Amélioration de la fiabilité des biobanques de tumeurs de la prostate grâce à une technique d’échantillonnage et une caractérisation histologique améliorées

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour faciliter le prélèvement d’échantillons de prostatectomie radicale. L’objectif est de cartographier, caractériser et micro-macro disséquer des échantillons de tissus à partir des échantillons sur la base de critères anatomopathologiques avant de les stocker dans une biobanque.

Résumé

L’acquisition d’échantillons de tissus tumoraux frais et bien caractérisés est essentielle pour mener des études « omiques » de haute qualité. Cependant, cela peut être particulièrement difficile dans le contexte du cancer de la prostate (CP) en raison de la nature unique de cet organe et de la grande hétérogénéité associée à cette tumeur. D’autre part, la caractérisation histopathologique des échantillons avant leur stockage sans provoquer d’altérations tissulaires importantes est également un défi intrigant. Dans ce contexte, nous présentons une nouvelle méthode d’acquisition, de cartographie, de caractérisation et de micro-dissection de tissu prostatique réséqué basée sur des critères anatomopathologiques.

Contrairement aux protocoles publiés précédemment, cette méthode réduit le temps nécessaire à l’analyse histopathologique de l’échantillon de prostate sans compromettre sa structure, ce qui est crucial pour l’évaluation des marges chirurgicales. De plus, il permet la délimitation et la micro-macro-dissection d’échantillons de tissus prostatiques frais, en mettant l’accent sur les zones tumorales histologiques définies par des critères pathologiques tels que le score de Gleason, les lésions précurseurs (néoplasie intra-épithéliale prostatique de haut grade - PIN) et les lésions inflammatoires (prostatite). Ces échantillons sont ensuite stockés dans une biobanque pour des analyses de recherche ultérieures.

Introduction

Le cancer de la prostate (CP) est le 2e^{cancer le plus} fréquent chez les hommes et la 5e cause de^{décès dans le} monde1. Le traitement et le pronostic du patient dépendent de la stadification et de la classification (score de Gleason) de la tumeur, comme en témoignent les taux de survie à 5 ans plus élevés des tumeurs localisées et de bas grade (grade de Gleason 6) (99%) par rapport aux grades de Gleason élevés et aux tumeurs métastatiques (31%)².

La rechute locale du PC et l’échec du traitement ont été liés à la forte hétérogénéité intratumorale génétique caractéristique de cette tumeur de type³. De plus, la PC est considérée comme une maladie multifocale avec plusieurs foyers tumoraux présentant différentes caractéristiques morphologiques, histologiques et moléculaires⁴, qui peuvent provenir indépendamment ou dériver d’un ancêtre commun des cellules tumorales⁵. Des études antérieures ont montré que l’évolution tumorale diffère entre les patients en fonction de facteurs génétiques spécifiques qui peuvent favoriser les métastases ou confiner la lignée cellulaire à la prostate⁵. Par conséquent, la caractérisation moléculaire des différents foyers tumoraux est cruciale non seulement pour fournir un diagnostic et un pronostic plus précis, mais aussi pour adapter un traitement efficace et personnalisé au patient.

Dans ce contexte, la recherche biomédicale et les approches multi-omiques intégratives offrent des opportunités sans précédent pour classer les cancers en différents sous-types, identifier des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques et découvrir des marqueurs liés à la réponse au traitement. De plus, ces approches contribuent à une meilleure compréhension de la biologie de cette maladie ^6,7. Les échantillons biologiques, qu’il s’agisse de tissus ou de biofluides, peuvent être analysés à l’aide de diverses plateformes multi-omiques (génomique, transcriptomique, protéomique, métabolomique, etc.) afin de découvrir les caractéristiques biologiques sous-jacentes à la physiopathologie du cancer, répondant ainsi aux limites actuelles liées à l’hétérogénéité génétique et phénotypique⁶. Cependant, il est important de considérer que la qualité des données dérivées des études omiques dépend de la qualité des échantillons prélevés sur les tumeurs, de leur caractérisation précise et du traitement et du stockage ultérieurs⁸.

Dans ce contexte, l’obtention de tissus PC frais pour la recherche présente un défi méthodologique en raison de la difficulté de réussir l’échantillonnage tumoral⁹. Les méthodes précédentes impliquaient un échantillonnage aléatoire après une prostatectomie radicale, ce qui donnait de mauvais résultats¹⁰. Cependant, des approches plus récentes intègrent des protocoles ciblés basés à la fois sur l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et les données de biopsie, ce qui améliore l’efficacité de la collecte d’échantillons tumoraux¹¹.

D’autre part, la caractérisation histopathologique des échantillons avant leur stockage sans altération tissulaire significative pose également un défi intéressant. Par conséquent, dans de nombreux cas, la détermination histopathologique des échantillons est effectuée après leur analyse (par exemple, analyse métabolomique RMN HR ¹H)¹². Cette pratique entraîne des dépenses inutiles, une perte de temps et la perte d’un nombre important d’échantillons qui sont finalement exclus de l’analyse (par exemple, des échantillons qui, après analyse histopathologique, s’avèrent ne pas être des échantillons tumoraux). Dans d’autres cas, la caractérisation histopathologique des échantillons est effectuée avant leur analyse. En fait, certaines études antérieures ont tenté de normaliser les méthodes pour fournir des échantillons de recherche représentatifs de haute qualité provenant d’échantillons de prostatectomie radicale pour la génomique et la métabolomique^13,14. Néanmoins, l’efficacité de l’échantillonnage est significativement plus élevée lorsqu’elle est réalisée à partir de coupes déjà confirmées histologiquement (88 %) qui perturbent les tissus, par rapport à des coupes non confirmées (45 %)¹.

Ici, une nouvelle méthodologie est présentée pour surmonter ces limitations, visant à obtenir des échantillons de PC frais et bien caractérisés avant leur stockage dans la Biobanque. Cette méthode a été développée grâce à des efforts de collaboration entre différents services cliniques (urologie, pathologie et biobanque de l’hôpital La Fe). Il est important de souligner que les biobanques jouent un rôle essentiel dans la collecte, le traitement, la conservation et le stockage des échantillons biologiques tout en garantissant la haute qualité des échantillons et des données, ainsi que le respect des exigences éthiques et légales ^8,15,16.

Protocole

Cette méthode a été développée grâce à des efforts de collaboration impliquant différents services cliniques (urologie, pathologie et biobanque de l’hôpital La Fe). L’étude a été menée dans le respect des directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain, et a reçu l’approbation du Comité d’éthique de la recherche biomédicale de l’Instituto de Investigación Sanitaria Hospital Universitario y Politécnico La Fe (Valence, Espagne). Tous les échantillons ont été conservés à la biobanque de l’hôpital de La Fe (PT13/0010/0026). La procédure générale est détaillée à la figure 1.

Figure 1 : Schéma général de la procédure. Représentation schématique de la procédure par étapes décrite dans la section protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Ciblage tumoral

1. Avant la chirurgie, utilisez l’imagerie par résonance magnétique multiparamétrique ou biparamétrique (mpMRI ou bpMRI)^17,18 pour localiser la tumeur et cartographier sa position dans la prostate. Combinez les informations obtenues de l’IRM avec les résultats de l’échographie transrectale ou de l’examen rectal si ce dernier donne des résultats discordants.
2. Pour améliorer la localisation de la tumeur, examinez les résultats des biopsies préopératoires de la prostate guidées par échographie et par IRM.
   REMARQUE : Dans la procédure de diagnostic du cancer de la prostate, les biopsies sont prélevées directement de la prostate par accès transrectal. Ces biopsies comprennent des prélèvements systématiques de la prostate (impliquant des cylindres répartis tout autour de la glande) et des cylindres directement ciblés sur les résultats suspects à l’IRM. Pour cibler la récupération de ces échantillons, l’échographie transrectale est utilisée, qui est combinée avec les résultats de l’IRM de manière cognitive (« fusion cognitive ») ou avec un « véritable logiciel de fusion IRM-échographie » lorsqu’il est disponible.

2. Prostatectomie radicale et prélèvement de la prostate

1. Effectuer une prostatectomie radicale standardisée assistée par robot par une approche transpéritonéale, en suivant les étapes décrites par Huynh et ^coll.19.
   1. Commencez par l’accès abdominal, l’insufflation et le placement du port de l’appareil photo (voir le tableau des matériaux). Placez les cinq ports restants sous vision directe. Réglez le pneumopéritoine à 12 mm.
   2. Relâchez la vessie en incisant le péritoine et disséquez l’espace périrectal.
   3. Ouvrez le fascia pelvien de chaque côté.
   4. Effectuez une dissection complète des aspects antérieurs et latéraux de la prostate et de la vessie.
   5. Effectuez l’ouverture du col de la vessie, identifiez et sectionnez l’urètre proximal pour accéder aux aspects postérieurs de la prostate et de la vessie.
   6. Disséquer les vésicules séminales et l’espace rectumal¹⁹.
   7. Disséquez les aspects latéraux de la prostate, en épargnant les faisceaux neurovasculaires.
   8. Assurer l’hémostase des vaisseaux dans l’espace rétropubien.
   9. Disséquez l’apex et sectionnez l’urètre distal.
   10. Compléter l’anastomose vésico-urétrale.
   11. Extraire la prostate et effectuer la fermeture de l’incision¹⁹.
2. Récupérez la prostate fraîche dans un récipient sec. Il est crucial de ne pas fixer ou enrober l’échantillon de paraffine à l’aide d’une parffine.
3. Transportez l’échantillon chirurgical frais, qui comprend toute la prostate, à la Biobanque pour le traitement de l’échantillon.

3. Traitement de la prostate et prélèvement d’échantillons

1. Sélectionnez les zones prostatiques ciblées pour l’échantillonnage en fonction des informations de localisation de la tumeur extraites de l’IRMmp préopératoire, des résultats de la biopsie préopératoire et de la palpation directe de l’échantillon de prostatectomie. Consigner ces renseignements sur un formulaire qui comprend les données d’identification du patient, les régions de la prostate finalement échantillonnées et le nombre d’échantillons prélevés.
   REMARQUE : Lorsque les résultats de l’IRM, les résultats de la biopsie préopératoire et la palpation directe de l’échantillon de prostatectomie sont concordants, ciblez tous les échantillons à cet endroit ou à ces endroits (entre 4 et 6 cylindres). En cas de discordance, augmentez le nombre de cylindres et ciblez séparément toutes les zones qui sont suspectes d’être affectées par l’une de ces méthodes.
2. À l’aide d’une aiguille automatique jetable (chirurgienne), prélever des échantillons cylindriques dans les zones sélectionnées (étape 1.1). Ensuite, identifiez (pathologiste) la zone extérieure du cylindre, serrez le cylindre avec une pince à tissus, placez-le sur une lame et marquez la zone extérieure avec de l’encre pour tissus. Répétez ce processus avec tous les cylindres pris.
3. Placez les cylindres collectés horizontalement sur un disque porte-échantillon (voir tableau des matériaux) rempli de milieu d’enrobage du cryostat et transférez-les sur le plateau de refroidissement du microtome pour la coupe.
4. Une fois placé sur le plateau, fixez le disque du porte-échantillon au mandrin de l’échantillon et coupez-le avec des mouvements soigneux de la roue en suivant les étapes suivantes :
   1. Utilisez le composé à température de coupe optimale (composé OCT, voir tableau des matériaux) pour enrober l’échantillon de tissu avant la coupe congelée sur un microtome-cryostat.
   2. Ensuite, coupez l’échantillon à l’aide d’un cryostat-microtome à -25 °C. Prélever de fines sections de tissu en forme de cylindre (10 μm) sur des lames de microscope traitées. Assurez-vous de ne collecter que quelques microns de tissu pour garantir une quantité adéquate de tissu tumoral intact pour le stockage dans la biobanque.
   3. Rassemblez deux ou trois sections minces par lame et colorez-les manuellement pour contrôler la coloration finale. L’œil du technicien assure une coloration optimale, et toute nouvelle coloration nécessaire peut être effectuée. Procédez comme suit
      1. Fixez les lames dans de l’éthanol à 96%, hydratez-les dans de l’eau distillée et colorez-les avec de l’hématoxyline Harris (voir le tableau des matériaux) pendant 1 min pour colorer les noyaux. Éliminez l’excès d’hématoxyline en rinçant les lames à l’eau distillée.
      2. Traitez les lames avec de l’hydroxyde d’ammonium à 30 % pour rendre l’hématoxyline bleue. Éliminez l’excès de solution avec des rinçages à l’eau distillée.
      3. Lames de coloration à l’éosine (voir tableau des matériaux) pendant 30 s.
      4. Ensuite, déshydratez les lames avec des titrages croissants d’alcool, clarifiez avec du xylène (100%), et montez-les avec du DPX (un mélange de distyrène, un plastifiant, et de xylène, utilisé comme support de montage de résine synthétique qui remplace le xylène-baume, voir le tableau des matériaux). Au cours de ces étapes, trempez les lames dans et retirez-les du pot de solution Coplin.
      5. Enfin, placez une lamelle sur le tissu coloré et utilisez un milieu avec un indice de réfraction approprié (voir le tableau des matériaux) pour l’observation au microscope.

4. Caractérisation de l’échantillon

1. Analysez l’échantillon au microscope optique (pathologiste), en discriminant les zones de carcinome et en déterminant le score de Gleason de la tumeur. Documentez toutes ces données et marquez les zones tumorales précises sur les lames.
2. Au cours de cette étape, étiquetez la lame avec l’emplacement précis de la tumeur et son score de Gleason^{respectif 20}. Marquez également l’emplacement du PIN (néoplasme intra-épithélial de la prostate) en fonction de l’identification morphologique.

5. Micro-macro-dissection et stockage de l’échantillon

1. Marquez clairement les différents composants histologiques avec des marqueurs distincts sur la lame (pathologiste) et corrélez-les directement avec les tissus congelés sur le disque.
2. Ensuite, à l’aide d’une lame chirurgicale, la macro-micro dissèque les zones de l’échantillon marquées sur la lame à l’intérieur du disque OCT, en les divisant en tissu tumoral, péritumoral, PIN et prostatique normal.
3. Lorsque le milieu d’enrobage commence à décongeler, manipulez le tissu avec une pince et placez-le dans des cryotubes correctement étiquetés.
   REMARQUE : Stocker soigneusement chaque fragment disséqué dans le tube correspondant, suite au diagnostic histologique des cryo-tranches.
4. Stocker les cryotubes marqués avec des échantillons histologiques entièrement caractérisés dans la biobanque à -80 °C pour une utilisation ultérieure dans des études de recherche.
   REMARQUE : Les étapes décrites dans cette section peuvent être effectuées par un technicien qualifié sous la supervision du pathologiste. L’échantillon chirurgical doit être transporté à la biobanque dès que possible afin d’éviter la dégradation des tissus et des acides nucléiques. Selon les guides de référence, des efforts doivent être faits pour éviter un temps d’ischémie prolongé (>30 min)²¹. Les échantillons peuvent être conservés indéfiniment dans la biobanque tant que les principes de qualité des échantillons sont respectés.

Résultats

Les résultats révèlent que cette technique a permis d’obtenir du matériel tumoral dans 61% des cas étudiés (25 cas sur 41) (Tableau 1).

Tableau 1 : Données histopathologiques des échantillons de l’étude. Résumé des données histopathologiques des échantillons utilisés dans l’étude. Le cylindre de diagnostic fait référence à l’échantillon de biopsie de la prostate obtenu à des fins de diagnostic, tandis que le cylindre traité correspond au cylindre obtenu à part...

Discussion

Dans toute étude de recherche, l’obtention d’échantillons de qualité est une condition essentielle pour réduire les biais systématiques et obtenir des résultats fiables²². Par conséquent, le contrôle des variables préanalytiques telles que la température à laquelle les échantillons sont traités et entreposés, le temps écoulé entre le prélèvement et l’entreposage des échantillons, l’utilisation de matériaux stérilisés ou les effets que l’ajout de conservateurs ou d’autres additifs peut avoir sur le...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pince à cadière	Intuitive	PN1052082-US 10/2021	Référence : 471049. 18 utilisations.
Lames conventionnelles	Knittel Glass	2021	Ground / Frosted end
Cryostat microtome	Thermo Fisher Scientific	---	Criostato CryoStar NX50
Cryotubes	Greiner Bio-One GmbH	Réf. : 122280.	CRYO S. PP, avec bouchon à vis, stérile.
Système chirurgical Da Vinci	Intuitif	PN1052082-US 10/2021	Modèle XI Instruments
dissection	Bayer	---	Deux pinces à épiler et une lame chirurgicale  ;
DPX Eukitt ;	Medizin- und Labortechnik GmbH	6.00.01.0001.06.01.01
Eosin	Agilent	157252
Pince bipolaire fenestrée	Intuitive	PN1052082-US 10/2021	Référence : 471205. 14 lives.
Force bipolar	Intuitive	PN1052082-US 10/2021	Référence : 471405. 12 utilisations.
Congélateurs	Thermo Scientific		MODEL 907. -80 º ; C
Hématoxyline	Agilent	157251
Inmunohistochimie Lames	Agilent-Dako	K802021-2
Tourne-aiguille grand Intuitive		PN1052082-US 10/2021	Référence : 471006. 15 utilisations.
Pince bipolaire Maryland	Intuitive	PN1052082-US 10/2021	Référence : 471172. 14 utilisations.
Microscope	Olympus	---	Olympus cx40
Lames microtomes	PFM Medical	a35
Ciseaux incurvés monopolaires	Intuitive	PN1052082-US 10/2021	N° de référence : 470179. 10 utilisations.
Composé OCT	NEG-50	LOT.117340
PlusSpeed S Appareil de biopsie à usage unique avec pointe biseautée	Peter Pflugbeil GmbH  ;	PSS-1825-S
Pince ProGasp	Intuitive	PN1052082-US 10/2021	Référence : 471093. 18 utilisations.
Porte-échantillon Disque	Davidson Cryo Chuck. BradleyProducts		30 mm  ;
Encre pour tissus	Pelikan	2021	Encre 4001 noir brillant (301168)
Xylol	Quimipur	Réf. 169