Nous présentons ici un protocole pour un système automatisé de culture cellulaire. Ce système de culture automatisé réduit la main-d’œuvre et profite aux utilisateurs, y compris les chercheurs qui ne sont pas familiers avec la manipulation des cellules souches pluripotentes induites (iPS), de l’entretien des cellules iPS à la différenciation en différents types de cellules.
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Article de méthode
Système de culture automatisé pour le maintien et la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme
Dans cet article
Résumé
Résumé
On s’attend à ce que les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) à capacité infinie d’auto-prolifération aient des applications dans de nombreux domaines, notamment l’élucidation de pathologies de maladies rares, le développement de nouveaux médicaments et la médecine régénérative visant à restaurer les organes endommagés. Malgré cela, la mise en œuvre sociale des HIPc est encore limitée. Cela s’explique en partie par la difficulté de reproduire la différenciation dans la culture, même avec des connaissances avancées et des compétences techniques sophistiquées, en raison de la grande sensibilité des CSPi aux changements environnementaux infimes. L’application d’un système de culture automatisé peut résoudre ce problème. On peut s’attendre à des expériences avec une reproductibilité élevée, indépendamment des compétences d’un chercheur, selon une procédure partagée entre différents instituts. Bien que plusieurs systèmes de culture automatisés capables de maintenir les cultures iPSC et d’induire une différenciation aient déjà été développés, ces systèmes sont lourds, volumineux et coûteux car ils utilisent des bras robotiques humanisés et multi-articulés. Pour améliorer les problèmes ci-dessus, nous avons développé un nouveau système utilisant un système simple de glissière sur l’axe x-y-z, ce qui lui permet d’être plus compact, plus léger et moins cher. De plus, l’utilisateur peut facilement modifier les paramètres du nouveau système pour développer de nouvelles tâches de manutention. Une fois qu’une tâche est établie, il suffit à l’utilisateur de préparer l’iPSC, de fournir à l’avance les réactifs et les consommables nécessaires à la tâche souhaitée, de sélectionner le numéro de la tâche et de spécifier l’heure. Nous avons confirmé que le système pouvait maintenir les cellules iPS dans un état indifférencié à travers plusieurs passages sans cellules nourricières et se différencier en différents types de cellules, y compris les cardiomyocytes, les hépatocytes, les progéniteurs neuronaux et les kératinocytes. Le système permettra des expériences hautement reproductibles dans tous les établissements sans avoir besoin de chercheurs qualifiés et facilitera la mise en œuvre sociale des hiPSC dans un plus large éventail de domaines de recherche en diminuant les obstacles à de nouvelles entrées.
Introduction
Cet article vise à fournir des procédures de manipulation réelles et détaillées pour un système automatisé de culture de cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi), que nous avons produit en collaboration avec une entreprise, et à montrer des résultats représentatifs.
Depuis la publication de l’article en 2007, l’iPSC a attiré l’attention dans le monde entier1. En raison de sa plus grande caractéristique de pouvoir se différencier en n’importe quel type de cellule somatique, il devrait être appliqué dans divers domaines tels que la médecine régénérative, l’élucidation des causes des maladies incurables et le développement de nouveaux médicaments thérapeutiques 2,3. De plus, l’utilisation de cellules somatiques humaines dérivées de cellules iPSC pourrait réduire les expérimentations animales, qui sont soumises à d’importantes restrictions éthiques. Bien que de nombreuses cellules iPS homogènes soient constamment nécessaires pour rechercher de nouvelles méthodes avec des cellules iPS, il est trop laborieux de les gérer. De plus, la manipulation des cellules iPS est difficile en raison de sa grande sensibilité, même aux changements culturels et environnementaux subtils.
Pour résoudre ce problème, on s’attend à ce que les systèmes de culture automatisés effectuent des tâches à la place des humains. Certains groupes ont mis au point quelques systèmes automatisés de culture de cellules souches pluripotentes humaines pour le maintien et la différenciation cellulaires et ont publié leurs résultats 4,5,6. Ces systèmes équipent un ou plusieurs bras robotiques multiarticulés. Les bras robotiques ont non seulement l’avantage d’imiter fortement les mouvements des bras humains, mais aussi l’inconvénient d’exiger des coûts plus élevés pour le(s) bras(s), un emballage de système plus grand et plus lourd et des efforts d’éducation fastidieux de la part des ingénieurs pour obtenir les mouvements visés 7,8. Afin de faciliter l’introduction de l’appareil dans un plus grand nombre d’installations de recherche aux points de consommation économique, d’espace et de ressources humaines, nous avons développé un nouveau système de culture automatisé pour le maintien et la différenciation des CSPi en différents types de cellules9.
La raison d’être de ce nouveau système était d’adopter un système de rails sur les axes X-Y-Z au lieu de bras robotiques multiarticulés9. Pour remplacer les fonctions complexes des bras robotiques, nous avons appliqué une nouvelle idée à ce système, qui peut changer automatiquement trois types d’embouts de bras fonctionnels spécifiques. Ici, nous indiquons également comment les utilisateurs peuvent facilement établir des calendriers de tâches avec de simples commandes sur un logiciel en raison de l’absence d’exigences pour les contributions des ingénieurs tout au long du processus.
L’un des systèmes de culture robotisés a démontré la fabrication de corps embryoïdes en utilisant des plaques à 96 puits comme agrégats cellulaires 3D pour la différenciation4. Le système décrit ici ne peut pas traiter les plaques à 96 puits. L’une d’entre elles a obtenu la note actuelle de bonnes pratiques de fabrication (BPF) en utilisant une lignée cellulaire, bien qu’il ne s’agisse pas d’une cellule souche pluripotente humaine5. Le système de culture automatisé détaillé ici a maintenant été développé dans le but spécifique d’aider les expériences de laboratoire (Figure 1). Cependant, il dispose de suffisamment de systèmes pour maintenir des niveaux de propreté équivalents à ceux d’une armoire de sécurité de niveau IV.
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Protocole
Le comité d’éthique de l’Université de médecine du Kansai a approuvé la production et l’utilisation de cellules iPS saines dérivées de volontaires nommées KMUR001 (approbation n° 2020197). Le donneur, qui a été ouvertement recruté, a donné son consentement formel et éclairé et était d’accord avec l’utilisation scientifique des cellules.
REMARQUE : L’interface actuelle (le logiciel spécial nommé « ccssHMI » fonctionnant sous le système d’exploitation Windows XP) est l’écran de fonctionnement fondamental. Sous l’interface susmentionnée, une série d’onglets sont organisés, permettant aux utilisateurs de lancer diverses opérations.
1. Opérations de chargement
- Cliquez sur le bouton Chargement sur l’écran supérieur du logiciel. Cliquez sur le bouton Début de la préparation du chargement .
- Placez le(s) plat(s) ou l’assiette(s) à entrer dans l’appareil en position dans l’appareil.
REMARQUE : Les informations nécessaires à l’identification de la boîte doivent être écrites sur chaque couvercle. - Fermez manuellement la vitre coulissante avant et appuyez sur le bouton de confirmation de sécurité mécanique.
- Sélectionnez le type et la quantité de plat(s) ou d’assiette(s) dans le logiciel.
- Cliquez sur le bouton Préparation du chargement terminée . Cliquez sur le bouton Début du chargement .
- Une fois qu’une antenne parabolique est téléchargée dans le système, sélectionnez les informations sur la parabole, par exemple avec ou sans cellules iPS, dans le logiciel. Enregistrez des notes sur chaque plat dans le logiciel.
- Cliquez sur le bouton Enregistrement à la fin pour terminer l’opération de chargement.
2. Opération de déchargement
- Cliquez sur le bouton Décharger sur l’écran supérieur du logiciel. Sélectionnez la ou les paraboles à supprimer dans le logiciel.
- Après avoir sélectionné le(s) plat(s), cliquez sur le bouton Démarrer la préparation du déchargement . Cliquez sur le bouton Démarrer le déchargement .
- Une fois que la ou les boîtes ont été transférées de l’incubateur à l’établi dans le système, appuyez sur le bouton Dish Removal .
- Ouvrez manuellement la fenêtre coulissante avant et sortez le(s) plat(s). Fermez manuellement la vitre coulissante avant et appuyez sur le bouton de confirmation de sécurité mécanique.
3. Supplément de consommables : pipettes, tubes et milieu
- Pour réapprovisionner les consommables tels que les pipettes, les tubes et le milieu, cliquez sur le bouton Consommables sur l’écran supérieur du logiciel, puis sélectionnez l’élément à réapprovisionner.
- Pipettes
- Cliquez sur le bouton Pipetette . Sélectionnez le bouton Réapprovisionner .
- Sélectionnez un rack que l’utilisateur souhaite réapprovisionner sur le logiciel. Cliquez sur le bouton Démarrer du réapprovisionnement .
- Après avoir vérifié que le couvercle de la zone de stockage des pipettes sur l’établi est ouvert, ouvrez manuellement la fenêtre coulissante avant et remplissez les pipettes si nécessaire.
- Fermez manuellement la vitre coulissante avant et appuyez sur le bouton de confirmation de sécurité mécanique. Cliquez sur le bouton Réapprovisionner terminé .
- Cliquez sur le bouton Configuration du réapprovisionnement et saisissez les informations relatives au réapprovisionnement, puis cliquez sur le bouton Enregistrement .
- Cliquez sur le bouton Réapprovisionner terminé .
- Tubes
- Cliquez sur le bouton Tube . Sélectionnez le bouton Réapprovisionner .
- Sélectionnez un rack que l’utilisateur souhaite réapprovisionner sur le logiciel. Cliquez sur le bouton Démarrer du réapprovisionnement .
- Après avoir vérifié que le rack s’est déplacé vers le haut, cliquez sur le bouton Réapprovisionner le tube .
- Ouvrez manuellement la fenêtre coulissante avant et remplissez les tubes au besoin.
- Fermez manuellement la vitre coulissante avant et appuyez sur le bouton de confirmation de sécurité mécanique.
- Cliquez sur le bouton Réapprovisionner terminé .
- Cliquez sur le bouton Configuration du réapprovisionnement et saisissez les informations relatives au réapprovisionnement, puis cliquez sur le bouton Enregistrement . Cliquez sur le bouton Fermer .
- Douleur moyenne
- Cliquez sur le bouton Moyen . Sélectionnez le bouton Réapprovisionner dans le logiciel.
- Sélectionnez un rack parmi trois que les utilisateurs souhaitent réapprovisionner. Cliquez sur le bouton Démarrer du réapprovisionnement .
- Après avoir vérifié que le couvercle de la zone de stockage du support a été ouvert, ouvrez manuellement la fenêtre coulissante avant et réapprovisionnez le support.
- Fermez manuellement la vitre coulissante avant et appuyez sur le bouton de confirmation de sécurité mécanique.
- Cliquez sur le bouton Réapprovisionner terminé .
- Cliquez sur le bouton Réapprovisionner et entrez les informations relatives au support, y compris le nom et la quantité du support. Saisissez des commentaires supplémentaires si nécessaire.
- Cliquez sur le bouton Inscription .
- Cliquez sur le bouton Fermer .
- Pipettes
4. Sélection des tâches
- Cliquez sur le bouton Tâche sur l’écran supérieur du logiciel.
- Sélectionnez le bouton Paramètre de tâche . Sélectionnez la tâche souhaitée dans la liste des tâches et cliquez sur le bouton Étape suivante .
- Spécifiez la date et l’heure d’exécution de la tâche, puis cliquez sur le bouton Inscription . Sélectionnez un plat ou une assiette pour effectuer la tâche, puis cliquez sur le bouton Enregistrement .
- Après avoir reconfirmé la tâche sélectionnée, cliquez sur le bouton Inscription . Confirmez que la tâche a été enregistrée sur l’écran suivant.
- Si nécessaire, définissez la tâche suivante de la même manière.
- Cliquez sur le bouton Démarrer à la fin. Ensuite, la tâche démarrera automatiquement à la date et à l’heure spécifiées.
REMARQUE : Immédiatement après avoir terminé chaque tâche, les lampes UV (situées sur les deux côtés de la hotte) s’allument automatiquement et, après 5 à 30 minutes, conformément au réglage auxiliaire, elles s’éteignent pour maintenir la hotte en état d’asepsie. Pour arrêter, les utilisateurs peuvent cliquer sur le bouton Démarrer . - Si les utilisateurs souhaitent annuler une tâche planifiée à l’avance, cliquez sur le bouton Arrêter .
- Après avoir sélectionné la tâche à abandonner, cliquez sur le bouton Modifier la tâche .
- Cliquez sur le bouton Annuler la tâche . Confirmez que la tâche a été supprimée sur l’écran suivant.
5. Vérifiez les images des cellules
- Chaque tâche comprend des observations microscopiques (prise de photos) avant et après le travail de la tâche. Observez la progression de la culture cellulaire par photographie en incorporant une tâche de photographie microscopique avant ou après chaque tâche.
- Sélectionnez des programmes de tâches prédéfinis, y compris la sélection à l’avance de plusieurs emplacements spécifiques de la parabole ou de la plaque de puits pour une observation en point fixe afin de surveiller le même emplacement au fil du temps.
6. Passaging et différenciation
- Suivez les étapes des sections 1 à 5 et configurez le système de culture cellulaire automatisé pour effectuer le passage et la différenciation. Les paramètres de l’instrument pour le passage, la différenciation des cardiomyocytes, la différenciation des hépatocytes, la différenciation des cellules précurseurs neurales et la différenciation des kératinocytes sont indiqués dans les tableaux 1, 2, 3, 4 et 5, respectivement.
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Résultats
Maintien des cellules souches pluripotentes induites par l’homme
Nous avons utilisé trois lignées hPSC (RIKEN-2F, 253G1 et KMUR001). Nous avons optimisé le protocole de maintenance grâce à des expériences manuelles quotidiennes et optimisé davantage les programmes détaillés grâce aux sept expériences préliminaires effectuées par le système. Par exemple, les contraintes de cisaillement causées par les vitesses de liquide de l’écoulement de la broche provenant de différentes pipettes manipulées par l’ho...
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Discussion
Une étape critique du protocole est que si un utilisateur trouve des défauts, cliquez sur le bouton d’annulation, d’arrêt ou de réinitialisation à tout moment et recommencez à partir de la première étape. Le logiciel peut éviter les erreurs humaines, y compris la double réservation, l’ouverture des portes pendant que les tâches du système sont actives et le manque de réapprovisionnement. Un autre point critique pour une différenciation réussie et efficace en la cellule somatique souhaitée est la sélection correcte des li...
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Déclarations de divulgation
L’auteur n’a rien à révéler.
Remerciements
Cette étude a été financée par une subvention du New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japon.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,15 % d’albumine sérique bovine fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japon | 9048-46-8 | |
| 1 % GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm assiettes en plastique ; | Corning Inc., NY, États-Unis | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoéthanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinine ; souris | Abcam | ab9465 | |
| Activin A ; | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adénine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumine | lapin Dako | A0001 | |
| Acide rétinoïque tout-trans | Fuji Film Wako Chemical Inc. ; | 186-01114 | |
| Système de culture automatisé | Panasonic | ||
| B-27 supplément | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. ; | 062-06661 | |
| BMP4 ; | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Albumine sérique bovine | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 ; | MCE, NJ, États-Unis #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Défini Kératinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Kératinocyte humain |
| Moyen Dexaméthasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa ; | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycérol |
| Hémocytomètre jetable | CountessTM Lames de chambre de comptage cellulaire, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphine | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco' s modifié Eagle medium/F12 ; | Fuji Film Wako Chemical Inc. | ||
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essentiel 8 ; | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Milieu de cellules souches pluripotentes humaines |
| Sérum fœtal bovin ; | Biowest, FL, États-Unis | S140T | |
| FGF-basic ; | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292. | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Supplément de glutamine |
| Chèvre IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A ; chèvre | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Soie ; | Nippi Inc., Tokyo, Japon | 892 021 | Matrice de culture cellulaire |
| Insuline-transfertrine-sélénium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Kératine 1 ; souris | Santacruz | 376224 | |
| Kératine 10 ; lapin | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University ; | CSPi dérivées de patients ; | |
| Remplacement sérique knockout | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbique acide 2-phosphate ; | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz' s L-15 moyen ; | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | ||
| souris IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplément | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| souris Nestin | Santacruz | 23927 | |
| Milieu neurobasal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament Chemicon | AB1987 | ||
| Neutristem | Sartrius AG, Gö ; ttingen, Allemagne | 05-100-1A | milieu de culture cellulaire ; |
| Oct 3/4 ; souris | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japon | 14249-24 | |
| IgG de lapin(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| IgG de lapin(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Albumine humaine recombinante ; | A0237, Merck, Darmstadt, Allemagne | A9731 | |
| Inhibiteur de la rhokinase, Y-27632 ; | Sellec Inc., Tokyo, Japon | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | Centre de recherche sur les bioressources RKEN | HPS0014 | hiPSCs indifférenciées ; |
| RPMI 1640 ; | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| L-ascorbate de sodium | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 | souris Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N ; | Ajinomoto, Tokyo, Japon | Milieu de culture cellulaire | AK02 |
| TnT lapin | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 souris | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme ; | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis | 12604013 | |
| Trypan blue solution ; | Nacalai Tesque, Kyoto, Japon | 20577-34 | |
| Bouillon de phosphate de tryptose | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 ; | Bio-techne, NB, Royaume-Uni | 5148 | |
| &beta ; ; | Promega | G712A |
Références
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Réimpressions et autorisations
