trifluorométhoxyl-polytétrafluoroéthylène³³.
2. Placer la cuve de réaction ouverte sur la balance analytique et s’assurer que la balance est mise à niveau et remise à zéro avant chaque mesure (Figure 3).
   REMARQUE : La pesée doit être effectuée à température ambiante. Évitez les zones où de fortes fluctuations de température et de débit d’air pourraient affecter le poids mesuré. Assurez-vous que la zone de pesée est propre et exempte de tout contaminant.
3. Transvaser l’échantillon homogénéisé dans le récipient de réaction à l’aide d’une spatule en plastique et peser 250 mg de l’échantillon. Ne pesez pas l’échantillon en dessous de la limite de poids minimale de la balance d’analyse.
4. Une fois la pesée terminée, placez le couvercle sur le récipient de réaction pour protéger l’échantillon de la contamination.
   REMARQUE : Le dépassement de la limite de poids de la procédure de digestion peut entraîner une digestion incomplète. Manipulez les récipients d’échantillon et de réaction avec précaution pour éviter toute contamination externe.

4. Ajout d’acide

1. Verser environ 40,0 mL de HNO₃ à 68 % en poids et 5,0 mL de 30 % en poids_{de H 2}O₂ dans des béchers en verre séparés de 50 mL, respectivement.
   REMARQUE : Les produits chimiques doivent être de haute pureté avec des impuretés de métaux traces inférieures à 1,0 μg/L (ppb), idéalement dans la gamme ng/L (ppt). Les impuretés de métaux traces affectent la précision et la répétabilité de la détermination élémentaire.
2. Placer les récipients de réaction dans une hotte, ouvrir les couvercles et ajouter les volumes mentionnés ci-dessous de 68 % en poids de HNO₃ et 30 % en poids_{de H 2}O₂ avec des pipettes automatiques de 1 mL ou 5 mL, selon les spécifications suivantes :
   1. Brocoli, champignons, saucisses et nouilles ; pour 250 mg d’échantillon, ajouter 5,0 mL 68 % en poids de HNO₃ et 1,0 mL 30 % en poids de H₂O₂. Préparez trois répétitions pour chaque échantillon.
   2. Pour déterminer la précision de la méthode (en termes de récupération, de réc., d’enregistrement), utiliser la procédure décrite à l’étape 4.2.1 et ajouter 37,5 μL de solution étalon multi-éléments ICP à 100 mg/L (voir le tableau des matériaux) dans les récipients de réaction à l’aide d’une pipette automatique de 200 μL. Pour chaque échantillon, préparez trois répétitions.
      NOTA : Le volume de 37,5 μL a été choisi car il correspond à une augmentation de 15,0 μg/L pour les solutions enrichies des échantillons par rapport à la concentration dans les solutions non enrichies des échantillons. De plus, l’augmentation de la concentration pour la solution enrichie des échantillons correspond à la concentration finale qui se situe toujours dans la plage de concentration linéaire pour chaque analyte mesuré.
   3. Préparer un blanc d’échantillon en utilisant le même volume de 68 % en poids de HNO₃ et de 30 % en poids de H₂O₂ que celui utilisé pour la digestion des échantillons d’aliments à l’étape 4.2.1. Pour un échantillon blanc, ne pas ajouter l’échantillon dans les récipients de réaction.
      ATTENTION : HNO₃ utilisé pour la digestion est corrosif et produit des fumées. Pour cette raison, l’ajout d’acide doit être effectué dans une hotte. Un équipement de protection de laboratoire standard doit être utilisé (gants, lunettes de sécurité et blouse de laboratoire). En cas de contact avec de l’acide, la zone touchée doit être immédiatement rincée sous le jet d’eau froide et une aide médicale doit être recherchée.
3. Placez le couvercle sur les récipients de réaction et laissez les échantillons réagir avec les 68 % en poids HNO₃ et 30 % en poids de H₂O₂ ajoutés pendant 2 à 3 min.
4. Vissez le couvercle fileté sur le récipient et serrez les couvercles du couvercle.
5. Secouez le récipient de réaction en effectuant de légers mouvements de la main pour incorporer complètement les échantillons dans les produits chimiques.
   REMARQUE : Ne laissez pas les échantillons sur les parois ou les couvercles des récipients de réaction, car il est possible qu’ils ne soient pas complètement digérés.

5. Digestion acide humide assistée par micro-ondes

1. Allumez le système à micro-ondes (voir Tableau des matières) pour la digestion acide en appuyant sur le bouton de démarrage (Figure 4).
2. Ouvrez la porte du four à micro-ondes et retirez la grille.
3. Répartissez les récipients de réaction fermés symétriquement dans le rack pour assurer une irradiation uniforme des échantillons par micro-ondes.
4. Insérez la grille dans la chambre à micro-ondes et montez-la sur un support (Figure 5).
5. Fermez la porte du four à micro-ondes.
6. Réglez un programme de digestion approprié sur l’écran tactile du four à micro-ondes à l’aide d’un outil en forme de stylo. Choisissez un gradient de température approprié, la température finale et le nombre d’échantillons à digérer. Le programme de digestion recommandé pour différents échantillons d’aliments est indiqué ci-dessous :
   1. Brocoli, champignons, saucisses et nouilles : 10 min d’augmentation à 160 °C, 10 min d’augmentation à 200 °C, 15 min à 200 °C, puissance maximale 900 W.
7. Démarrez le programme de digestion et surveillez le changement des conditions de réaction à l’écran. Arrêtez le processus de digestion si la température n’augmente pas selon le programme prescrit.
   REMARQUE : Pendant la digestion, des pics de température soudains peuvent être observés sur l’écran du four à micro-ondes. Ils se produisent lorsque les échantillons réagissent de manière exothermique avec les produits chimiques. Le système à micro-ondes régulera automatiquement la température en ajustant la puissance de sortie.
8. Attendez que la digestion assistée par micro-ondes soit terminée et que la température de l’échantillon diminue.
9. Ouvrez la porte du four à micro-ondes et retirez la grille de la chambre du four à micro-ondes. Fermez la porte et éteignez l’instrument.
10. Retirez les récipients de réaction du rack et attendez qu’ils refroidissent à température ambiante.
11. Ouvrez lentement les couvercles manuellement pour libérer les gaz formés lors de la digestion acide. Tournez les cuves de réaction dans le sens de la hotte (Figure 6).
12. Retirez complètement le couvercle et rincez le couvercle et les parois du récipient de réaction avec une petite quantité d’eau ultrapure.
13. Transvaser quantitativement le contenu du récipient de réaction dans un ballon jaugé en verre propre de 25 mL à travers un entonnoir en verre en rinçant à plusieurs reprises le couvercle et le récipient de réaction avec de l’eau ultrapure.
14. Diluer l’échantillon avec de l’eau ultrapure jusqu’au repère de la fiole jaugée. Fermer la fiole jaugée à l’aide d’un bouchon et mélanger le contenu de la fiole jaugée.
    REMARQUE : Une dilution supplémentaire des échantillons digérés avec de l’eau ultrapure doit être effectuée, car ils doivent contenir moins de 5 % (V/V) d’acide résiduel³⁴ et moins de 2 g/L d’éléments dissous, également appelés solides dissous totaux³⁵.
15. Prenez une seringue en plastique de 20 ml et connectez-la à un filtre de seringue en polyamide (25 mm de diamètre, taille des pores de 0,20 μm). Remplissez la seringue en plastique avec l’échantillon dilué et filtrez son contenu dans un tube à centrifuger en plastique de 50 mL en appliquant une pression. Utilisez une nouvelle seringue en plastique et un filtre pour chaque échantillon afin d’éviter toute contamination croisée.
    REMARQUE : Les échantillons doivent être filtrés pour éliminer les matières insolubles ou les particules solides qui pourraient rester non digérées après la MAWD. Ces particules peuvent interférer avec les mesures de détermination élémentaire en obstruant les composants de l’instrument. Lorsque vous filtrez les échantillons, assurez-vous de jeter les deux premières gouttes. Utilisez des filtres hydrophiles (en polyamide) pour les solutions aqueuses. Les filtres hydrophobes (PTFE) ne sont pas adaptés à la filtration de solutions aqueuses car ils nécessitent une pression appliquée plus élevée, ce qui pourrait entraîner une rupture de la membrane³⁶.
16. Fermez le tube à centrifuger en plastique de 50 ml avec un bouchon à vis et mettez l’échantillon au réfrigérateur jusqu’aux mesures.
    REMARQUE : Les échantillons digérés sont conservés au réfrigérateur à des températures plus basses pour les conserver et prolonger leur durée de conservation.

6. Nettoyage de la cuve de réaction

1. Après le transfert des échantillons digérés dans des fioles jaugées de 50 mL, ajouter 5,0 mL de HNO₃ à 68 % en poids et 5,0 mL d’eau ultrapure avec des pipettes automatiques de 5 mL dans les récipients de réaction.
2. Fermez les récipients de réaction avec les couvercles et insérez-les dans le rack. Transférer la grille dans la chambre du four à micro-ondes.
3. Appliquez le programme micro-ondes suivant : 15 min d’augmentation à 160 °C, 10 min d’augmentation à 180 °C, puissance maximale 900 W.
4. Surveillez les conditions de réaction pendant le chauffage. Une fois le chauffage terminé, laissez refroidir les récipients de réaction.
5. Ouvrez le four à micro-ondes, retirez les récipients de réaction de la grille et ouvrez-les lentement dans la hotte.
6. Jetez le contenu des récipients de réaction dans des conteneurs à déchets plastiques.
7. Rincez les récipients de réaction avec de l’eau ultrapure pour éliminer tout excès de matériau ou de produits chimiques.
8. Sécher les cuves de réaction dans le sécheur à 105 °C avant la prochaine utilisation.
   REMARQUE : La même procédure micro-ondes (temps, puissance, gradient de température et volume de produits chimiques) utilisée pour la digestion acide des échantillons peut être utilisée pour nettoyer les récipients de réaction. Alternativement, les récipients de réaction peuvent être nettoyés sans le système à micro-ondes en les immergeant dans du HNO₃ ou du HCl concentré pendant plusieurs heures et en les rinçant à l’eau ultrapure.

7. Détermination multi-éléments avec ICP-MS

1. Sortez du réfrigérateur les tubes à centrifuger en plastique de 50 ml contenant les échantillons digérés et laissez-les se réchauffer à température ambiante.
2. Diluer les échantillons d’un facteur 10 pour diminuer la concentration d’acide dans l’échantillon digéré et diminuer la concentration du composant de la matrice de l’échantillon. À l’aide d’une pipette automatique, transvaser 2,50 mL de l’échantillon dans une fiole jaugée en verre de 25 mL, puis la remplir jusqu’au trait de jauge avec de l’eau ultrapure.
3. Transférez les échantillons dilués dans les tubes en plastique de 15 mL et placez-les dans les positions appropriées dans l’échantillonneur automatique.
4. Préparez l’instrument ICP-MS (voir Tableau des matériaux) pour les mesures :
   1. Allumez la ventilation et le refroidisseur qui alimente l’ICP-MS en eau de refroidissement et refroidit ses composants.
   2. Utilisez le logiciel compatible pour vous assurer que la solution de rinçage (1 % en poids HNO₃) s’écoule en continu de l’échantillonneur automatique vers l’ICP-MS sans pulsation.
   3. Ouvrez les bouteilles de gaz Ar (pureté 99,999 %) et He (pureté 99,999 %) pour alimenter l’ICP-MS avec les deux gaz. Vérifiez le débit de gaz dans le logiciel et ajustez-le si nécessaire.
      NOTA : Utiliser la cellule de collision avec le gaz He lorsque des interférences spectrales sont attendues en raison de la formation d’ions polyatomiques (par exemple, ⁴⁰Ar¹⁶O⁺ interférant avec ⁵⁶Fe⁺)³⁷.
   4. Démarrez le plasma et calibrez l’instrument à l’aide de la solution d’accordage (voir Tableau des matériaux).
   5. Une fois l’instrument étalonné (position de la torche, tension de gain, tension de l’objectif, masse/résolution, étalonnage impulsion/analogique (P/A), étalonnage de la base de données (DB) et validation), sélectionnez la méthode de mesure souhaitée et effectuez les mesures.
5. Lorsque vous travaillez avec des échantillons inconnus, effectuez une détermination semi-quantitative pour obtenir des informations sur les éléments présents dans l’échantillon et leur concentration approximative.
   REMARQUE : Il est conseillé de diluer en plus les échantillons pour la détermination semi-quantitative car les détecteurs ont une limite de concentration d’éléments qu’ils peuvent détecter à la fois. Des concentrations d’échantillons plus faibles peuvent prolonger la durée de vie des composants de l’instrument.
6. Après avoir obtenu les données sur les concentrations approximatives des éléments dans les échantillons, créez une méthode de détermination quantitative des éléments dans le logiciel. Sélectionnez les conditions de fonctionnement de l’ICP-MS (Tableau 1) et sélectionnez les éléments souhaités (dans le cas présent, Cu, Fe, Mn et Zn). Déterminer le nombre et les concentrations de solutions de l’étalon nécessaires pour créer une courbe d’étalonnage (parfois appelée courbe analytique ou courbe de travail) (tableau 1).
   REMARQUE : Préparez au moins six concentrations différentes comme points d’étalonnage pour la courbe d’étalonnage.
7. Préparer des solutions d’étalon pour la courbe d’étalonnage. À l’aide de pipettes automatiques, pipeter le volume requis de solutions étalons multi-éléments de 100 mg/L dans des fioles jaugées en verre de 25 mL, afin de préparer des solutions d’étalons aux concentrations suivantes : 1,0 μg/L, 2,5 μg/L, 5,0 μg/L, 10,0 μg/L, 20,0 μg/L, 30,0 μg/L, 40,0 μg/L et 50,0 μg/L. Remplir les flacons jusqu’à la marque avec 1 % en poids de HNO₃. De plus, préparez un blanc d’étalonnage en utilisant la solution HNO₃ à 1 % en poids.
8. Transvasez les solutions préparées d’étalon et d’échantillons dans les tubes en plastique de 15 mL, placez-les dans l’échantillonneur automatique et démarrez l’instrument en suivant la procédure décrite à l’étape 7.4.
9. Effectuer la mesure quantitative des éléments sélectionnés en utilisant la méthodologie de la courbe d’étalonnage.
10. Une fois les mesures terminées, éteignez le plasma, fermez les alimentations en gaz Ar et He, éteignez le refroidisseur ICP-MS et éteignez le système de ventilation.

Homogénéisation
Tous les échantillons ont été séchés en masse constante avec le séchoir de laboratoire pour éliminer toute humidité. Le transfert de l’échantillon dans un dessiccateur lui a permis de refroidir à température ambiante sans retenir l’humidité de l’environnement environnant. Les échantillons d’aliments ont ensuite été homogénéisés à l’aide du mélangeur de laboratoire pour obtenir une poudre fine. Les particules homogénéisées résultantes étaient de taille uniforme et uniformément réparties, ce qui garantissait que les sous-échantillons (échantillons prélevés sur un échantillon plus grand) utilisés pour la digestion acide étaient représentatifs. Les échantillons étaient facilement retirés du bécher du mélangeur à l’aide d’une spatule en plastique, à l’exception de l’échantillon de viande séchée, qui était plus difficile à retirer en raison de sa teneur plus élevée en matières grasses. Une teneur plus élevée en matières grasses a fait adhérer partiellement l’échantillon aux parois en verre du bécher mélangeur. La comparaison des échantillons frais, séchés et homogénéisés est présentée à la figure 2.

Les composants de l’instrument ont dû être nettoyés plusieurs fois avec de l’eau ultrapure pour éliminer toutes les particules alimentaires qui restaient dans le mélangeur.

Il est essentiel de s’assurer que la masse pesée de l’échantillon ne dépasse pas la valeur maximale autorisée dans les cuves de réaction. La pesée a été effectuée à l’aide d’une balance analytique à température constante, et une spatule en plastique a été utilisée pour éviter la contamination par les métaux qui peuvent provenir des spatules métalliques.

Digestion acide
Tous les échantillons utilisés dans le protocole étaient des échantillons d’aliments contenant diverses quantités de glucides, de protéines et de graisses. HNO3, en combinaison avec H2O2, convient à la digestion de ces molécules, et d’autres produits chimiques ne sont pas nécessaires. Les produits chimiques ont été traités dans une hotte car HNO3 forme des fumées. Après avoir ajouté les produits chimiques dans les cuves de réaction TFM-PTFE, des couvercles ont été montés sur le dessus des cuves de réaction et ont été bien scellés pour éviter toute contamination et perte d’analyte. Les récipients de réaction étaient répartis symétriquement dans le rack pour assurer une irradiation micro-ondes uniforme à l’intérieur du système micro-ondes.

Pendant la digestion acide, la porte du système à micro-ondes était fermée et la porte ne pouvait être ouverte qu’à la fin du protocole. L’ensemble du processus de digestion acide peut être surveillé sur l’écran de l’appareil, montrant l’évolution de la température avec le temps (Figure 7).

Une fois la digestion acide terminée et les solutions des échantillons digérés refroidies à température ambiante, les récipients de réaction ont été ouverts dans la hotte. Ils ont été ouverts aussi lentement que possible. Si la pression est relâchée trop rapidement, même de petites gouttelettes du mélange réactionnel peuvent s’échapper, entraînant une perte d’analyte. Lorsque les cuves de réaction ont été ouvertes, un gaz jaune ou jaune-orange a été libéré (Figure 8). La coloration des fumées peut être attribuée au NO2, qui forme des fumées orange à des températures plus élevées. L’augmentation de la pression dans les récipients de réaction était due à l’oxydation des échantillons d’aliments avec HNO3, entraînant la formation de gaz tels que CO2, H2O, NO, etc. Après le dégazage des récipients de réaction, une solution jaune clair ou incolore de l’échantillon digéré est restée dans le récipient de réaction, indiquant que la digestion acide totale par MAWD avait été réalisée. Cela a été confirmé par l’absence de particules visibles dans la solution.

La dernière étape de la préparation des échantillons consistait à diluer les échantillons digérés avec de l’eau ultrapure pour réduire l’acidité résiduelle (AR). Des valeurs RA élevées interfèrent avec les mesures en augmentant le signal de fond. La dilution diminue également la concentration d’ions métalliques dans l’échantillon liquide26. Lors du transfert de la solution d’échantillons digérés dans des fioles jaugées, les composants du récipient de réaction ont été soigneusement rincés avec de l’eau ultrapure pour transférer complètement l’analyte. Un problème qui se pose est que de petites gouttes d’eau ultrapure, qui peuvent contenir l’analyte d’intérêt, adhèrent aux parois des récipients de réaction. Après dilution avec de l’eau ultrapure jusqu’à la marque de 25 ml, tous les échantillons sont devenus incolores. Les solutions finales des échantillons digérés contenaient des sels solubles dans l’eau, car les éléments métalliques présents dans l’échantillon réagissaient avec HNO3 pour former des nitrates hautement solubles. Les techniques d’analyse élémentaire permettent de déterminer les ions métalliques qui forment des sels solubles dans l’eau. Lors de la filtration des solutions diluées, il est important de jeter les premières gouttes pour s’assurer que toutes les particules ou contaminants sont éliminés. Après filtration, les solutions ont été hermétiquement scellées pour éviter toute fuite, puis stockées au réfrigérateur.

La principale limitation de la procédure de digestion acide est le débit d’échantillons. Le système MAWD ne peut digérer qu’un nombre limité d’échantillons à la fois. De plus, chaque étape de digestion et de préparation des échantillons peut prendre plusieurs heures. De plus, le nettoyage de la cuve de réaction prend également du temps, mais il est crucial de minimiser le risque de contamination croisée entre les échantillons.

Détermination multi-éléments avec ICP-MS
Pour chaque élément, une courbe d’étalonnage a été construite. Ils ont été obtenus en traçant l’intensité en fonction des concentrations d’analytes (figure 9). Les plages de concentration linéaires pour tous les éléments mesurés se situaient entre 1,0 μg/L et 50,0 μg/L.

La LD et la LQ pour chaque élément ont été calculées à l’aide de l’équation 1 et de l’équation 2, respectivement. Dans les deux équations, sblanc représente l’écart-type des différentes mesures du blanc d’étalonnage (10 répétitions)38,39, tandis que b1 représente la pente de la courbe d’étalonnage.

(1)

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Les LD obtenues étaient de 0,5 ng/L, 2,8 ng/L, 2,8 ng/L et 3,2 ng/L pour le Mn, le Cu, le Fe et le Zn, respectivement. Les LQ obtenues étaient de 1,6 ng/L, 9,2 ng/L, 9,5 ng/L et 10,8 ng/L pour le Mn, le Cu, le Fe et le Zn, respectivement.

Six digestions répétées de chaque échantillon ont été effectuées. Trois digestions répétées de chaque échantillon ont été effectuées sans doper l’échantillon avec des solutions d’étalon, et trois digestions répétées ont été effectuées avec l’ajout d’une solution d’une quantité connue d’étalon d’analyte pour tester l’exactitude (test de récupération des pointes40) et la précision de l’ensemble de la méthodologie. Pour déterminer l’exactitude avant la procédure de digestion, 37,5 μL de solution étalon multi-éléments ICP à 100 mg/L ont été pipetés dans les récipients de réaction contenant l’échantillon, ce qui a entraîné une augmentation de la concentration de 15,0 μg/L dans les échantillons enrichis dilués par un facteur de 10. Cela correspondait également à une augmentation de 15,0 μg par gramme d’échantillon pour chaque ion métallique mesuré. L’exactitude et la précision ont été déterminées à l’aide de Rec et de l’écart-type relatif (RSD), respectivement.

La précision d’une méthode analytique peut être évaluée par le test de récupération des pointes. À cette fin, une solution d’une quantité connue d’étalon d’analyte est ajoutée à l’échantillon, qui est ensuite digéré dans les mêmes conditions de réaction que les échantillons qui ne sont pas enrichis41. Le Rec est calculé à l’aide de l’équation 3, où γi est la concentration mesurée des échantillons enrichis après digestion, tandis que γt représente la concentration déterminée de l’échantillon non enrichi en tenant compte de l’augmentation de la solution ajoutée d’étalon d’analyte. Les γi et γt sont des moyennes des trois répétitions. La méthode d’analyse est considérée comme précise lorsque l’enregistrement se situe dans la plage de 80,00 % à 120,00 %42.

(3)

La précision d’une méthode analytique est évaluée avec RSD. Il décrit l’étroitesse de la concordance entre des résultats indépendants, qui ont été obtenus par plusieurs mesures répétées. La DSR est calculée à l’aide de l’équation 4, où sm représente l’écart-type des mesures répétées pour la détermination de la concentration, tandis que représente la valeur moyenne des concentrations déterminées. La méthode d’analyse est considérée comme précise si la valeur RSD est inférieure à 20,00 %43.

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Tous les échantillons ont été dilués avec de l’eau ultrapure d’un facteur 10 avant les mesures ICP-MS (pour la première série de mesures). La dilution a diminué la concentration des composants de la matrice introduits dans l’analyseur. De plus, en diluant l’échantillon, l’AR diminue. Un RA élevé peut compromettre l’efficacité de l’ionisation du plasma ou entraîner des problèmes d’interférence matricielle. Si la concentration des analytes après la première série de mesures est inférieure à la LQ, le facteur de dilution doit être inférieur à 10. La quantification des ions métalliques a été réalisée à l’aide d’une courbe d’étalonnage. Les valeurs des résultats calculés doivent avoir la même précision (le même nombre de chiffres significatifs) que la solution de l’étalon utilisé pour l’étalonnage. La teneur en ions métalliques de l’échantillon a été exprimée en μg par gramme de poids (μg/g). Pour ce faire, on a multiplié la concentration massique mesurée de l’échantillon analysé par le facteur de dilution pour obtenir la concentration dans l’échantillon digéré d’origine. Cette concentration massique a ensuite été multipliée par le volume de l’échantillon digéré (25 mL), puis divisée par la masse pesée initiale de l’échantillon homogénéisé (la masse pondérée initiale est la masse de l’échantillon qui a été pesée dans la cuve de réaction pour la MAWD). Toutes les valeurs sont indiquées comme une moyenne de trois répétitions.

Le contenu rapporté des éléments ci-dessous est donné comme ± sm. La teneur en Cu, Mn et Zn dans l’échantillon de brocoli était de 5,9 ± 0,5 μg/g, 32,5 ± 2,7 μg/g et 42,8 ± 0,2 μg/g, respectivement. La concentration massique déterminée de Fe dans les échantillons de brocoli dépassait la limite supérieure de la plage de concentration linéaire de la courbe d’étalonnage (c.-à-d. 50,0 μg/L). Ainsi, la solution de l’échantillon a été diluée avec de l’eau ultrapure d’un facteur 2, et la mesure ICP-MS de cette solution a été effectuée. Les résultats ont montré que le brocoli contenait 63,0 ± 1,9 μg/g de Fe.

Pour le champignon, la teneur en Zn, Fe, Cu et Mn était de 35,6 ± 1,4 μg/g, 30,4 ± 1,3 μg/g, 18,5 ± 1,0 μg/g et 5,4 ± 0,3 μg/g, respectivement. Les saucisses contenaient 42,2 ± 0,9 μg/g de Fe, 25,1 ± 2,6 μg/g de Zn et 1,0 ± 0,1 μg/g de Cu. La détermination multi-éléments par ICP-MS de la solution digérée, qui a été diluée 10 fois, a montré que la concentration de Mn était inférieure à la limite inférieure de la plage de concentration linéaire (c.-à-d. 1,0 μg/L). Ainsi, la solution initiale de l’échantillon de saucisse n’a été diluée que d’un facteur 5, et la détermination multi-éléments avec ICP-MS a été répétée. La teneur en Mn dans les échantillons de saucisses a été déterminée comme étant de 0,9 ± 0,3 μg/g. Les nouilles contenaient 5,4 ± 2,8 μg/g de Zn, 10,3 ± 1,2 μg/g de Fe, 1,6 ± 0,3 μg/g de Cu et 7,5 ± 0,2 μg/g de Mn.

Le Rec pour tous les analytes mesurés dans les quatre échantillons était de l’ordre de 80,00 % à 120,00 %, ce qui indique la précision de la méthode d’analyse. Les calculs ont montré que la méthode analytique était précise, car les valeurs RSD étaient inférieures à 20,00 %, à l’exception de la RSD pour Zn dans les échantillons de nouilles. Les résultats sont présentés dans le tableau 2.

Figure 1 : Mélangeur de laboratoire utilisé pour l’homogénéisation des échantillons d’aliments. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Comparaison d’échantillons frais, séchés et homogénéisés. (A-D) Échantillons frais de brocoli, de champignons, de saucisses et de nouilles. (E-H) échantillons séchés de brocoli, de champignons, de saucisses et de nouilles. (I-L) a homogénéisé des échantillons de brocoli, de champignons, de saucisses et de nouilles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Pesée de l’échantillon sur une balance analytique. Cela se fait par le haut en ouvrant le rabat supérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Système à micro-ondes. Le système micro-ondes pour la digestion acide avec écran tactile latéral pour sélectionner les conditions de réaction et surveiller le processus de digestion acide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Composants utilisés pour la digestion acide assistée par micro-ondes. (A) Grille avec 14 récipients de réaction pour la digestion acide à l’intérieur de la chambre du four à micro-ondes. (B) Les cuves de réaction TFM-PTFE sont constituées de 3 parties. Une fois les récipients fermés par des couvercles, ni l’échantillon ni les gaz ne peuvent s’échapper ou pénétrer dans les récipients de réaction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : L’intérieur des récipients de réaction lorsqu’ils sont ouverts dans la hotte. (A) La coloration jaune-orange des fumées est due au NO2 produit lors de la digestion acide. (B) La coloration jaune de la solution de l’échantillon digéré après que la plupart des gaz se sont échappés de la cuve de réaction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Changement de température avec le temps. Un graphique montrant le changement de température en fonction du temps pendant la digestion acide avec MAWD. T2 représente la température du mélange réactionnel à l’intérieur des cuves de réaction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Ouverture des cuves de réaction sous la hotte, où des gaz jaune-orange sont libérés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Exemple de courbe d’étalonnage pour Mn. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Instrument ICP-MS utilisé pour la détermination multi-éléments. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Conditions de fonctionnement de l’instrument ICP-MS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Valeurs Rec et RSD du brocoli, des champignons, des saucisses et des nouilles. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.