Article de méthode

Détermination de l’activité procoagulante de la vésicule extracellulaire (EV) à l’aide du temps de coagulation activé par EV (EV-ACT)

DOI :

10.3791/65661

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4 août 2023

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1Key Laboratory of Post-Neurotrauma Neurorepair and Regeneration in Central Nervous System, Ministry of Education and Tianjin Neurological Institute, Tianjin Medical University General Hospital, 2Department of Neurosurgery, Tianjin Medical University General Hospital, 3Department of Neurosurgery, Tianjin Huanhu Hospital, 4Department of Medical Oncology, Tianjin Medical University General Hospital

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole étudie l’utilisation d’un plasma riche en vésicules extracellulaires (VE) comme indicateur de la capacité de coagulation de l’EV. Le plasma riche en VE est obtenu par un processus de centrifugation différentielle et de recalcification ultérieure.

Résumé

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Le rôle des vésicules extracellulaires (VE) dans diverses maladies fait l’objet d’une attention accrue, notamment en raison de leur puissante activité procoagulante. Cependant, il y a un besoin urgent d’un test au chevet du patient pour évaluer l’activité procoagulante de la VE en milieu clinique. Cette étude propose l’utilisation du temps d’activation de la thrombine du plasma riche en VE comme mesure de l’activité procoagulante des VE. Des procédures normalisées ont été utilisées pour obtenir du sang total contenant du sodium et du sang total, suivies d’une centrifugation différentielle pour obtenir du plasma riche en VE. Le plasma riche en VE et le chlorure de calcium ont été ajoutés à la coupelle d’essai, et les changements de viscoélasticité ont été surveillés en temps réel à l’aide d’un analyseur. Le temps de coagulation naturel du plasma riche en VE, APPELÉ EV-ACT, a été déterminé. Les résultats ont révélé une augmentation significative de l’EV-ACT lorsque l’EV a été retiré du plasma obtenu à partir de volontaires sains, tandis qu’elle a considérablement diminué lorsque l’EV a été enrichie. De plus, l’EV-ACT a été considérablement raccourci dans les échantillons humains de prééclampsie, de fracture de la hanche et de cancer du poumon, ce qui indique des niveaux élevés d’EV plasmatique et une promotion de l’hypercoagulation sanguine. Grâce à sa procédure simple et rapide, EV-ACT est prometteur en tant que test de chevet pour évaluer la fonction de coagulation chez les patients présentant des taux plasmatiques élevés d’EV.

Introduction

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La thrombose, qui est causée par l’hypercoagulabilité, joue un rôle important dans diverses maladies, notamment les traumatismes cérébraux1, la pré-éclampsie2, les tumeurs3 et les patients fracturés4. Le mécanisme sous-jacent à l’hypercoagulabilité est complexe, et l’accent a récemment été mis sur le rôle des vésicules extracellulaires (VE) dans les troubles de la coagulation. Les VE sont des corps en forme de vésicule avec une structure bicouche qui se détache de la membrane cellulaire, dont le diamètre varie de 10 nm à 1000 nm. Ils sont associés à divers processus pathologiques, en particulier les troubles de la coagulation5. Plusieurs études ont identifié les VE comme un prédicteur prometteur du risque de thrombose 6,7. L’activité procoagulante des VE dépend de l’expression des facteurs de coagulation, principalement le facteur tissulaire (TF) et la phosphatidylsérine (PS). Les VE ayant une activité procoagulante robuste améliorent considérablement l’efficacité catalytique du complexe ténase et prothrombine, favorisant ainsi le fibrinogène médié par la thrombine et la thrombose locale8. Des niveaux élevés de VE et leur relation causale avec l’hypercoagulabilité ont été observés dans de nombreuses maladies9. Par conséquent, la normalisation de la détection des VE et de la déclaration de leur activité procoagulante est un domaine d’investigation important10.

À ce jour, seuls quelques kits commerciaux sont disponibles pour détecter l’activité procoagulante des VE. Le test MP-Activity et le test MP-TF, produits par une société commerciale, sont des tests fonctionnels utilisés pour mesurer l’activité procoagulante de l’EV dans le plasma11. Ces tests utilisent un principe similaire à celui des tests immuno-enzymatiques pour détecter le PS et le TF sur les VE. Cependant, ces kits sont coûteux et limités à quelques institutions de recherche de haut niveau. Le processus est complexe et prend beaucoup de temps, ce qui rend difficile leur mise en œuvre en milieu clinique. De plus, un test de phospholipides procoagulants (PPL) mis au point dans le commerce mélange du plasma sans PS avec du plasma d’essai, mesurant le temps de coagulation pour détecter quantitativement les niveaux de VE PS-positifs12. Cependant, ces essais se concentrent principalement sur le PS et le TF sur les VE, en négligeant d’autres voies de coagulation dans lesquelles les VE circulants peuvent être impliqués dans12.

Le système de coagulation plasmatique est complexe et comprend à la fois des composants « invisibles » et « visibles », notamment des coagulants, des anticoagulants, des systèmes fibrinolytiques et des VE en suspension dans le plasma. Physiologiquement, ces composants maintiennent un équilibre dynamique. Dans des conditions pathologiques, une augmentation significative des VE dans la circulation contribue à l’hypercoagulabilité, en particulier chez les patients souffrant de traumatismes crâniens, de prééclampsie, de fractures et de divers types de cancer13. Actuellement, l’évaluation de l’état de la coagulation dans les laboratoires cliniques implique principalement l’évaluation du système de coagulation, du système d’anticoagulation et de la fibrinolyse 14,15,16,17. Le temps de prothrombine, le temps de thromboplastine partielle activée, le temps de thrombine et le rapport normalisé international sont couramment utilisés pour évaluer les niveaux de facteurs de coagulation dans le système de coagulation18. Cependant, des études récentes ont révélé que ces tests ne reflètent pas entièrement l’hypercoagulabilité de certaines maladies19. D’autres méthodes de dosage, telles que la thromboélastométrie (TEG), la TEG rotationnelle et l’analyse Sonocolot, mesurent les changements viscoélastiques du sang total20,21. Étant donné que les échantillons de sang total contiennent de nombreuses cellules sanguines et plaquettes, ces tests sont plus susceptibles d’indiquer l’état de coagulation de l’échantillon dans son ensemble. Certains chercheurs ont fait état du rôle des cellules sanguines et des plaquettes dans l’activité procoagulante22,23. Une étude récente a également révélé que les tests de fonction de coagulation antérieurs ont des difficultés à détecter les changements dans l’activité procoagulante des microparticules24. Par conséquent, une hypothèse a été proposée selon laquelle la fonction procoagulante des VE peut être évaluée par des mesures viscoélastiques du temps de coagulation activée (ACT) dans le plasma riche en VE.

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Protocole

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La collecte d’échantillons humains a été approuvée par le Comité d’éthique médicale de l’hôpital général de l’Université médicale de Tianjin. La collecte de sang veineux humain a strictement suivi les directives émises par la Commission nationale de la santé de Chine, à savoir WS/T 661-2020 Directive pour la collecte d’échantillons de sang veineux. Brièvement, du sang a été prélevé sur des personnes en bonne santé avec le consentement éclairé de la veine brachiale antérieure, et les échantillons ont été mélangés à l’aide d’un anticoagulant à 3,2% de citrate de sodium dans un rapport de 1 :9. Lorsque seuls des échantillons d’anticoagulant à base de citrate de sodium ont été prélevés, le premier récipient de collecte a été jeté. Le flux de traitement a été initié dans les 0,5 h suivant le prélèvement de l’échantillon. Des sujets adultes en bonne santé ont été recrutés pour le prélèvement d’échantillons après avoir obtenu un consentement éclairé. Les critères d’exclusion des patients étaient : (1) une thrombose intravasculaire récente, (2) une altération de la fonction hépatique et rénale, (3) une hypertension, une hyperlipidémie, un diabète et d’autres maladies chroniques, (4) un traitement à l’aspirine ou à l’anticoagulant, (5) des menstruations et une grossesse.

1. Isolement du plasma riche en VE

  1. Centrifuger les échantillons à 120 x g pendant 20 min à température ambiante pour éliminer les cellules sanguines. Le surnageant est un plasma riche en plaquettes. Ensuite, transférez la moitié supérieure du surnageant dans un nouveau tube à centrifuger à l’aide d’une pipette.
  2. Centrifuger le plasma riche en plaquettes à 1500 x g pendant 20 min à température ambiante pour éliminer les plaquettes. Le surnageant est un plasma pauvre en plaquettes. Transférez ensuite la moitié supérieure du surnageant dans un nouveau tube à centrifuger.
  3. Centrifuger le plasma pauvre en plaquettes à 13000 x g pendant 2 min à température ambiante pour éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est un plasma riche en VE. Ensuite, transférez la moitié supérieure du surnageant dans un nouveau tube à centrifuger pour des tests ultérieurs.

2. Détection de l’EV-ACT de l’échantillon par l’analyseur

  1. Mettez l’analyseur de caillots en marche (voir tableau des matériaux) et préchauffez l’appareil à 37 °C. Installez la sonde jetable et le gobelet de test, puis lancez la procédure de contrôle qualité de la machine.
    REMARQUE : Lorsque la valeur du signal de résistance visqueuse à l’écran est affichée en ligne droite, cela signifie que la détection n’est pas perturbée et que le contrôle qualité de l’état de l’analyseur est qualifié. La procédure de test peut être lancée une fois l’autotest qualifié.
  2. Entrez les informations de l’échantillon dans le système. Ensuite, transférez 200 μL de plasma riche en VE dans le godet d’essai, suivis de 20 mM 170 μL de chlorure de calcium. Cliquez sur le bouton Démarrer. La tige d’agitation magnétique dans la tasse d’essai mélangera complètement l’échantillon et le chlorure de calcium. Fermez le couvercle et la sonde commencera à détecter le changement de résistance de l’échantillon.
    REMARQUE : Une fois le test terminé, l’analyseur affichera automatiquement « test terminé ». L’heure de l’EV-ACT est affichée et enregistrée par le système. Le résultat est exprimé dans l’unité de temps « seconde ». Jetez la sonde et testez la coupe.

3. Contrôle de la qualité basé sur la cytométrie en flux de l’échantillon de plasma riche en VE

  1. Les VE ont d’abord été identifiés par leur taille (0,1 à 1 μm). Ajustez les paramètres du cytomètre en flux à l’avance et réglez la « porte » de l’EV à l’aide de billes de polystyrène disponibles dans le commerce (0,5, 0,9 et 3,0 μm) (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : Le mélange de billes est constitué de sphères fluorescentes de différents diamètres couvrant la gamme de tailles des microvésicules (0,5 et 0,9 μm) et des plaquettes (0,9 μm et 3 μm).
  2. Ajustez la tension de la diffusion directe et de la diffusion latérale et assurez-vous que les microsphères de 0,9 μm tombent dans la région appropriée. La région EV peut être dessinée en fonction du diamètre de la microsphère.
  3. Transférez 50 μL de plasma riche en VE dans le tube d’écoulement, suivis de 450 μL de solution saline tampon phosphate filtrée. Mélangez soigneusement le liquide dans le tube d’écoulement. Enfin, détecter les échantillons à l’aide de la cytométrie en flux25.
  4. Utilisez les particules fluorescentes Ultra Rainbow (voir le tableau des matériaux) pour quantifier le nombre de EVs.In bref, ajoutez 10 μL de particules à l’échantillon avant la détection de l’écoulement et calculez la concentration EV à l’aide de la formule suivante une fois la détection de l’échantillon terminée : 10 120 * IL (#) / (microbilles * volume) * facteur de dilution26.

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Résultats

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Le temps d’activation de la thrombine du plasma riche en VE a été mesuré à l’aide d’un analyseur viscoélastique pour la mesure du temps de coagulation plasmatique. La machine se compose de quatre composants principaux : un convertisseur de signal électronique, une sonde, un réservoir de détection et un élément chauffant (Figure 1A,B). La sonde utilise des oscillations à haute fréquence et à faible amplitude pour détecter les changements de viscosité du plasma. Le contrôle de...

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Discussion

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Dans cette étude, la préparation de plasma riche en VE a été décrite, et la rationalité de la méthode a été vérifiée à l’aide de la cytométrie en flux. Par la suite, les échantillons de plasma recalcifié ont été analysés pour le temps d’ACT à l’aide d’un analyseur de caillots basé sur les principes de viscoélasticité24. Comme le montre la figure 3A, on a constaté que la concentration de VE obtenue par ultracentrifugation raccourcissait le temps d’EV-ACT, tandis que le...

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Déclarations de divulgation

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Tous les auteurs ont déclaré qu’il n’y avait pas de conflits d’intérêts potentiels.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine, subvention n° 81930031, 81901525. De plus, nous remercions Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. pour nous avoir fourni des machines et des conseils techniques.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Particules fluorescentes AccuCount Ultra Rainbow3,8 microm ; Spherotech, Lake Forest, IL, États-UnisPour la détection quantitative du
chlorure de calciumWerfen (Chine 002000680020 mM
Century Caillotanalyzer Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., LtdLe principe est de mesurer la viscosité du plasma par méthode viscoélastique
Sonde jetable et gobelet de testTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
Cytomètre en flux LSR FortessaBD, USAUtilisé pour détecter les
billes de polystyrèneMegamix Biocytex, Marseille, France7801Le Megamix se compose d’un mélange de microbilles de diamètres sélectionnés : 0,5 & micro ; m, 0,9 et micro ; m et 3 µ ;m.
MP MP

Références

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  1. Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
  2. Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).
  3. Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346(2022).
  4. You, D., et al. Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis. Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).
  5. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
  6. Zang, X., et al. Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400(2023).
  7. Chen, Y., et al. Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty. Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).
  8. Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505(2021).
  9. Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).
  10. Cointe, S., et al. Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).
  11. Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348(2014).
  12. Mooberry, M. J., et al. Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).
  13. Zhao, Z., et al. Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury. Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).
  14. Bolliger, D., Tanaka, K. A. Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).
  15. Ganter, M. T., Hofer, C. K. Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices. Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).
  16. Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review. Chest. 151 (1), 127-138 (2017).
  17. Maier, C. L., Sniecinski, R. M. Anticoagulation monitoring for perioperative physicians. Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).
  18. Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics. Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).
  19. Tsantes, A. G., et al. Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry. International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).
  20. Premkumar, M., et al. COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study. BMJ Open. 12 (5), e051971(2022).
  21. Sakai, T. Comparison between thromboelastography and thromboelastometry. Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).
  22. Yan, M., et al. TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia. Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666(2022).
  23. Yu, H., et al. Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release. The FASEB Journal. 35 (9), e21808(2021).
  24. Gao, Y., et al. MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374(2023).
  25. Wang, J., et al. Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice. Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).
  26. Tan, J., et al. Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282(2021).
  27. Kubo, H. Extracellular vesicles in lung disease. Chest. 153 (1), 210-216 (2018).
  28. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and Extracellular Vesicles. Current Hypertension Reports. 18 (9), 68(2016).
  29. Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis. Life Science. 236, 116861(2019).
  30. Shi, J., Gilbert, G. E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).
  31. Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium. Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).
  32. Frey, B., Gaipl, U. S. The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).
  33. Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. Platelet removal by single-step centrifugation. Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).
  34. Chen, Y., et al. Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study. BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).
  35. Liu, Y., et al. The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404(2022).
  36. Piwkham, D., et al. The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis. Heliyon. 9 (1), e12714(2023).
  37. Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).

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