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Article de méthode

Bio-impression 3D d’hydrogels photoaccordables pour étudier l’activation des fibroblastes

2.4K vues

DOI :

10.3791/65639

30 juin 2023

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit comment bio-imprimer en 3D des hydrogels photoaccordables pour étudier le raidissement de la matrice extracellulaire et l’activation des fibroblastes.

Résumé

Les hydrogels photoaccordables peuvent se transformer spatialement et temporellement en réponse à l’exposition à la lumière. L’incorporation de ces types de biomatériaux dans des plateformes de culture cellulaire et le déclenchement dynamique de changements, tels que l’augmentation de la rigidité microenvironnementale, permettent aux chercheurs de modéliser les changements dans la matrice extracellulaire (MEC) qui se produisent au cours de la progression de la maladie fibrotique. Dans cet article, une méthode de bio-impression 3D d’un biomatériau hydrogel photoaccordable capable de deux réactions de polymérisation séquentielles dans un bain de support de gélatine est présentée. La technique de bio-impression FRESH (Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels) a été adaptée en ajustant le pH du bain de support pour faciliter une réaction d’addition de Michael. Tout d’abord, la bio-encre contenant du méthacrylate de poly(éthylène glycol)-alpha (PEGαMA) a réagi hors stœchiométrie avec un agent de réticulation dégradable par cellule pour former des hydrogels mous. Ces hydrogels mous ont ensuite été exposés à un photo-initateur et à la lumière pour induire l’homopolymérisation des groupes qui n’ont pas réagi et rigidifier l’hydrogel. Ce protocole couvre la synthèse d’hydrogel, la bio-impression 3D, le phototiffening et la caractérisation des paramètres pour évaluer l’activation des fibroblastes dans les structures 3D. La méthode présentée ici permet aux chercheurs de bio-imprimer en 3D une variété de matériaux qui subissent des réactions de polymérisation catalysées par le pH et pourraient être mis en œuvre pour concevoir divers modèles d’homéostasie, de maladie et de réparation des tissus.

Introduction

La bio-impression 3D est une technologie transformatrice qui permet aux chercheurs de déposer avec précision des cellules et des biomatériaux dans des volumes 3D et de recréer la structure hiérarchique complexe des tissus biologiques. Au cours de la dernière décennie, les progrès de la bio-impression 3D ont permis de créer des tissus cardiaques humains battants1, des modèles fonctionnels des tissus rénaux2, des modèles d’échange gazeux dans les poumons3 et des modèles tumoraux pour la recherche sur le cancer4. L’invention des techniques de bio-impression 3D embarquée, telle....

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Protocole

1. Synthèse et caractérisation de PEGαMA

REMARQUE : La synthèse du poly(éthylène glycol)-alpha méthacrylate (PEGαMA) a été adaptée de Hewawasam et al. et réalisée dans des conditions sans humidité9.

  1. Peser les réactifs.
    REMARQUE : Par exemple, peser 5 g de PEG-hydroxyle à 8 bras (PEG-OH) de 10 kg/mol et 0,38 g d’hydrure de sodium (NaH) (voir le tableau des matériaux).
  2. Ajouter une barre d’agitation dans une fiole Schlenk de 250 ml et purger avec de l’argon.
  3. Dissoudre le PEG-OH dans le plus faible volume de tétrahydrofurane anhydre (THF) nécessa....

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Résultats

Ce protocole décrit comment bio-imprimer en 3D des hydrogels photoaccordables dans un bain de support pour créer des constructions capables de raidissement dynamique et temporel pour étudier l’activation des fibroblastes dans des géométries qui imitent les tissus humains. Tout d’abord, le protocole expliquait comment synthétiser le PEGαMA, l’épine dorsale de ce système polymère photoaccordable. Les mesures de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) ont montré une fonctionnalisation réussie de PEGαMA à 96,5.......

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Discussion

Les réactions de polymérisation en deux étapes en réponse à une exposition contrôlée à la lumière peuvent rigidifier les biomatériaux avec un contrôle spatial et temporel. Plusieurs études ont exploité cette technique pour évaluer les interactions cellule-matrice dans diverses plateformes 5,8,9,10,11,21,22,23.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer. Des parties de ce manuscrit sont reproduites avec la permission d’IOP © Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf. 5 Tous droits réservés.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Adam Feinberg (Université Carnegie Mellon) et ceux qui ont organisé l’atelier 3D Bio-Printing Open-Source. Ces personnes ont permis d’apprendre les techniques de bio-impression FRESH et de construire la bio-imprimante 3D utilisée pour ces études. De plus, les auteurs tiennent à remercier Biorender.com, qui a été utilisé pour produire des figures dans ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par de multiples groupes ou sources de financement, notamment la Rose Community Foundation (DDH et CMM), une bourse de recherche sur les maladies vasculaires pulmonaires du Colorado (DDH et CMM), la National Science Foundation sous le prix 19414....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit radiomètre/photomètre AccuMaxSpectronics CorporationXPR-3000Pour mesurer l’intensité lumineuse, utilisé pour la photo-tiffation
de l’acide acétique  ;Fisher ScientificBP2401-500Utilisé lors de la synthèse de PEGaMA
AcétoneFisher ScientificA184Utilisé avec les cryosections
ActinGreen 488 ReadyProbesFisher ScientificR37110Utilisé pour la coloration de
la feuille d’aluminiumReynoldsF28028
Tétrahydrofurane anhydre (THF)Sigma-Aldrich401757-1LUtilisé lors de la synthèse PEGaMA
Gaz comprimé d’argonAirgasAR R300Utilisé lors de la synthèse PEGaMA
8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyle (PEG-OH)JenKem Technology8ARM-PEG-10KUtilisé lors de la synthèse PEGaMA
Filtre passe-bande 365 nmEdmund Optics65-191Utilisé pour la photo-consolidation
l’albumine sérique bovine (BSA)Fisher ScientificBP9700-100Utilisé pendant le processus de coloration
Buchner FunnelQuark GlassQFN-8-14Utilisé pendant la synthèse de PEGaMA
Calcein AMInvitrogen65-0853-39Utilisé pendant le processus de coloration
Celite 545 (Aide à la filtration)EMD MilliporeCX0574-1Utilisé pendant la synthèse de PEGaMA
Lames de microscope chargéesGlobe Scientific1358W
Chloroform-dSigma-Aldrich151823-10X0.75MLUtilisé pour caractériser PEGaMA
Click-iT Plus EdU Cell Prolifération KitInvitrogenC10637Utilisé pour la coloration de
tubes coniques de 50 mLCELLTREAT667050B
Kit de sécurité cryogéniqueCole-ParmerEW-25000-85
CryostatLeicaCM 1850-3-1
Tubulure de dialyseRepligen132105
4',6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542-1MGUtilisé pour la coloration de
l’éther diéthyliqueFisher ScientificE1384Utilisé lors de la synthèse du PEGaMA
1,4-Dithiothreitol (DTT)  ;Sigma-Aldrich10197777001Bioink, le
médium modifié de Dulbecco (DMEM)CytivaSH30271.
Papier filtreWhatman1001-090Utilisé lors de la synthèse PEGaMA
Freezone 2.5L Système de lyophilisationLabconcoLA-2.5LRLyophilizer
Fusion 360AutodeskN/ATéléchargement de logiciel
2.5 mL Seringue étanche au gazHamilton81420Utilisé pour la bio-impression
Calibre 15 1.5" IT Series AstuceJensen GlobalJG15-1.5XUtilisé pour la bio-impression
Calibre 30 0.5" Pointe de la série HPJensen GlobalJG30-0.5HPXUtilisé pour la bio-impression
chèvre Anti-souris Alexa Fluor 555 AnticorpsFisher ScientificA21422Utilisé pour la coloration
GlycineFisher ScientificC2H5NO2Utilisé pendant le processus de coloration
HémocytomètreFisher Scientific1461
HoechstThermo Scientific62249Utilisé pendant le processus de coloration
fibroblastes adventiels de l’artère pulmonaire humaine (HPAAFs)AcceGenABC-TC3773  ;D’un patient de 2 ans
Acide chlorhydrique (HCl)Fisher ScientificA144-500Utilisé pour ajuster le pH des solutions
ImageJNational Institutes of Health (NIH)N/ATéléchargement gratuit du logiciel
ImmEdge® ; PenVector LaboratoriesH-4000Utilisé pendant le processus de coloration
IncubateurVWRVWR51014991
LifeSupport Suspension de microparticules de gélatine (Suspension de gélatine)Advanced Biomatrix5244-10GMUtilisé pour la bio-impression
Microscope optiqueOlympusCKX53Microscope à lumière inversée
Lithium Phényl-2,4,6-Triméthylbenzoylphosphinate ( LAP)Sigma-Aldrich900889-5GPhotoinitiateur utilisé pour la photo-tiffation
de l’azote liquideN/AN/A
LulzBot Mini 2  ;LulzBotN/ABio-imprimante adaptée
Méthacryloxyéthyle Thiocarbamoyl Rhodamine B  ;Polysciences inc.669775-30-8
2-MethylbutaneSigma-AldrichM32631-4L
Microman Pistons capillaires CP1000VWR76178-166Pointes de pipette à déplacement positif
MMP2 Réticulant dégradable (KCGGPQGIWGQGCK)GL BiochemN/ABioink component
Souris Anti-Humain &alpha ;SMA Anticorps monoclonalFisher ScientificMA5-11547Utilisé pour la coloration
OmniCure Série 2000  ; SourceLumen Dynamics S2000-XLAutilisée pour le photo-raidissement
du paraformaldéhyde (PFA)  ;Microscopie électronique Sciences15710Utilisé pour fixer des échantillons
PH-mètreMettler Toledo  ;FP20  ;
Bandelettes de pHCytiva10362010
solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Hyclone Laboratories, Inc.Cytiva SH30256.
FS Jeu de pipettesFisher Scientific14-388-100
10 & micro ; L Pointes de pipetteUSA Scientific1120-3710
20 µ ; L Pointes de pipetteUSA Scientific1183-1510
200 µ ; L Pointes de pipetteUSA Scientific1111-0700
1000 & micro ; L pointes de pipetteUSA Scientific1111-2721
Méthacrylate de poly(éthylène glycol)-alpha (PEG&alpha ; MA)N/AN/AReportez-vous au manuscrit pour les étapes de synthèse
Poly(Oxyde d’éthylène) (PEO)Sigma-Aldrich372773-250GComposant de bioencre
Pipette à déplacement positifFisher ScientificFD10004G100-1000 & micro ; L
Hydroxyde de potassium (KOH)Sigma-Aldrich221473-500GUtilisé pour ajuster le pH des solutions
ProLong Gold Antifade ReagentInvitrogenP36930Utilisé pendant le processus de coloration
PronterfaceAll3DPN/ATéléchargement
du logiciel Propidium IodideSigma-AldrichP4864-10MLUtilisé pour la coloration
du peptide RGD (CGRGDS)GL BiochemN/ABioink component
RockerVWR10127-876
Évaporateur rotatif  ;Thomas Scientific11100V2022Utilisé lors de la synthèse de PEGaMA
Agrafesà élastique 808659
Flacon Schlenk  ;Kemtech AmericaF902450Utilisé lors de la synthèse de PEGaMA
Slic3rSlic3r N/ATéléchargement du logiciel
Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKitLonzaCC-3182Le kit contient les composants CC-3181 et CC-4149
Hydrure de sodium  ;Sigma-Aldrich223441-50GUtilisé lors de la synthèse de PEGaMA
Centrifugeuse Sorvall ST 40R FisherScientific75-004-525
Barre d’agitationVWR58948-091
Filtre à seringueVWR28145-483Utilisé pour les solutions de filtration stériles
T-75 Fiole traitée pour culture tissulaireVWR82050-856Utilisé pour les travaux
Tissue-Tek CyromoldSakura4557
Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT)Sakura4583
Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP)Sigma-AldrichC4706-2G
Triton X-100Fisher BioreagentsC34H622O11Utilisé pendant le processus de coloration
Trypan BlueSigma-AldrichT8154-20MLUtilisé pour la culture cellulaire travail
0,05 % Trypsine-EDTAGibco25-300-062Utilisé pour les travaux de culture cellulaire
Tween 20Fisher BioreagentsC58H114O26Utilisé pendant le processus de coloration
Microscope verticalOlympusBX63FCapacités du microscope fluorescent
Bain d’eauPolyScienceWBE20A11B
Plaques de culture tissulaire à 24 puitsCorningRéférence 3527
de FS de des de lumière UV de culture cellulaire

Références

  1. Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217(2022).
  2. Lin, N. Y. C., et al.

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Bioencre d hydrogelMatrice extracellulaireBain de support en g latineR action de polym risationMicroscopie confocaleRigidit microenvironnementaleMod les de maladies fibrotiques