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Article de méthode

Analyse de la fonction mitochondriale chez un mutantB9-Null de Drosophila melanogaster PINK1 à l’aide de la respirométrie à haute résolution

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DOI :

10.3791/65664

⸱

10 novembre 2023

 ,  , 
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences, Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry, Federal University of Santa Maria

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole de respirométrie à haute résolution pour analyser la bioénergétique chez les mouches des fruits mutantes PINK1B9-null. La méthode utilise le protocole SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Résumé

Les maladies neurodégénératives, y compris la maladie de Parkinson (MP), et les perturbations cellulaires telles que le cancer sont quelques-uns des troubles qui perturbent le métabolisme énergétique avec une altération des fonctions mitochondriales. Les mitochondries sont des organites qui contrôlent à la fois le métabolisme énergétique et les processus cellulaires impliqués dans la survie et la mort cellulaires. Pour cette raison, les approches d’évaluation de la fonction mitochondriale peuvent offrir des informations importantes sur les conditions cellulaires dans les processus pathologiques et physiologiques. À cet égard, les protocoles de respirométrie à haute résolution (HRR) permettent d’évaluer l’ensemble de la fonction de la chaîne respiratoire mitochondriale ou l’activité de complexes mitochondriaux spécifiques. De plus, l’étude de la physiologie mitochondriale et de la bioénergétique nécessite des modèles génétiquement et expérimentalement traitables tels que Drosophila melanogaster.

Ce modèle présente plusieurs avantages, tels que sa similitude avec la physiologie humaine, son cycle de vie rapide, sa facilité d’entretien, sa rentabilité, ses capacités de débit élevées et un nombre réduit de préoccupations éthiques. Ces attributs en font collectivement un outil inestimable pour disséquer des processus cellulaires complexes. Le présent travail explique comment analyser la fonction mitochondriale à l’aide du mutantB9-null de Drosophila melanogaster PINK1. Le gène pink1 est responsable du codage de la kinase présumée 1 induite par PTEN, par un processus reconnu sous le nom de mitophagie, qui est crucial pour l’élimination des mitochondries dysfonctionnelles du réseau mitochondrial. Des mutations de ce gène ont été associées à une forme familiale autosomique récessive précoce de la maladie de Parkinson. Ce modèle peut être utilisé pour étudier le dysfonctionnement mitochondrial impliqué dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson.

Introduction

Les mitochondries sont des organites cellulaires qui contrôlent des fonctions importantes, notamment la régulation apoptotique, l’homéostasie calcique et la participation aux voies de biosynthèse. En possédant du matériel génétique autonome, ils sont capables de contribuer aux processus de maintenance et de réparation cellulaires. Leur structure abrite la chaîne de transport d’électrons et la phosphorylation oxydative, toutes deux cruciales pour l’énergie cellulaire 1,2,3. En particulier, le contrôle de l’énergie est obtenu grâce à la production d’adénosine triphosphate (ATP) par phosphorylation oxydative (OXPHOS)2. La perturbation du métabolisme énergétique avec altération des fonctions mitochondriales se produit à la fois dans la survie et la mortcellulaire4,5, fréquemment associée à un large éventail de pathologies humaines, telles que le cancer, et les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (MP)3,6.

La maladie de Parkinson est un trouble chronique, progressif et neurologique. La cause principale de cette maladie est la mort des cellules cérébrales, en particulier dans la substance noire, qui sont responsables de la production du neurotransmetteur dopamine, qui contrôle le mouvement 6,7,8. La première observation qui a lié le parkinsonisme au dysfonctionnement mitochondrial a été faite en 1988, dans des modèles expérimentaux utilisant des toxines qui inhibent la chaîne respiratoire Complexe I9.

À l’heure actuelle, il existe plusieurs méthodes pour évaluer le dysfonctionnement mitochondrial 10,11,12,1 3 ; cependant, par rapport aux approches conventionnelles, la respirométrie à haute résolution (HRR) présente une sensibilité et des avantages supérieurs13,14. Par exemple, les protocoles HRR permettent d’évaluer l’ensemble de la fonction de la chaîne respiratoire mitochondriale ou l’activité de complexes mitochondriaux spécifiques14,15. Les dysfonctionnements mitochondriaux peuvent être évalués dans des cellules intactes, des mitochondries isolées, ou même ex vivo 10,11,13,14.

Les dysfonctionnements mitochondriaux sont étroitement associés à de nombreux processus pathologiques et physiologiques. Il est donc important d’étudier la physiologie mitochondriale et la bioénergétique à l’aide de systèmes modèles génétiquement et expérimentalement traitables. À cet égard, la recherche sur Drosophila melanogaster, la mouche des fruits, présente plusieurs avantages. Ce modèle partage des caractéristiques et des processus cellulaires fondamentaux avec les humains, y compris l’utilisation de l’ADN comme matériel génétique, des organites communs et des voies moléculaires conservées impliquées dans le développement, l’immunité et la signalisation cellulaire. De plus, les mouches des fruits ont un cycle de vie rapide, un entretien facile, un faible coût, un débit élevé et moins de préoccupations éthiques, constituant ainsi un outil inestimable pour disséquer les processus cellulaires complexes 16,17,18,19,20.

De plus, un homologue du gène de la kinase 1 putative induite par PTEN (pink1) est exprimé chez D. melanogaster. Il joue un rôle crucial dans l’élimination des mitochondries endommagées par le processus de mitophagie8. Chez l’homme, les mutations de ce gène prédisposent les individus à une forme familiale autosomique récessive de la maladie de Parkinson associée à un dysfonctionnement mitochondrial 8,21,22,23. Par conséquent, la mouche des fruits est un modèle animal puissant pour les études sur la physiopathologie de la maladie de Parkinson et le criblage de candidats-médicaments axés sur le dysfonctionnement mitochondrial et la bioénergétique. Par conséquent, le présent travail explique comment analyser la fonction mitochondriale dans un modèle de MP de D. melanogaster en utilisant la technique HRR dans l’OROBOROS avec le protocole SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

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Protocole

Nous avons utilisé les souches w1118 (blanches) et w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (appelées Pink1B9) (FlyBase ID : FBgn0029891) du centre de stockage de Bloomington Drosophila (numéro d’identification : 34749). Dans cette étude, les mutants mâles de D. melanogaster PINK1B9-null sont comparés aux mâles de D. melanogaster de la souche w1118, qui est utilisée comme groupe témoin (patrimoine génétique). D’autres paramètres doivent être analysés de manière concomitante avec les expériences de respirométrie pour s’assurer que les mouches ont le génotype correct (Pink1B9/Y), tels que les déformations du thorax et les problèmes de locomotion, qui sont bien décrits pour les mouches mutantes roses1B9 24,25,26.

1. Animaux et logement

  1. Conservez les mouches dans des bouteilles en verre contenant 10 mL d’alimentation standard (levure 1,73 %, farine de soja 0,9 %, farine de maïs 7,3 %, gélose 0,5 %, sirop de maïs 7,6 % et acide propionique 0,48 %) à température et humidité constantes (25 °C et 60 %, respectivement), avec un cycle lumière/obscurité de 12 h : 12 h.
  2. Pour chaque expérience, utilisez deux mouches âgées de 1 à 3 jours après l’éclosion.
    NOTE : Les mouches femelles vierges mutantes PINK1B9-null ont été croisées avec des mâles w1118 pour obtenir les mâles F1 avec le génotype Pink1B9/Y.

2. Préparation de l’échantillon

  1. Préparez le tampon MiR05 comme décrit dans le Tableau 1.
  2. Anesthésier les mouches sur de la glace et les transférer dans des tubes de microcentrifugation (deux mouches par tube).
  3. Dans chaque tube, ajouter 200 μL de tampon MiR05 réfrigéré et homogénéiser les mouches. Homogénéiser manuellement, en appliquant une légère pression (environ 4 à 6 coups de pilon) pour éviter la désintégration des mitochondries.

3. Étalonnage de respirométrie à haute résolution des capteurs polarographiques d’oxygène

REMARQUE : Les chambres OROBOROS ont un volume total d’environ 2 mL. Un étalonnage est nécessaire pour s’assurer que le flux d’oxygène est proche de 0 pmol pour commencer le test.

  1. En commençant l’étalonnage, ajoutez 2 mL de MiR05 dans la chambre. Couvrez la chambre avec le bouchon en ne laissant aucune bulle d’air ; Ensuite, tirez délicatement sur le bouchon pour former une seule bulle d’air.
  2. Ouvrez le logiciel OROBOROS Dat.Lab. Entrez une température de 25 °C dans le champ Température du bloc et cliquez sur Se connecter à l’Oxygraph-2k (Figure 1A).
  3. Cliquez et sélectionnez le dossier dans lequel l’étalonnage doit être enregistré et cliquez sur Enregistrer.
  4. Lorsqu’une nouvelle fenêtre s’ouvre, nommez l’expérience et les échantillons (en cas d’étalonnage, entrez simplement le nom de l’étalonnage) et cliquez sur Enregistrer.
  5. Allez dans le menu Mise en page et choisissez la première option : 01 Exp. d’étalonnage Gr.3 - Temp comme indiqué à la Figure 1B.
  6. Attendez que le programme redirige vers la disposition d’étalonnage, attendez que la ligne rouge affiche une ligne droite standard avec des points autour de 0 pmol. Ensuite, sélectionnez deux points : l’un pour la chambre A et l’autre pour la chambre B (Figure 1C) lorsque la ligne rouge est exactement à zéro.
    REMARQUE : Les points sélectionnés doivent avoir un flux d’oxygène (ligne rouge) autour de 0.
    1. Pour marquer les points des deux chambres, sélectionnez la concentration O2 à droite de l’écran, sélectionnez le point marqué et copiez les valeurs de température et de pression barométrique par rapport au point. Collez ces valeurs dans les cases ci-dessous et cliquez sur Calibrer et copier dans le presse-papiers dans le coin inférieur droit de l’écran, comme illustré à la figure 2.
    2. Effectuez ce processus pour les deux chambres (A et B), puis allez dans le menu Fichier et sélectionnez Enregistrer et déconnecter.
      REMARQUE : Après le processus d’étalonnage, le programme redirigera l’utilisateur vers l’écran d’accueil afin que le logiciel soit prêt à démarrer le test HRR. Pour ce test, nous utiliserons le protocole SUIT.

4. Protocole SUIT

  1. Une fois l’étalonnage terminé, retirez les bouchons et ouvrez les chambres.
  2. Lavez les bouchons (en tenant l’embout qui ne touche pas l’échantillon) et les chambres avec 100 % d’éthanol, 70 % d’éthanol et de l’eau distillée, dans cet ordre.
    REMARQUE : Répétez le processus pour chaque changement d’échantillon.
  3. Homogénéiser les mouches dans 200 μL de tampon, placer tout le contenu de l’échantillon dans la chambre à l’aide d’une micropipette et déplacer le bouchon dans la chambre en prenant soin de ne pas créer de bulles d’air.
    REMARQUE : Si des bulles d’air se forment, retirez délicatement le bouchon et ajoutez 100 μL de tampon MIR05.
  4. Cliquez sur le menu Mise en page et sélectionnez l’option 05 Débit par volume corrigé comme illustré à la figure 1B.
  5. Attendez d’être redirigé vers une nouvelle fenêtre. Cliquez sur Enregistrer pour sélectionner le dossier dans lequel l’expérience doit être enregistrée.
  6. Attendez qu’une nouvelle fenêtre s’ouvre. Nommez l’expérience dans l’espace Code expérimental. Ensuite, nommez chaque échantillon dans sa chambre A et B respective dans le champ Échantillon , et définissez l’unité de champ sur unité.
    REMARQUE : D’autres unités peuvent également être choisies, par exemple, Millions de cellules ou mg.
  7. Étant donné que ce protocole utilise deux mouches (2 unités) et que le volume de la chambre est de 2 mL, dans le champ Concentration , définissez 1 par mL (Figure 1D).
    REMARQUE : Ici, la quantité d’échantillon a été normalisée en fonction du nombre de mouches ; cependant, cette normalisation peut être effectuée par la teneur en protéines de l’échantillon, la quantification de l’ADN mitochondrial ou l’activité de la citrate synthase.
  8. Lorsque le signal de flux d’oxygène (ligne rouge) est stable sur la valeur positive, commencez le protocole HRR avec le titrage des substrats, des inhibiteurs et des découpleurs (Figure 3). Tous les réactifs et équipements suivants sont présentés dans le tableau 1.
    1. Ajouter de la digitonine (5 μg/mL) pour perméabiliser la membrane mitochondriale.
    2. Ajoutez des substrats de pyruvate (5 mM), de malate (2 mM) et de proline (10 mM) et attendez que le flux d’oxygène augmente et se stabilise. Pour marquer l’événement de chaque ajout de réactif, appuyez sur la touche F4 du clavier et entrez le nom de chaque réactif.
    3. Ajouter de l’ADP (5mM) pour coupler la chaîne respiratoire mitochondriale et attendre l’augmentation et la stabilisation du flux d’oxygène.
    4. Ajouter le succinate (10 mM) et attendre l’augmentation et la stabilisation du flux d’oxygène.
    5. Ajoutez de l’oligomycine (2,5 μM) pour inhiber l’ATP synthase et rechercher une diminution du flux d’oxygène.
    6. Attendez que la ligne rouge se stabilise et découplez le transfert d’électrons mitochondriaux à l’aide de cyanure de carbonyle-4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) avec des titres de 0,25 μM jusqu’à ce que la consommation maximale d’oxygène soit atteinte, démontrée par l’élévation de la ligne rouge. Après avoir stabilisé le flux d’oxygène, commencez à ajouter les inhibiteurs de chaque complexe, un à la fois.
    7. Ajouter de la roténone (0,5 μM), un inhibiteur du complexe I. Attendez la diminution et la stabilisation du flux d’oxygène pour ajouter l’inhibiteur suivant.
    8. Ajouter du malonate (5 mM), un inhibiteur du complexe II. Attendez la diminution et la stabilisation du flux d’oxygène pour ajouter l’inhibiteur suivant.
    9. Enfin, ajoutez de l’antimycine (2,5 μM), un inhibiteur du complexe III. Attendez la diminution suivie de l’augmentation et de la stabilisation du flux d’oxygène.
      REMARQUE : Le flux d’oxygène devrait se stabiliser à une valeur positive mais inférieure à la valeur de la dernière inhibition des complexes protéiques mitochondriaux.
  9. À la fin de l’analyse, retirez tout le contenu des chambres à l’aide d’une micropipette. Conserver à -20 °C pour une analyse ultérieure, si nécessaire.

5. Analyse des données

  1. Utiliser un progiciel statistique approprié pour l’analyse des données.
  2. Effectuez des tests t pour évaluer les différences entre les deux groupes. Pour les situations impliquant plusieurs traitements, utilisez l’analyse de variance (ANOVA) comme test statistique 27.
  3. Extrayez les valeurs de flux d’O2 à partir du graphique généré par le logiciel. OXPHOS CI fait référence à la valeur du flux d’O2 après l’ajout d’ADP. OXPHOS CII est obtenu en soustrayant OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII est la valeur du flux d’O2 extrait après l’ajout de succinate. ETS CI&CII est la valeur du flux O2 après l’ajout de FCCP. ETS CI = FCCP - Roténone et ETS CII = Roténone - Malonate.
  4. Calculer la synthèse de l’ATP comme la différence entre l’OXPHOS (P) et la FUITE (L) (P - L)28.
  5. Déterminer le rapport de contrôle respiratoire (RCR) en calculant le rapport OXPHOS/LEAK, où RCR = P/L.11

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Résultats

Ici, nous constatons que le flux d’O2 dans les états OXPHOS CI (P = 0,0341) et OXPHOS CI&II (P = 0,0392) est réduit chez les mouches nulles PINK1B9 par rapport aux mouches témoins (Figure 4). Ce résultat a également été observé dans les résultats précédents de notre groupe29,30.

L’IC et l’IC sont des composants clés du système de transport d’électrons (ET...

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Discussion

La HRR est une technique puissante pour étudier la respiration mitochondriale et le métabolisme énergétique chez D. melanogaster et d’autres organismes. Il fournit une évaluation détaillée et quantitative de la fonction mitochondriale, permettant aux chercheurs de mieux comprendre la bioénergétique des cellules. Le protocole présenté ici décrit l’évaluation de la fonction de la chaîne respiratoire mitochondriale et de l’activité de complexes mitochondriaux spécifiques à l’aide du protocole SUIT chez D. melan...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Les auteurs remercient l’agence brésilienne Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) et T.D. (#88887.512883/2020-00) sont récipiendaires d’une bourse de recherche.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ADPSigma-AldrichA5285Adénosine 5&prime ;-diphosphate sal sodique (numéro CAS 72696-48-1) ; 95%; Poids moléculaire = 501,31 g/mol.
Á ; garKasvK25-1800Pour utilisation bactériologique
Antimycine-ASigma-AldrichA8674Antimycine A de Streptomyces sp. (numéro CAS 1397-94-0) ; poids moléculaire  ; 540 g/mol ;
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA7030Albumine sérique bovine (numéro CAS 9048-46-8) ; pH 7,0 &ge ; 98 %
Logiciel DatlabOroboros Instruments, Innsbruck, Autriche20700Logiciel pour l’acquisition et l’analyse de données
DigitoninSigma-AldrichD 5628Numéro CAS 11024-24-1
Eau
distilléeDrosophila melanogaster souche w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3Obtenu du centre de stock de Drosophila de Bloomington
Drosophila melanogaster souche  ; w1118Obtenu  ; de l’Université fédérale de Santa Maria
EGTASigma-AldrichE8145Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-acide tétraacétique (numéro CAS 13638-13-3) ; 97%; masse moléculaire = 468,28 g/mol
FCCPSigma-AldrichC2920Cyanure de carbonyle 4- (trifluorométhoxy)phénylhydrazone  ; (numéro CAS 370-86-5) ; &ge ; 98 % (TLC), poudre  ;
GraphPad Prism version 8.0.1.Logiciel d’acquisition et d’analyse de données
HepesSigma-AldrichH4034-(2-Hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique (numéro CAS 7365-45-9) ; 99,5 % (titrage), testé sur culture cellulaire ; masse moléculaire = 238,30 g/mol
Respiromètre haute résolution Oxygraph O2KOroboros Instruments, Innsbruck, Autriche10022-02Startup O2K respirometer
kit KH2PO4Sigma-AldrichP5379Phosphate monopotassique (numéro CAS 7778-77-0) ; Reagente Plus, poids moléculaire = 136,09 g/mol
KOHSigma-Aldrich211473Hydroxyde de potassium (numéro CAS 1310-58-3) ; réactif ACS, &ge ; 85 %, granulés Malate
Sigma-AldrichM1296Acide malonique (numéro CAS 141-82-2) ; 99 %, poids moléculaire = 104,06 g/mol). Le pH d’une solution est ajusté à environ 7,0.
Acide maliqueSigma-AldrichM1000(S)-(&minus ;)-Acide 2-hydroxysuccinique (numéro CAS 97-67-6) ; &ge ; 95% ; poids moléculaire = 134,09 g/mol
d’acideSigma-AldrichM3671(numéro CAS 4432-31-9) ; &ge ; 99 % (titrage) ; masse moléculaire = 195,24 g/mol
Chlorure de magnésium MgCl2Sigma-AldrichM8266(numéro CAS 7786-30-3) ; anhydre, &ge ; 98 %, poids moléculaire = 95,21 g/mol
Tubes à microcentrifugerEppendorf
O2K-Titration KitOroboros Instruments, Innsbruck, Autriche20820-03Seringues Hamilton de différents volumes
OligomycineSigma-AldrichO 4876Oligomycine de  ; Streptomyces diastatochromogenes (numéro CAS 1404-19-9) ; &ge ; 90 % d’oligomycines totales à base (HPLC)
Pistil à homogénéisation
ProlineSigma-AldrichP0380L-Proline (numéro CAS 147-85-3) ; poudre ; 99 % ; poids moléculaire = 115,13 g/mol
PyruvateSigma-AldrichP2256Pyruvate de sodium (numéro CAS 113-24-6), &ge ; 99%; masse moléculaire = 110,04 g/mol
RotenoneSigma-AldrichR8875Rotetone (numéro CAS 83-79-4) ; &ge ; 95 %, poids moléculaire 394,42 g/ mol
SuccinateSigma-AldrichS 2378Succinate de sodium dibasique hexahydraté (numéro CAS 6106-21-4) ; &ge ; 99 %
SaccharoseMerck107,651,000Saccharose à usage microbiologique (numéro CAS 57-50-1)
TaurineSigma-AldrichT0625Numéro CAS 107-35-7
4 2-(N-morpholino)éthanesulfonique MES

Références

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Mutant nul PINK1consommation d oxyg nedysfonctionnement mitochondrialsyst me de transfert d lectronssynth se d ATPmaladies neurod g n rativesbio nerg tique mitochondriale
Analyse de la fonction mitochondriale chez un mutantB9-Null de Drosophila melanogaster PINK1 à l’aide de la respirométrie à haute résolution
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