Microscopie à deux photons sensible à la polarisation pour une caractérisation de la structure amyloïde sans marquage

Summary

Cet article décrit comment la microscopie à deux photons sensible à la polarisation pourrait être appliquée pour caractériser l’organisation locale au sein de superstructures-sphérolites amyloïdes sans marquage. Il décrit également comment préparer et mesurer l’échantillon, assembler la configuration requise et analyser les données pour obtenir des informations sur l’organisation locale des fibrilles amyloïdes.

Abstract

Par rapport à son homologue à un photon, l’excitation à deux photons est bénéfique pour les expériences de bio-imagerie en raison de sa phototoxicité plus faible, de sa pénétration tissulaire plus profonde, de son fonctionnement efficace dans les systèmes densément emballés et de la photosélection angulaire réduite des fluorophores. Ainsi, l’introduction de l’analyse de polarisation en microscopie à fluorescence à deux photons (2PFM) permet une détermination plus précise de l’organisation moléculaire d’un échantillon par rapport aux méthodes d’imagerie standard basées sur des processus optiques linéaires. Dans ce travail, nous nous concentrons sur la 2PFM sensible à la polarisation (ps-2PFM) et son application dans la détermination de l’ordre moléculaire au sein de bio-structures complexes-sphérolites amyloïdes. Les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson sont souvent diagnostiquées par la détection d’agrégats amyloïdes-protéines formés en raison d’un processus de mauvais repliement des protéines. L’exploration de leur structure permet de mieux comprendre leur parcours de création et, par conséquent, de développer des méthodes de diagnostic plus sensibles. Cet article présente le ps-2PFM adapté à la détermination de l’ordre local des fibrilles à l’intérieur des sphérulites d’insuline bovine et des agrégats de protéines amyloïdogènes sphériques. De plus, nous démontrons que la technique proposée permet de résoudre l’organisation tridimensionnelle des fibrilles à l’intérieur de la spherulite.

Introduction

Au cours des dernières décennies, bien qu’il y ait eu un développement significatif de nombreuses techniques de microscopie à fluorescence pour la bio-imagerie des protéines et de leurs agrégats¹, seules quelques-unes ont été utilisées pour résoudre leur ordre local au sein de l’échantillon ^2,3. La microscopie d’imagerie à durée de vie de fluorescence⁴ a été utilisée pour étudier l’hétérogénéité structurale intrinsèque des superstructures-sphérolites amyloïdes. De plus, la détermination quantitative de l’ordre local à l’intérieur de biostructures complexes et densément emballées telles que les sphérulites pourrait être résolue à l’aide de méthodes sensibles à la polarisation³. Cependant, les techniques de fluorescence standard avec pénétration superficielle des tissus sont limitées car l’utilisation de longueurs d’onde UV-VIS pour exciter les fluorophores in vivo conduit à une diffusion élevée de la lumière tissulaire⁵. De plus, une telle imagerie nécessite souvent de concevoir et de lier des sondes fluorescentes spécifiques à une biomolécule ciblée, ce qui augmente le coût et la quantité de travail nécessaire pour effectuer l’imagerie.

Récemment, pour résoudre ces problèmes, notre équipe a adapté la microscopie à fluorescence excitée à deux photons sensible à la polarisation (ps-2PFM) pour l’imagerie sans marquage des structures biologiques ^6,7. Ps-2PFM permet de mesurer la dépendance de l’intensité de la fluorescence à deux photons sur la direction de polarisation linéaire du faisceau d’excitation et d’analyser la polarisation de la fluorescence émise⁸. La mise en œuvre de cette technique nécessite de compléter le chemin d’excitation standard du microscope multiphotonique (Figure 1) par une plaque demi-onde pour contrôler le plan de polarisation de la lumière. Ensuite, des graphiques polaires, illustrant la dépendance de l’intensité de fluorescence excitée à deux photons sur la polarisation du faisceau laser d’excitation, sont créés à partir de signaux collectés par deux photodiodes à avalanche, rassemblant ainsi les deux composantes mutuellement perpendiculaires de la polarisation de fluorescence.

La dernière étape est le processus d’analyse des données, en tenant compte de l’impact des éléments optiques, tels que les miroirs dichroïques ou un objectif à grande ouverture numérique, sur la polarisation. En raison de la nature du processus à deux photons, cette méthode permet à la fois une photo-sélection angulaire réduite et une résolution axiale améliorée, car l’excitation à deux photons des fluorophores en dehors du plan focal est limitée de manière probabiliste. Il a également été prouvé que des méthodes similaires pouvaient être mises en œuvre avec succès pour l’imagerie in vivo de sondes dans le proche infrarouge (NIR) pour l’imagerie des tissus profonds⁹. Le Ps-2PFM a déjà été appliqué à l’imagerie des fluorophores dans les membranes cellulaires¹⁰ et l’ADN^11,12, ainsi qu’à des marqueurs fluorescents non standard de systèmes biologiques, tels que les nanoparticules d’or¹³. Cependant, dans tous ces exemples, l’information sur l’organisation des biomolécules a été obtenue indirectement et a nécessité une orientation mutuelle prédéfinie entre un fluorophore et une biomolécule.

Dans l’un de nos articles récents, nous avons montré que le ps-2PFM pouvait être appliqué avec succès pour déterminer la polarisation locale de l’autofluorescence des superstructures amyloïdes et de la fluorescence de la thioflavine T, un colorant spécifique de l’amyloïde, lié aux fibrilles amyloïdes dans les sphérulites⁶. De plus, dans un autre cas, nous avons prouvé que le ps-2PFM pouvait être utilisé pour détecter l’orientation des fibrilles amyloïdes à l’intérieur des sphérulites amyloïdes dans un régime de taille submicronique, ce qui a été confirmé en le corrélant avec l’imagerie par microscopie électronique à transmission (MET)⁷. L’obtention de ce résultat a été possible grâce à i) l’autofluorescence intrinsèque des sphéroulites-amyloïdes, lorsqu’elles sont excitées avec un ou deux photons, présente une autofluorescence intrinsèque avec des maxima d’émission situés dans une gamme de 450 à 500 nm et des sections efficaces d’absorption à deux photons comparables à celles des colorants fluorescents standard¹⁴, ii) des modèles mathématiques introduits précédemment pour décrire comment le ps-2PEF des colorants marquant les membranes biologiques et les structures de l’ADN pourrait être appliqué à fluorescence manifestée par les sphérulites et les colorants qui leur sont liés ^8,11,15. Ainsi, avant de procéder à l’analyse, nous vous recommandons vivement de consulter la théorie requise décrite à la fois dans le texte principal et les informations à l’appui de notre premier article sur ce sujet⁶. Nous présentons ici le protocole d’application de la technique ps-2PFM pour une caractérisation structurale amyloïde sans marquage des sphérulites d’insuline bovine.

Protocol

1. Préparation des lames de microscope avec des sphérulites adultes

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole. Toutes les solutions ont été préparées avec de l’eau déminéralisée (18,2 MΩ·cm à 25 °C) obtenue à partir du système de purification de l’eau.

1. Incuber les sphérulites amyloïdes selon le protocole décrit par Krebs et al¹⁶. avec quelques modifications, comme décrit ci-dessous.
   1. Peser 10 mg d’insuline en poudre dans un tube de 1,5 ml.
   2. Dissoudre la poudre avec une aliquote de 1 mL de la solution déminéralisée_H2O/HCl (pH 1,5).
   3. Scellez l’échantillon avec le ruban adhésif et mettez-le dans un mélangeur thermique pour incuber pendant 24 h à 70 °C (0 tr/min).
      REMARQUE : Pour effectuer l’imagerie des amyloïdes dans leur environnement d’origine (c’est-à-dire hydraté) et prévenir la déformation de l’échantillon due à la déshydratation, il est nécessaire de préparer des lames de microscope selon la description suivante (schéma illustré à la figure 2).
2. Lavez soigneusement la lame en verre du microscope avec de l’eau.
3. Trempez les lames dans du méthanol et laissez-les sécher dans des conditions ambiantes sur une lingette sans poussière.
4. Prélever une aliquote de 100 μL de la solution de sphérulite dans le tube à l’aide d’une pipette automatique (étape 1.1.2) et l’ajouter au puits situé dans la zone centrale de la lame de microscope.
5. Recouvrez la solution d’une lamelle, en évitant la formation de bulles d’air.
6. Déposer le support le long des bords de la lamelle sur la lame à l’aide d’une pipette automatique pour sceller la solution native des sphérulites.
   REMARQUE : Il est très important de déposer le support de glissière à la fois sur la lamelle et sur les surfaces de glissière. Faites-le sous le capot fumant en raison de la toxicité du solvant volatil (xylène). Voir l’encadré de la figure 2.
7. Laissez l’échantillon du microscope dans des conditions ambiantes pour que le produit de montage durcisse.
   REMARQUE : Le processus de durcissement dépend de la température et de l’humidité, mais doit être terminé dans les 12 heures.
8. Vérifiez si les sphérulites d’insuline ont été formées correctement à l’aide d’un microscope optique polarisé (POM) avec des polariseurs croisés. Parcourez l’échantillon à la recherche d’un motif caractéristique de zones lumineuses, appelé croix de Malte, comme le montre la figure 3.
   NOTE : Les sphérulites amyloïdes peuvent être définies comme des superstructures sphériques caractérisées par une morphologie hétérogène avec une structure noyau-coquille. Dans le détail, ils sont composés d’un noyau amorphe et de fibrilles amyloïdes à croissance radiale¹⁶. En raison du caractère anisotrope des structures de sphérulite, elles peuvent interagir de manière distincte avec la lumière polarisée (par exemple, par réfraction) et modifier leur phase, ce qui peut être facilement observé sous POM avec des polariseurs croisés. Cette méthode n’a été utilisée que pour étudier les sphérulites complètement développées caractérisées par un motif de croix de Malte de type modèle. Par conséquent, les agrégats ou les sphérulites structurellement déformés ont été exclus des recherches ultérieures.

2. Construire et aligner le système

REMARQUE : Une représentation schématique d’un microscope à deux photons sensible à la polarisation se trouve à la figure 1.

1. Installez un laser femtoseconde avec une accordabilité de la longueur d’onde de sortie dans la plage de 690 à 1 080 nm, par exemple, fonctionnant sur un laser Ti :Sapphire à verrouillage de mode avec des impulsions ~100 fs et un taux de répétition de 80 MHz.
2. Ajoutez une plaque demi-onde montée sur une platine de rotation sur le chemin d’excitation de l’installation pour contrôler la polarisation de la lumière incidente dans le plan d’échantillonnage du microscope XY.
3. Installez le miroir dichroïque pour couper le faisceau d’excitation de l’optique de détection.
   NOTE : Les caractéristiques optiques d’un miroir dichroïque doivent permettre de réfléchir le faisceau d’excitation (vers l’échantillon) dans la gamme de longueurs d’onde NIR et d’être simultanément transparentes pour la gamme de longueurs d’onde correspondant à l’émission des échantillons.
4. Installez une platine de balayage piézoélectrique pour les balayages raster dans le plan XY pour un Z choisi.
5. Montez l’objectif d’immersion à NA élevé, par exemple, un objectif d’immersion d’huile apochromatique 100x/1,4 NA.
   REMARQUE : Comme l’ensemble de l’installation fonctionne en mode épi-fluorescence, les signaux incidents et émis passent par le même objectif.
6. Dans le chemin d’émission, ajoutez un séparateur de faisceau polarisant qui divise l’émission excitée à deux photons en deux composantes polarisées orthogonalement (I_X et I_Y)
7. Installez deux photodiodes à avalanche (APD) comptant les photons dans une configuration leur permettant de collecter la lumière transférée et réfléchie à l’aide du séparateur de faisceau, respectivement (Figure 1).
8. Montez des filtres de coupure dépendants de la longueur d’onde sur le chemin d’excitation et d’émission du système, par exemple, un filtre passe-long de 800 nm directement dans le chemin optique d’excitation et un filtre passe-court de 700 dans le chemin d’émission.
   REMARQUE : Analysez les spectres d’émission de la sphérulite afin que toute contribution potentielle de la génération de deuxième harmonique (SHG) ou de la lumière laser puisse être exclue à l’aide des filtres d’émission appropriés. Il convient également de noter que ce système devrait également permettre des mesures de SHG sensibles à la polarisation, ce qui pourrait être utilisé pour résoudre l’ordre des biomolécules dans les échantillons. Cependant, l’analyse des données du signal SHG diffère de la fluorescence, qui, plus en détail, a été décrite par Aït-Belkacem et ^al.17.
9. Alignez l’ensemble du système (en utilisant le mode d’alignement intégré à de nombreux lasers) jusqu’à ce que des intensités de signal similaires soient collectées à l’aide des deux photodiodes.
10. Vérifiez si le faisceau d’excitation focalisé par l’objectif à NA élevé et imagé sur une caméra a une forme circulaire concentrique comme présenté à la figure 4A.
11. Ajustez le temps de balayage et la puissance correspondante pour minimiser les dommages induits par le laser incident sur l’échantillon. Un exemple de brûlage ponctuel est présenté à la figure 4B. Mesurez la puissance nominale à l’aide d’un wattmètre numérique portatif connecté à un capteur de puissance à photodiode situé à l’entrée du corps du microscope.
    REMARQUE : Les échantillons biologiques peuvent être facilement brûlés en raison de l’éclairage laser. Dans ce cas, la plage de puissance de 100 à 900 μW (au point focal de la lentille de l’objectif) s’est avérée être un excellent compromis entre la stabilité de l’échantillon et l’émission intense.
12. Avant la mesure de l’échantillon, testez la qualité de l’alignement de l’optique avec un échantillon de référence isotrope (par exemple, la fluorescéine incorporée dans le polymère amorphe). Pour effectuer le contrôle d’étalonnage, suivez la procédure décrite à la section 3 en utilisant une référence isotrope au lieu d’un échantillon amyloïde.
    NOTA : En supposant que la configuration de la microscopie est idéalement ajustée pour l’échantillon ayant des propriétés isotropes, les deux composantes d’émission de 2P (I_X et I_Y) détectées avec deux APD doivent être caractérisées par la même intensité (Figure 4C).

3. Mesure des sphérulites d’insuline bovine

REMARQUE : Pour effectuer toutes les mesures ps-2PF décrites, un logiciel écrit à la main a été utilisé, qui contrôle les positions de l’étage piézoélectrique et de la demi-lame d’onde et recueille le signal des deux photodiodes, permettant de tracer les balayages XY (balayages matriciels) à partir de zones sélectionnées sur des lames de microscope ainsi que des graphiques polaires à partir de coordonnées d’échantillons spécifiques. Des notes supplémentaires ont également été ajoutées au protocole, ce qui permettra aux utilisateurs d’effectuer la mesure sans lui, car l’étage piézoélectrique et l’étage de rotation utilisés pour faire tourner la plaque demi-onde pourraient être contrôlés à l’aide de leurs propres contrôleurs ou du logiciel correspondant. Néanmoins, il est fortement recommandé d’écrire un algorithme combinant l’angle de rotation d’une plaque demi-onde avec l’intensité 2PEF collectée avec les deux photodiodes, car cette corrélation (graphes polaires) est cruciale pour une analyse correcte des données résultant en informations structurelles.

1. Montez l’éprouvette avec les sphérulites sur la platine piézoélectrique (immobiliser la lame de verre avec du ruban adhésif). Assurez-vous de le monter de manière à ce qu’un côté en verre mince (lamelle) fasse face à l’objectif, car les objectifs numériques élevés sont caractérisés par des distances de travail relativement courtes.
   REMARQUE : Comme l’immersion dans l’huile est utilisée, une petite goutte d’huile minérale doit être appliquée sur l’objectif avant le montage et la mise au point de l’échantillon.
2. En changeant les positions XY et Z à l’aide des boutons du microscope, concentrez l’objectif sur l’une des sphérulites trouvées dans la solution, mais sachez que, comme les diamètres des sphérulites sont généralement de l’ordre de quelques dizaines de μm, concentrez-vous sur la zone centrale de l’ensemble de la structure. Recherchez des halos noirs et blancs autour de la sphérulite spécifique comme signes de sous-mise au point et de mise au point supérieure, respectivement. Ajustez l’axe « Z » pour qu’il se situe entre ces extrêmes.
   REMARQUE : Il est important de trouver un échantillon isolé sans défauts structurels. Des sphérulites extrêmement petites peuvent dériver en raison de la contrainte matérielle introduite par l’objectif, tandis que les plus grandes structures sont probablement agrégées ou fortement déformées.
3. Centrez la sphérulite dans le champ de vision du plan microscopique observé et déterminez la taille du balayage XY en regardant combien d’étapes piézo-étaiées dans les directions X et Y (affichées sur le contrôleur piézo-platine ou dans son logiciel) sont nécessaires pour couvrir la zone de l’ensemble de la structure.
   REMARQUE : Il est recommandé de régler le système de manière à ce que le début du balayage XY soit situé près de l’un des coins de la sphérulite et coïncide avec la position zéro de la platine (X et Y = 0)
4. Ajustez les paramètres d’analyse suivants :
   1. Ajustez la polarisation du faisceau d’excitation et faites tourner la plaque demi-onde pour obtenir la polarisation correspondant aux axes « X » et « Y » du plan d’échantillonnage du microscope.
      REMARQUE : Cela peut être fait en mesurant les graphiques polaires d’un milieu fluorescent isotrope tel que la fluorescéine. Pour de tels matériaux, l’intensité maximale de fluorescence est parallèle à la polarisation du faisceau d’excitation ; ainsi, la rotation de la plaque demi-onde ajuste la polarisation avec les axes X et Y sur le plan d’observation, également désigné par les axes X et Y sur les graphiques polaires comme dans la figure 4C. Des graphiques polaires complets peuvent être mesurés en collectant l’intensité 2PEF mesurée sur les deux photodiodes pour une rotation de 180° de la plaque demi-onde (rotation de 360° de la polarisation de la lumière d’excitation) et en corrélant l’intensité avec l’angle de polarisation de la lumière d’excitation. Cela pourrait être fait manuellement, en mesurant l’intensité d’émission pour chaque angle de plaque demi-onde séparément, puis en l’assemblant dans un graphique polaire dans un logiciel d’analyse de données ou automatiquement, à l’aide d’un logiciel dédié ou auto-écrit.
   2. Ajustez les paramètres de la scène piézoélectrique : vitesse de balayage, pas et portée pour couvrir la zone de l’ensemble de la sphérulite.
      REMARQUE : La plage de balayage doit être supérieure au diamètre de la sphérulite pour cadrer entièrement l’ensemble de la superstructure dans le balayage raster. La faible vitesse et le faible pas de numérisation permettent aux utilisateurs d’obtenir des images de haute qualité ; Cependant, cela peut entraîner une brûlure de l’échantillon. Par conséquent, un compromis dépendant de la taille de la sphérulite est nécessaire. Ces paramètres ne peuvent pas être appliqués universellement. Exemples de paramètres utilisés dans la figure 5A : plage de balayage 45 x 45 μm, pas de balayage 1 μm et vitesse de balayage 2 μm/s.
5. Ouvrez l’obturateur, allumez les photodiodes et collectez les composants d’émission 2P pour chaque étape de la zone de balayage sélectionnée - pour le faisceau d’excitation polarisé en fonction des axes X, puis Y. Des exemples de balayages matriciels d’autofluorescence excitée par deux photons (2PAF) de sphérulites d’insuline sont présentés à la figure 5A.
   REMARQUE : La mesure des balayages matriciels nécessite de corréler les coordonnées de l’étage piézoélectrique avec les composants d’émission collectés, ce qui peut être fait manuellement, en mesurant l’intensité en chaque point de la zone sélectionnée, puis en l’assemblant dans une matrice 2D, ou automatiquement, via un logiciel auto-écrit. Les balayages matriciels peuvent être présentés comme une somme de l’intensité des composantes d’émission ou distinctement pour une composante d’émission spécifique. Comme elles sont très dépendantes de la structure, les distorsions structurelles dans les sphérulites sont facilement visibles. Cependant, en raison du mouvement de la platine du microscope, certains échantillons peuvent s’éloigner du champ de vision. Par conséquent, les images doivent être examinées à la recherche d’artefacts. Il est nécessaire de vérifier la position de la sphérulite avant et après l’examen.
6. Pour effectuer une analyse complète de la polarisation à partir d’un point spécifique de l’échantillon, désactivez le faisceau d’excitation.
7. Par la suite, choisissez des coordonnées spécifiques du piézostade correspondant à l’emplacement choisi sur la sphérulite où l’information sur l’orientation des molécules est requise avec une résolution inférieure au μm.
8. Ajustez la platine piézoélectrique pour centrer le champ de vision à l’endroit indiqué (X, Y).
9. Allumez le faisceau d’excitation et effectuez une analyse complète (360°) de la polarisation et de l’émission en activant la rotation de la plaque demi-onde (rotation de 180°). Présenter les composantes 2PF Ix et Iy sous la forme d’un graphique polaire (comme le montre la figure 5B).
   REMARQUE : Cette étape peut être répétée à différents endroits de l’échantillon pour recueillir une quantité suffisante de données.

4. Détermination de l’ordre local des fibrilles à l’intérieur des sphérulites d’insuline bovine

NOTE : Tous les calculs numériques liés à l’analyse des données ont été effectués à l’aide du langage de programmation Python et basés sur les fonctions disponibles dans les bibliothèques NumPy et SciPy. Le traçage des données nécessite la bibliothèque Matplotlib. Tous les calculs sont basés sur des formules présentées dans des informations à l’appui dans l’un des articles d’Obstarczyk et ^al.6.

1. Simulation de l’intensité de la fluorescence à deux photons excitée pour la distribution spécifiée de molécules avec une direction sélectionnée de la polarisation de la lumière incidente (notée par α)
   NOTE : Les formules présentées sont basées sur l’hypothèse de moments dipolaires d’absorption et d’émission parallèles d’un fluorophore. Pour une discussion d’autres cas (par exemple, différentes directions des moments dipolaires d’absorption et d’émission, transfert d’énergie entre les fluorophores), voir l’article de Le Floc’h et al⁸.
   1. Retrouvez les paramètres rendant compte de la variation du champ électrique par les effets de mélange de polarisation et de dépolarisation provoqués par le miroir dichroïque monté dans une installation :
      1. γ représente le facteur d’amplitude entre la réflectivité et la lumière polarisée d’un miroir dichroïque.
      2. δ représente le déphasage (ellipticité) entre la lumière polarisée et la lumière polarisée.
         NOTE : La définition correcte de ces deux paramètres est cruciale pour une caractérisation structurale réussie en raison de leur forte influence sur la forme des graphes polaires mesurés^11,18. Dans le cas du système présenté, les deux paramètres ont été déterminés lors de mesures ellipsométriques d’un miroir dichroïque appliqué dans un système.
   2. Calculer les vecteurs de champ électrique incident se propageant dans les axes X et Y de chaque angle mesuré lors de la mesure ps-TPFM à l’aide des équations (1-5).
      (1)
      (2)
      (3)
      (4)
      (5)
      REMARQUE Si l’intensité est mesurée sur l’ensemble des 360° avec l’étape 1°, calculez les vecteurs de champ électrique pour tous les 360°. Tous les angles doivent être exprimés en radians. ρ est connecté à la fréquence optique ω du champ électrique simulé (ρ=ω·t) et utilisé intégré de 0 à 2π lors des calculs des vecteurs de champ électrique incident se propageant dans les axes X et Y pour chaque angle α mesuré lors de la mesure ps-TPFM.
   3. Définir les fonctions des moments dipolaires de transition dans les directions des trois axes d’un système cartésien selon les équations (6-8) :
      (6)
      (7)
      (8)
      REMARQUE : φ est l’angle d’orientation de l’axe long de la fibrille amyloïde dans la base de sondage XY. Les angles θ et φ sont les angles polaires et azimutaux utilisés pour définir l’orientation du moment dipolaire de transition d’un fluorophore.
   4. Utilisez les fonctions définies à l’étape 4.1.3. définir des fonctions pour J_x (Φ,θ,φ) et J_Y(Φ,θ,φ), qui rendent compte de la contribution de la focalisation serrée de la lumière avec un objectif à grande ouverture numérique à la détection de polarisation de fluorescence dans les directions X et Y à l’aide des équations (9, 10).
      (9)
      (10)
      NOTE : Les facteurs K₁, K₂, K₃ sont liés à l’objectif du microscope utilisé lors de la mesure ps-TPFM. Dans ces expériences, un objectif d’immersion dans l’huile apochromatique de 100x/1,4 NA a été utilisé et les facteurs K₁, K₂, K₃ étaient respectivement de 2,945, 0,069 et 1,016.
   5. Définir une fonction pour f(Ω), qui est une distribution angulaire moléculaire, dépendant de la demi-ouverture d’un cône de fluorophore Ψ, avec une épaisseur variable ΔΨ ; Utilisez l’équation (11). La représentation graphique des trois angles concernant la fibrille amyloïde est présentée à la figure 6.
      (11)
      REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous écrivez l’exposant - la puissance de 2 fonctionne sur l’argument de la fonction, pas sur la fonction entière !
   6. Définir tous les facteurs _{f WWIJKL} comme indiqué dans les équations (12-21).
      (12)
      (13 ans)
      (14 ans)
      (15 ans)
      (16)
      (17)
      (18 ans)
      (19 ans)
      (20 ans)
      (21 ans)
   7. Calculer les intensités de fluorescence excitées à deux photons et pour chaque angle mesuré (de la même manière qu’au point 4.1.2) à l’aide des équations (22, 23).
      = (22)
      = (23)
   8. Vérifiez si la simulation fonctionne correctement à l’aide des valeurs des variables suivantes (placées dans la légende de la figure 7) et comparez les résultats obtenus avec la figure 7A-C.
      NOTE : Tous les degrés doivent être écrits en radians.
2. Ajuster les intensités simulées à l’intensité de l’autofluorescence excitée par deux photons des sphérulites d’insuline bovine recueillies lors des mesures ps-2PFM.
   NOTE : La résolution de la structure de la sphérulite basée sur les mesures ps-2PFM nécessite d’utiliser les équations écrites dans le protocole pour simuler l’intensité théorique de la fluorescence excitée à deux photons et d’ajuster tous les paramètres liés à l’ordre du fluorophore moléculaire. Elle nécessite de multiples itérations sur les différentes valeurs de Φ, un angle décrivant la rotation de la fibrille dans l’échantillon du microscope XY, et ΔΨ, des aberrations de la distribution conique du dipôle d’émission Ψ dues aux rotations moléculaires dans les filaments pour Ψ fixe jusqu’à atteindre le coefficient R² le plus élevé possible entre l’intensité du signal de fluorescence excitée normalisée à deux photons collectée pendant la mesure et les intensités normalisées simulées selon l’étape 4.1 du protocole.
   1. Déterminez le demi-angle Ψ .
      NOTA : Pour les sphérulites d’insuline bovine, elle doit être égale à Ψ = 29°⁶.
   2. Flux de travail d’ajustement :
      1. Choisissez la valeur de Φ comprise entre 0° et 180° (dans les figures 8A et 8B Φ = 16° et 127°, respectivement).
      2. Choisissez la valeur de ΔΨ comprise entre 0° et 90° (dans la figure 8A,B, ΔΨ = 24° et 1°, respectivement).
      3. Calculer (équation 22) et (équation 23) pour toute la gamme mesurée des angles θ en utilisant les valeurs choisies de Φ et ΔΨ.
      4. Comparez les intensités calculées lors des simulations (à la fois normalisées à la valeur maximale de
      5. Calculer ) avec des intensités normalisées de
      6. Calculer et (tous deux normalisés à la valeur maximale de ) mesurés pendant la mesure ps-2PFM.
         NOTE : Dans les expériences présentées, les coefficients de corrélation produit-moment de Pearson ont été calculés à l’aide de la fonction « corrcoef » de la bibliothèque Python NumPy.
   3. En fin de compte, choisissez les valeurs de Φ et ΔΨ conduisant aux coefficients de corrélation les plus élevés et à la convergence entre les intensités simulées et le signal mesuré similaire à ce qui est montré sur la figure 8.

Results

Le protocole présenté fournit des conseils étape par étape tout au long de la préparation des superstructures amyloïdes pour les tests avec ps-2PFM, la construction du système microscopique et les mesures de l’échantillon approprié. Cependant, avant la dernière série de mesures, il est essentiel d’aligner correctement les APD avec une référence isotrope, ce qui devrait permettre de collecter un signal symétrique de forme et d’intensité similaires sur les deux détecteurs (Figure 4C). Même les...

Discussion

La microscopie à deux photons sensible à la polarisation est un outil précieux pour étudier l’ordre local des fibrilles à l’intérieur des superstructures amyloïdes, ne nécessitant que de petites modifications de la configuration multiphotonique standard. Puisqu’il fonctionne sur des phénomènes optiques non linéaires, il est possible d’obtenir une photo-sélection angulaire réduite et une résolution axiale améliorée par rapport aux méthodes de microscopie à fluorescence excitée par un photon. De plus, elle conduit à une di...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Préparation d’échantillons
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
Fixateur DPX pour l’histologie	Sigma-Aldrich	6522	Montage de lames
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1,5 mL, polypropylène	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer  ; C	Eppendorf		Utilisé pour l’incubation de sphérulite
HLP 5UV Système de purification d’eau	Hydrolab		Source d’eau minéralisée utilisée dans la préparation des échantillons
Acide chlorhydrique (&ge ; 37 %, APHA et le ; 10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Poudre d’insuline du pancréas bovin (&ge ; 25 unités/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Méthanol (grade HPLC)	Sigma-Aldrich	270474
avec un concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		utilisé dans Figure 2
Ruban d’étanchéité fileté PTFE, 12 mm x 12 mm x 0,1 mm, 60 g2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - & Oslash ; Filtre passe-long 25,0 mm	Thorlabs
FESH0700 - & Oslash ; Filtre passe-court 25,0 mm	Thorlabs
photons  ;	ID Quantique
Filtre d’émission passe-court multiphoton 720 nm  ;	Semrock
, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Immersion à l’huile 100x/1.4 NA	Nikon
piézoélectrique 3D platine	Piézosystème Jena
Polarisant Beamsplitter	Thorlabs
S130C - Capteur de puissance à photodiode mince, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Bibliothèque			Version 3.3.2
Bibliothèque			Version 1.19.2
Bibliothèque			Version 1.5.2
IDE		Spyder Python 3	Édition 4.1.5