Système de culture automatisé pour le maintien et la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme
Summary
Nous présentons ici un protocole pour un système automatisé de culture cellulaire. Ce système de culture automatisé réduit la main-d’œuvre et profite aux utilisateurs, y compris les chercheurs qui ne sont pas familiers avec la manipulation des cellules souches pluripotentes induites (iPS), de l’entretien des cellules iPS à la différenciation en différents types de cellules.
Abstract
On s’attend à ce que les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) à capacité infinie d’auto-prolifération aient des applications dans de nombreux domaines, notamment l’élucidation de pathologies de maladies rares, le développement de nouveaux médicaments et la médecine régénérative visant à restaurer les organes endommagés. Malgré cela, la mise en œuvre sociale des HIPc est encore limitée. Cela s’explique en partie par la difficulté de reproduire la différenciation dans la culture, même avec des connaissances avancées et des compétences techniques sophistiquées, en raison de la grande sensibilité des CSPi aux changements environnementaux infimes. L’application d’un système de culture automatisé peut résoudre ce problème. On peut s’attendre à des expériences avec une reproductibilité élevée, indépendamment des compétences d’un chercheur, selon une procédure partagée entre différents instituts. Bien que plusieurs systèmes de culture automatisés capables de maintenir les cultures iPSC et d’induire une différenciation aient déjà été développés, ces systèmes sont lourds, volumineux et coûteux car ils utilisent des bras robotiques humanisés et multi-articulés. Pour améliorer les problèmes ci-dessus, nous avons développé un nouveau système utilisant un système simple de glissière sur l’axe x-y-z, ce qui lui permet d’être plus compact, plus léger et moins cher. De plus, l’utilisateur peut facilement modifier les paramètres du nouveau système pour développer de nouvelles tâches de manutention. Une fois qu’une tâche est établie, il suffit à l’utilisateur de préparer l’iPSC, de fournir à l’avance les réactifs et les consommables nécessaires à la tâche souhaitée, de sélectionner le numéro de la tâche et de spécifier l’heure. Nous avons confirmé que le système pouvait maintenir les cellules iPS dans un état indifférencié à travers plusieurs passages sans cellules nourricières et se différencier en différents types de cellules, y compris les cardiomyocytes, les hépatocytes, les progéniteurs neuronaux et les kératinocytes. Le système permettra des expériences hautement reproductibles dans tous les établissements sans avoir besoin de chercheurs qualifiés et facilitera la mise en œuvre sociale des hiPSC dans un plus large éventail de domaines de recherche en diminuant les obstacles à de nouvelles entrées.
Introduction
Cet article vise à fournir des procédures de manipulation réelles et détaillées pour un système automatisé de culture de cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi), que nous avons produit en collaboration avec une entreprise, et à montrer des résultats représentatifs.
Depuis la publication de l’article en 2007, l’iPSC a attiré l’attention dans le monde entier1. En raison de sa plus grande caractéristique de pouvoir se différencier en n’importe quel type de cellule somatique, il devrait être appliqué dans divers domaines tels que la médecine régénérative, l’élucidation des causes des maladies incurables et le développement de nouveaux médicaments thérapeutiques 2,3. De plus, l’utilisation de cellules somatiques humaines dérivées de cellules iPSC pourrait réduire les expérimentations animales, qui sont soumises à d’importantes restrictions éthiques. Bien que de nombreuses cellules iPS homogènes soient constamment nécessaires pour rechercher de nouvelles méthodes avec des cellules iPS, il est trop laborieux de les gérer. De plus, la manipulation des cellules iPS est difficile en raison de sa grande sensibilité, même aux changements culturels et environnementaux subtils.
Pour résoudre ce problème, on s’attend à ce que les systèmes de culture automatisés effectuent des tâches à la place des humains. Certains groupes ont mis au point quelques systèmes automatisés de culture de cellules souches pluripotentes humaines pour le maintien et la différenciation cellulaires et ont publié leurs résultats 4,5,6. Ces systèmes équipent un ou plusieurs bras robotiques multiarticulés. Les bras robotiques ont non seulement l’avantage d’imiter fortement les mouvements des bras humains, mais aussi l’inconvénient d’exiger des coûts plus élevés pour le(s) bras(s), un emballage de système plus grand et plus lourd et des efforts d’éducation fastidieux de la part des ingénieurs pour obtenir les mouvements visés 7,8. Afin de faciliter l’introduction de l’appareil dans un plus grand nombre d’installations de recherche aux points de consommation économique, d’espace et de ressources humaines, nous avons développé un nouveau système de culture automatisé pour le maintien et la différenciation des CSPi en différents types de cellules9.
La raison d’être de ce nouveau système était d’adopter un système de rails sur les axes X-Y-Z au lieu de bras robotiques multiarticulés9. Pour remplacer les fonctions complexes des bras robotiques, nous avons appliqué une nouvelle idée à ce système, qui peut changer automatiquement trois types d’embouts de bras fonctionnels spécifiques. Ici, nous indiquons également comment les utilisateurs peuvent facilement établir des calendriers de tâches avec de simples commandes sur un logiciel en raison de l’absence d’exigences pour les contributions des ingénieurs tout au long du processus.
L’un des systèmes de culture robotisés a démontré la fabrication de corps embryoïdes en utilisant des plaques à 96 puits comme agrégats cellulaires 3D pour la différenciation4. Le système décrit ici ne peut pas traiter les plaques à 96 puits. L’une d’entre elles a obtenu la note actuelle de bonnes pratiques de fabrication (BPF) en utilisant une lignée cellulaire, bien qu’il ne s’agisse pas d’une cellule souche pluripotente humaine5. Le système de culture automatisé détaillé ici a maintenant été développé dans le but spécifique d’aider les expériences de laboratoire (Figure 1). Cependant, il dispose de suffisamment de systèmes pour maintenir des niveaux de propreté équivalents à ceux d’une armoire de sécurité de niveau IV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une étape critique du protocole est que si un utilisateur trouve des défauts, cliquez sur le bouton d’annulation, d’arrêt ou de réinitialisation à tout moment et recommencez à partir de la première étape. Le logiciel peut éviter les erreurs humaines, y compris la double réservation, l’ouverture des portes pendant que les tâches du système sont actives et le manque de réapprovisionnement. Un autre point critique pour une différenciation réussie et efficace en la cellule somatique souhaitée est la sé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par une subvention du New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japon.
Materials
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
| β <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65672/65672eq01v2.jpg" style="margin: auto;"/> Tublin mouse | Promega | G712A |
References
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn’t anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
