Method Article

Expériences d’optogénétique à haut débit dans la levure à l’aide de la plateforme automatisée Lustro

DOI:

10.3791/65686

⸱

August 4th, 2023

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2University of Wisconsin Carbone Cancer Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit les étapes de l’utilisation de la plate-forme automatisée Lustro pour effectuer une caractérisation à haut débit des systèmes optogénétiques chez la levure.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’optogénétique offre un contrôle précis du comportement cellulaire en utilisant des protéines sensibles à la lumière codées génétiquement. Cependant, l’optimisation de ces systèmes pour obtenir les fonctionnalités souhaitées nécessite souvent plusieurs cycles de conception, de construction et de test, ce qui peut prendre beaucoup de temps et de main-d’œuvre. Pour relever ce défi, nous avons développé Lustro, une plateforme qui combine la stimulation lumineuse avec l’automatisation du laboratoire, permettant un criblage et une caractérisation efficaces à haut débit des systèmes optogénétiques.

Lustro utilise un poste de travail d’automatisation équipé d’un dispositif d’éclairage, d’un dispositif d’agitation et d’un lecteur de plaques. En utilisant un bras robotisé, Lustro automatise le mouvement d’une plaque de micropuits entre ces dispositifs, ce qui permet de stimuler les souches optogénétiques et de mesurer leur réponse. Ce protocole fournit un guide étape par étape sur l’utilisation de Lustro pour caractériser les systèmes optogénétiques pour le contrôle de l’expression génique chez la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae. Le protocole couvre la configuration des composants de Lustro, y compris l’intégration du dispositif d’éclairage avec le poste de travail d’automatisation. Il fournit également des instructions détaillées pour la programmation du dispositif d’éclairage, du lecteur de plaques et du robot, garantissant un fonctionnement fluide et l’acquisition de données tout au long du processus expérimental.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’optogénétique est une technique puissante qui utilise des protéines sensibles à la lumière pour contrôler le comportement des cellules avec une grande précision 1,2,3. Cependant, le prototypage de constructions optogénétiques et l’identification des conditions d’éclairage optimales peuvent prendre beaucoup de temps, ce qui rend difficile l’optimisation des systèmes optogénétiques 4,5. Des méthodes à haut débit permettant de cribler et de caractériser rapidement l’activité des systèmes optogénétiques peuvent accélére....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les souches de levure utilisées dans cette étude sont documentées dans le tableau des matériaux. Ces souches présentent une croissance robuste dans la plage de température de 22 °C à 30 °C et peuvent être cultivées dans divers milieux de levure standard.

1. Mise en place du poste de travail d’automatisation

  1. Équiper le poste de travail automatisé d’un bras de préhension robotisé (RGA, voir le tableau des matériaux) capable de déplacer des plaques de micropuits (Figure 1).
  2. Installer un agitateur chauffant pour microplaques (voir le tab....

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Results

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La figure 4A montre les valeurs de fluorescence au cours du temps pour une souche optogénétique exprimant un rapporteur fluorescent contrôlé par un facteur de transcription fractionné inductible par la lumière. Les différentes conditions d’éclairage utilisées dans l’expérience sont reflétées par des variations dans le cycle de service, qui représente le pourcentage de temps pendant lequel la lumière est allumée. On observe que le niveau de fluorescence global est proportionnel au facteur de .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole Lustro présenté ici automatise les processus de culture, d’éclairage et de mesure, permettant un criblage et une caractérisation à haut débit des systèmes optogénétiques6. Ceci est réalisé en intégrant un dispositif d’éclairage, un lecteur de microplaques et un dispositif d’agitation dans un poste de travail d’automatisation. Ce protocole démontre spécifiquement l’utilité de Lustro pour le criblage de différentes constructions optogénétiques intégrées dans la levure S. cerevisiae<.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par les R35GM128873 de subvention des National Institutes of Health et les 2045493 de subvention de la National Science Foundation (attribués à M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D., est titulaire d’une bourse de carrière à l’interface scientifique du Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. a bénéficié d’une subvention de formation du NHGRI pour le programme de formation en sciences génomiques 5T32HG002760. Nous reconnaissons les discussions fructueuses avec les membres du laboratoire McClean et, en particulier, nous sommes reconnaissants à Kieran Sweeney d’avoir fourni des commentaires sur le manuscrit.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Plaque inférieure en verre à 96 puits avec verre de couverture #1.5CellvisP96-1.5H-N
BioShake 3000-T orm (agitateur de chauffage)QINSTRUMENTS
Fluent Automation WorkstationTecan
LITOS (dispositif d’éclairage alternatif)Hohener, et al. Rapports scientifiques. 2022
optoPlate-96 (dispositif d’éclairage)Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Bras de préhension robotiqueTecan
Spark (lecteur de plaques)Tecan
Synthetic Média completSigmaAldrichY1250
Tecan Connect (application d’alerte utilisateur)Tecan
yMM1734 (BY4741 Mat&alpha ; ura3&Delta ; Homologie 0 ::5' Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homologie  ; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80 ::KANMX gal4 ::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Mat&alpha ; ura3&Delta ; Homologie Ura3 0 ::5', homologie pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homologie  ; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80 ::KANMX gal4 ::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Mat&alpha ; ura3&Delta ; Homologie 0 ::5' Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homologie  ; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80 ::KANMX gal4 ::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD AgarSigmaAldrichY1500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839(2022).
  2. Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Tre....

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