Les virus pseudotypés (PV) sont des virions défectueux de réplication qui sont utilisés pour étudier les interactions hôte-virus dans des conditions plus sûres que la manipulation de virus authentiques. Nous présentons ici un protocole détaillé qui montre comment les PV du SRAS-CoV-2 peuvent être utilisés pour tester la capacité de neutralisation du sérum des patients après la vaccination contre la COVID-19.
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Article de méthode
Virus pseudotypés en tant qu’outil moléculaire pour surveiller les réponses immunitaires humorales contre le SRAS-CoV-2 via un test de neutralisation
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Les virus pseudotypés (PV) sont des outils moléculaires qui peuvent être utilisés pour étudier les interactions hôte-virus et pour tester la capacité neutralisante d’échantillons de sérum, en plus de leur utilisation plus connue en thérapie génique pour l’administration d’un gène d’intérêt. Les PV sont défectueux dans la réplication car le génome viral est divisé en différents plasmides qui ne sont pas incorporés dans les PV. Ce système sûr et polyvalent permet l’utilisation de PV dans des laboratoires de niveau de biosécurité 2. Nous présentons ici une méthodologie générale pour produire des PV lentiviraux à partir de trois plasmides mentionnés ici : (1) le plasmide de squelette portant le gène rapporteur nécessaire au suivi de l’infection ; (2) le plasmide d’emballage portant les gènes de toutes les protéines structurelles nécessaires à la génération des PV ; (3) le plasmide d’expression de la glycoprotéine de surface de l’enveloppe qui détermine le tropisme du virus et intervient dans l’entrée virale dans la cellule hôte. Dans ce travail, la pointe du SRAS-CoV-2 est la glycoprotéine d’enveloppe utilisée pour la production de lentivirus pseudotypés non réplicatifs du SRAS-CoV-2.
Brièvement, les cellules d’emballage (HEK293T) ont été co-transfectées avec les trois plasmides différents à l’aide de méthodes standard. Après 48 h, le surnageant contenant les PV a été récolté, filtré et stocké à -80 °C. L’infectiosité des PV du SRAS-CoV-2 a été testée en étudiant l’expression du gène rapporteur (luciférase) dans une lignée cellulaire cible 48 h après l’infection. Plus la valeur des unités de luminescence relative (RLU) est élevée, plus le taux d’infection/transduction est élevé. De plus, les PV infectieux ont été ajoutés aux échantillons de sérum dilués en série pour étudier le processus de neutralisation de l’entrée des pseudovirus dans les cellules cibles, mesuré par la réduction de l’intensité du RLU : des valeurs inférieures correspondant à une activité neutralisante élevée.
Introduction
Les virus pseudotypés (PV) sont des outils moléculaires utilisés en microbiologie pour étudier les interactions hôte-virus et pathogène-pathogène 1,2,3,4. Les PV sont constitués d’une partie interne, le noyau viral qui protège le génome viral, et d’une partie externe, les glycoprotéines d’enveloppe à la surface du virus qui définissent le tropisme5. Un pseudovirus est incompétent en matière de réplication dans la cellule cible car il ne contient pas toute l’information génétique nécessaire pour générer de nouvelles pa....
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Protocole
Le présent protocole a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Université de Vérone (protocole d’approbation numéro 1538) et suit les directives de celui-ci. Le consentement écrit éclairé des sujets humains participant à l’étude a été obtenu. Des échantillons de sang total ont été prélevés sur des volontaires du personnel de santé qui étaient en train de recevoir des vaccins contre le SRAS-CoV-2. Ces échantillons ont été prélevés dans des tubes en plastique contenant des anticoagulants pour l’isolement ultérieur du sérum15.
Tous les processus suivants doivent être effectués dans une hotte biologique de classe 2, tr....
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Résultats
Ce protocole décrit la production de PV du SARS-CoV-2 et une application en aval de ces PV pour analyser l’activité de neutralisation du sérum/plasma des sujets recevant un vaccin anti-COVID-1917. De plus, ce protocole peut être appliqué pour produire des pseudotypes de chaque variant préoccupant du SRAS-CoV-2 (COV) afin de tester l’évolution de la réponse neutralisante. Bien que ce protocole facilite l’étude de la réponse immunitaire humorale après la vaccination contre la COVID-19, il peut être .......
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Discussion
Bien que l’utilisation d’un virus de type sauvage simule l’infection réelle, les PV lentiviraux sont une option plus sûre pour étudier les mécanismes associés à l’entrée virale et à l’infection sans les exigences de sécurité strictes nécessaires pour travailler avec des virus pathogènes 4,20,21. Les PV sont composés d’un noyau viral défectueux en réplication entouré de la glycoprotéine d’enveloppe de surface d’un virus pathogène.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous reconnaissons la contribution des travailleurs de la santé bénévoles. Ce projet a été soutenu par le Département d’Excellence 2023/2027, MUR, Italie. L’AR et la DZ ont été soutenues par PRIN2022 (financements de l’UE ; NextGenerationEU)
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,45 &mu ; Filtre m | SARSTEDT | 83 1826 | |
| Plaque à 6 puits | SARSTEDT | 83 3920 | |
| Plaque à 96 puits | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Unités de filtration centrifuge Amicon Ultra-15 Merck | 10403892 | ||
| Noir Opaque 96 puits Microplaque | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium ; | SIGMA-ALDRICH | D6546 - 500ML | |
| Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Sérum fœtal bovin | AUROGENE | AUROGENE AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | Dans le manuscrit, nous remplaçons le nom commercial par 'programme d’analyse de données’HEK293T |
| cellules | ATCC | CRL-3216 | |
| La HEK293T | CRL-3216 | a été transduite pour surexprimer l’ACE2 avec un vecteur lentiviral. | |
| L-glutamine ; | Luminomètre AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| - Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | Dans le manuscrit, nous remplaçons le nom commercial par ; 'luminomètre' ; |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | Scientific 11058021 | Dans le manuscrit, nous remplaçons le nom commercial par « milieu sérique réduit ». |
| p8.91 emballage plasmide | Di Genova et al., 2021 | Un aimable cadeau du Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| plasmide rapporteur pCSFLW | Di Genova et al., 2021 | Un cadeau aimable du Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Pénicilline/streptomycine | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyéthylénimine, ramifiée (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | Ce plasmide a été utilisé pour générer le plasmide exprimant le spicule HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | Dans le manuscrit, nous avons remplacé le nom commercial par 'réactif de lecture de la luciférase’Trypsine |
| EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
Références
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963(2012).
- Pouget, M., et al.
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Réimpressions et autorisations
