Isolement et culture de cellules ciliées cochléaires primaires de souris néonatales

Résumé

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et la culture des cellules ciliées cochléaires primaires de souris. Initialement, l’organe de Corti a été disséqué à partir de cochlées murines néonatales (âgées de 3 à 5 jours) au microscope. Par la suite, les cellules ont été digérées enzymatiquement dans une suspension unicellulaire et identifiées par immunofluorescence après plusieurs jours de culture.

Résumé

Les cellules ciliées cochléaires sont les récepteurs sensoriels du système auditif. Ces cellules sont situées dans l’organe de Corti, l’organe sensoriel responsable de l’audition, dans le labyrinthe osseux de l’oreille interne. Les cellules ciliées cochléaires se composent de deux types anatomiquement et fonctionnellement distincts : les cellules ciliées externes et internes. Les dommages causés à l’un ou l’autre d’entre eux entraînent une perte auditive. Notamment, car les cellules ciliées internes ne peuvent pas se régénérer et les dommages qui leur sont causés sont permanents. Par conséquent, la culture in vitro de cellules ciliées primaires est indispensable pour étudier les effets protecteurs ou régénérateurs des cellules ciliées cochléaires. Cette étude visait à découvrir une méthode d’isolement et de culture des cellules ciliées de souris.

Après l’ablation manuelle de la paroi latérale cochléaire, l’épithélium auditif a été méticuleusement disséqué du modiolus cochléaire au microscope, incubé dans un mélange composé de 0,25 % de trypsine-EDTA pendant 10 min à 37 °C, et délicatement suspendu dans un milieu de culture à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL. La suspension cellulaire a été passée à travers un filtre cellulaire, le filtrat a été centrifugé et les cellules ont été cultivées dans des plaques à 24 puits. Les cellules ciliées ont été identifiées en fonction de leur capacité à exprimer un complexe de mécanotransduction, la myosine-VIIa, qui est impliquée dans les tensions motrices, et par marquage sélectif de la F-actine à l’aide de la phalloïdine. Les cellules ont atteint >90% de confluence après 4 jours de culture. Cette méthode peut améliorer notre compréhension des caractéristiques biologiques des cellules ciliées cultivées in vitro et démontrer l’efficacité des cultures de cellules ciliées cochléaires, établissant ainsi une base méthodologique solide pour la recherche auditive ultérieure.

Introduction

Les cellules ciliées cochléaires jouent un rôle important dans la détection des sons et la transmission du signal au nerf auditif. Les cellules ciliées sont des cellules mécanistes qui fonctionnent comme des récepteurs sensoriels primaires et convertissent les vibrations sonores en signaux électriques chez les vertébrés. L’épithélium sensoriel de l’oreille interne des mammifères comprend une seule rangée de cellules ciliées internes et trois rangées de cellules ciliées externes. Dans différentes zones membranaires de base, les cellules ciliées perçoivent des sons à différentes fréquences (entre 20 et 2 000 Hz)¹. La fonction des cellules ciliées....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées (n° 2021-847) par le Comité sur l’utilisation et le soin des animaux de l’Université Jiaotong de Xi’an.

1. Stérilisation et préparation du matériel

1. Stérilisez les outils de dissection à l’aide d’une désinfection à la vapeur à haute température et à haute pression et séchez-les dans un incubateur à 50 °C pendant la nuit.
2. Préparer à l’avance 100 mL du milieu de culture contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 10 mg/mL de pénicilline/streptomycine (ajouter 10 mL de FBS et 10 μL de solution mère de pénicilline à 90 mL de milieu Eagle modifié (EM....

Résultats

En suivant ce protocole, nous avons ensemencé les cellules isolées. Les graines primaires de cellules ciliées cochléaires ont été considérées comme réussies si les cellules ne flottaient pas dans le milieu de culture et ne se propageaient pas dans les 24 heures. Nous avons déterminé le nombre de cellules ciliées après qu’elles aient adhéré et se soient répandues en agrégats plats au fond de la boîte. Après 1 jour, les cellules ciliées vivantes ont été étroitement collées au fond de la boîte de culture et les cellules non.......

Discussion

Par rapport à la lignée cellulaire HEI-OC1, les cultures primaires de cellules ciliées ont reproduit plus précisément l’état physiologique des cellules in vivo. Par conséquent, la méthode de culture primaire auditive établie en isolant des cellules vivantes des organes cochléaires et en les cultivant immédiatement semble être un outil précieux pour des recherches approfondies sur les systèmes auditifs. Certaines techniques sont cruciales pour une culture réussie. Tout d’abord, la minimisation de la durée de séparation de.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîte de culture cellulaire BioLite de 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182	d’utilisation pour la culture
Boîte de culture cellulaire Nunc de 35 mm	Thermo Fisher Scientific	150318	d’utilisation pour la culture
Palais à 6 puits	Thermo Fisher Scientific	310109005	d’utilisation pour la culture
70 µ ; filtres à cellules m	BD Company	352350	utilisant pour filtre
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	coloration immunofluorescente
IgG anti-lapin Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	coloration immunofluorescente
jour 3-5 murin néonatal  ;			fourni par l’Université Jiaotong de Xi’an
Dulbecco' s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	utilisation pour la culture
Sérum de veau fœtal	Thermo Fisher	Scientific 12483020	utilisation pour la culture
Forceps	Dumont	5#	utilisation pour la dissection
Leica anatomy microscope	Allemagne	S9i	utilisation pour la dissection
Pénicilline/streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140-122	utilisation pour la culture
Rabbit plyclonal à Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	coloration immunofluorescente
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	utilisation pour la dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich  ;	9036-19-5	coloration immunofluorescente
Trypsine	Thermo Fisher Scientific	25200072	utilisation pour la culture