Ce protocole présente une méthode complète et efficace pour produire des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) en utilisant des conditions de culture en suspension. L’objectif principal de cette étude réside dans la détermination de la densité cellulaire initiale et de la concentration d’agonistes WNT, ce qui profite aux chercheurs intéressés par la recherche sur les organoïdes rénaux.
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Article de méthode
Génération d’organoïdes rénaux en suspension à partir de cellules souches pluripotentes induites
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Les organoïdes rénaux peuvent être générés à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) par diverses approches. Ces organoïdes sont très prometteurs pour la modélisation des maladies, le dépistage des médicaments et les applications thérapeutiques potentielles. Cet article présente une procédure étape par étape pour créer des organoïdes rénaux à partir de cellules iPS, en commençant par la strie primitive postérieure (PS) jusqu’au mésoderme intermédiaire (IM). L’approche s’appuie sur le milieu APEL 2, qui est un milieu défini, sans composant animal. Il est complété par une forte concentration d’agoniste WNT (CHIR99021) pendant une durée de 4 jours, suivie d’un facteur de croissance des fibroblastes 9 (FGF9)/héparine et d’une faible concentration de CHIR99021 pendant 3 jours supplémentaires. Au cours de ce processus, l’accent est mis sur la sélection de la densité cellulaire et de la concentration de CHIR99021 optimales au début des CSPi, car ces facteurs sont essentiels à la réussite de la génération d’organoïdes rénaux. Un aspect important de ce protocole est la culture en suspension dans une plaque peu adhérente, permettant à l’IM de se développer progressivement en structures néphroniques, englobant des structures tubulaires glomérulaires, tubulaires proximales et distales, le tout présenté dans un format visuellement compréhensible. Dans l’ensemble, ce protocole détaillé offre une technique efficace et spécifique pour produire des organoïdes rénaux à partir de diverses cellules iPS, garantissant des résultats réussis et cohérents.
Introduction
Le rein joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie physiologique, en fonction de son unité fonctionnelle. Les néphrons, qui excrètent les déchets, peuvent réguler la composition des fluides corporels. L’insuffisance rénale chronique (IRC), causée par des mutations héréditaires ou d’autres facteurs de risque élevés, évoluera éventuellement vers une insuffisance rénale terminale (ESKD)1,2. L’ESKD est apparemment due à la capacité de régénération limitée des néphrons. Ainsi, un traitement de remplacement rénal est nécessaire. La différenciation dirigée des cellules iPS humaines permet la génération in vitro d’organoïdes rénaux 3D spécifiques au patient, qui peuvent être utilisés pour étudier le développement des reins, modéliser des maladies spécifiques au patient et effectuer un criblage de médicaments néphrotoxiques 3,4.
Au cours du développement embryonnaire, les reins proviennent du mésoderme intermédiaire (IM), qui se différencie de la strie primitive (PS). La voie de signalisation WNT classique peut induire une différenciation supplémentaire de l’IM avec la participation coordonnée de FGF (FGF9, FGF20) et BMP (signalisation Bmp7 via JNK)5,6,7. Ils produisent deux populations cellulaires importantes de cellules progénitrices néphriques (NPC) : le bourgeon urétéral (UB) et le mésenchyme métanéphrique (MM), formant respectivement les canaux collecteurs et le néphron. Chaque néphron est constitué de segments glomérulaires et tubulaires, tels que les tubules proximaux et distals, et l’anse de Henle10,11. Selon la théorie mentionnée ci-dessus, les protocoles actuellement publiés imitent les cascades de signaux et la stimulation du facteur de croissance pour induire des organoïdes rénaux 5,12.
Au cours des dernières années, de nombreux protocoles ont été mis au point pour différencier les cellules iPS humaines en organoïdes rénaux 5,6,7,12. Takasato et al.7 ont optimisé la durée du traitement par CHIR (agoniste WNT) avant son remplacement par FGF9. Selon leur protocole, l’exposition au CHIR pendant 4 jours, suivie du FGF9 pendant 3 jours, est le moyen le plus efficace d’induire la MI à partir des cellules iPS. Les filtres Transwell ont été utilisés comme format de culture dans leur procédure ; Cependant, cette méthode est difficile pour les débutants. Par conséquent, Kumar et al.13 ont essayé de changer le format de la culture et ont choisi de suspendre la culture. Ils ont dissocié les cellules adhérentes au jour 7 pour les ensemencer dans des plaques peu adhérentes afin de les aider à s’assembler en corps embryoïdes (EB) contenant des structures ressemblant à des néphrons. Cependant, l’effet batch de ces méthodes était évident, en particulier dans différentes cellules iPS. De plus, différentes publications ont rapporté que la concentration de CHIR variait de 7 μM à 12 μM 5,13,14.
Nous avons émis l’hypothèse que la concentration de la densité cellulaire et du CHIR pourrait affecter la génération d’organoïdes dans différentes cellules iPS, ce qui a été vérifié à de nombreuses reprises dans nos expériences. Le présent protocole a légèrement modifié la méthode d’étude de Kumar et al.13 et a fourni aux utilisateurs une procédure étape par étape. L’échéancier et le schéma de l’approche sont présentés à la figure 1.
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Protocole
Les cellules iPS utilisées dans le cadre de la présente étude ont été obtenues auprès d’une source commerciale. Les cellules ont été maintenues avec du milieu mTeSR sur des plaques revêtues d’une matrice de membrane basale disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Le tableau 1 contient toutes les compositions de milieux utilisées dans l’étude.
1. Placage des cellules iPS pour la différenciation et l’induction d’une strie primitive postérieure (PS)
- Laver les cellules iPS sur la plaque à 6 puits revêtue d’une matrice membranaire avec 2 mL de DPBS. Aspirez le DPBS à l’aide d’une pipette.
- Ajouter 1 mL de la solution de décollement cellulaire disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) pour détacher les cellules iPS et incuber à 37 °C pendant 5 min.
- Ajouter 1 mL de mTeSR aux cellules iPS et s’assurer que les cellules se sont soulevées de la surface en plastique.
- Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 3 min à température ambiante (RT). Remettez la pastille de cellules en suspension et comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Ensemencer une gamme de densités cellulaires sur une plaque de 24 ou 6 puits recouverte d’une matrice membranaire et cultiver avec mTeSR complété par un inhibiteur de la kinase Rho de 10 μM (Y-27632) (voir le tableau des matériaux). Cultivez-les pendant une nuit dans un incubateur de CO2 à 37 °C.
REMARQUE : Pour induire la PS, la concentration optimale de CHIR99021 et les densités cellulaires appropriées varient d’une lignée à l’autre de la CSPi. Ensemencer une gamme de densités (p. ex., 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,4 * 103 cellules individuelles par centimètre carré) et une plage de concentration de CHIR99021 de 7 μM à 12 μM. Initier la différenciation de chaque densité et de chaque CHIR le même jour. Trouvez la concentration optimale de CHIR99021 et les densités cellulaires appropriées dans une plaque à 24 puits, puis étendez la culture dans des plaques à 6 puits. Nous fournissons ici un protocole basé sur une plaque à 6 puits. - Le lendemain, aspirez le mTeSR et lavez les cellules avec 2 mL de DPBS.
- Ajouter 2 mL de milieu de stade I (milieu de différenciation de cellules souches contenant de 8 à 12 μM CHIR99021) (tableau 1), voir jour 0.
- Cultivez-les dans un incubateur à 37 °C pendant 4 jours, rafraîchissez le milieu de stade I tous les deux jours.
2. Induire un mésoderme intermédiaire néphrogénique (IM)
- Le jour 4, retirez le milieu de stade I et lavez avec 2 ml de DPBS.
- Ajouter 2 mL de milieu de stade II aux cellules (milieu de différenciation des cellules souches contenant 200 ng/mL de FGF9, 1 μg/mL d’héparine et 1 μM CHIR99021) (tableau 1).
- Cultivez-les dans un incubateur à 37 °C et rafraîchissez le milieu tous les 2 jours jusqu’au jour 7.
3. Génération d’organoïdes rénaux en culture en suspension
REMARQUE : Pendant la période d’observation du jour 0 au jour 7, l’état des cellules est critique. Si les cellules présentent une expansion réussie et s’accumulent sans débris cellulaires significatifs, cela démontre la dérivation réussie du mésoderme intermédiaire (IM), indiquant la volonté de passer à l’étape suivante. Cependant, si les cellules montrent des signes d’apoptose initiale, suivis d’une nécrose ou d’une rupture, cela peut indiquer des concentrations inappropriées de CHIR99021 ou de densités cellulaires.
- Le jour 7, retirez le milieu de stade II et lavez les cellules avec 2 mL de DPBS.
- Ajouter 1 mL de la solution de décollement cellulaire dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 5 min jusqu’à ce que les cellules soient réfractives sous contraste de phase.
- Pipeter 1 mL de milieu de stade II sur les cellules, mélanger et s’assurer que les cellules se sont décollées de la surface.
- Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et centrifuger à 400 x g pendant 3 min à température ambiante.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 2 mL de milieu de stade III (milieu de différenciation des cellules souches contenant 200 ng/mL de FGF9, 1 μg/mL d’héparine et 1 μM CHIR99021 dans 0,1 % de méthylcellulose (MC), 0,1 % d’alcool polyvinylique (PVA)) complété par un inhibiteur de la kinase Rho 10 μM (Y-27632) (voir le tableau des matériaux). Mélangez délicatement.
- Mélangez la suspension cellulaire et la graine dans une plaque à 6 puits à faible adhérence dans un rapport de 1 :3. Placer la plaque sur un agitateur orbital (résistant au CO 2, tournant à 60 tr/min) dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2.
- 24 h plus tard, retirer l’inhibiteur de la kinase Rho (Y-27632) et ajouter un milieu de stade III (supplément de milieu de différenciation des cellules souches avec 200 ng/mL de FGF9, 1 μg/mL d’héparine, 1 μM CHIR99021, 0,1 % de MC, 0,1 % de PVA). Culture pendant 2 jours. Modifiez le milieu dans la culture de suspension en suivant les étapes ci-dessous :
- Coupez l’embout de la pipette de 1 mL à l’aide de ciseaux aseptiques.
- Secouez doucement la plaque à 6 puits pour disposer les organoïdes au milieu de la plaque.
- Aspirer les organoïdes avec les pipettes préparées dans un tube de 15 ml et les laisser reposer pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et laisser les organoïdes au fond du tube.
- Ajouter le milieu frais pour remettre les organoïdes en suspension et replaquer dans une plaque à 6 puits à faible adhérence.
- Continuez à agiter la plaque à faible adhérence à 60 tr/min dans l’incubateur. Changez le milieu de stade III tous les deux jours jusqu’au jour 12.
- Le jour 12, changer le milieu pour un milieu de stade IV (milieu de différenciation des cellules souches contenant 0,1 % de MC et 0,1 % de PVA).
- Changez le support tous les deux jours jusqu’au jour 25. Les organoïdes peuvent progressivement se développer en structures néphroniques matures du jour 12 au jour 25.
4. Coloration par immunofluorescence d’organoïdes rénaux
- Recueillir les organoïdes rénaux dans un tube de 15 ml et laver avec 2 ml de PBS.
- Après avoir laissé reposer pendant 5 à 10 minutes, fixez les organoïdes rénaux dans du PFA à 2 % fraîchement préparé pendant 20 minutes à 4 °C.
- Retirez le PFA et lavez les organoïdes avec 1 mL de PBS contenant 0,3 % de Triton X-100 (0,3 % de PBST), agitez-le uniformément sur un agitateur (avec une vitesse de rotation ne dépassant pas 60 tr/min) pendant 8 min, laissez-le reposer pendant 5 min, puis retirez le surnageant. Répétez trois fois.
REMARQUE : Les organoïdes peuvent être conservés dans du PBST à 0,3 % à 4 °C pendant 2 à 4 semaines. - Incuber les organoïdes fixés avec 10 % de sérum d’ânesse dans du PBST (tampon de blocage) (voir tableau des matériaux) pendant une nuit à 4 °C.
- Diluer les anticorps primaires (énumérés dans le tableau des matériaux) dans un tampon bloquant avec un rapport de 1 :300.
- Incuber les organoïdes avec les anticorps primaires pendant une nuit à 4 °C avec agitation.
REMARQUE : Assurez-vous que les glomérules et les tubules peuvent être colorés simultanément sur un organoïde. - Lavez les organoïdes avec 1 mL de PBST à 0,3 %, agitez-les uniformément sur un shaker (avec une vitesse de rotation ne dépassant pas 60 tr/min) pendant 8 min, laissez-les reposer pendant 5 min, puis retirez le surnageant. Répétez trois fois.
- Incuber les organoïdes avec des anticorps secondaires (énumérés dans le tableau des matériaux) et du DAPI pendant une nuit à 4 °C avec agitation. Répétez ensuite l’étape 4.7.
REMARQUE : L’anticorps secondaire et le DAPI sont dilués dans une solution bloquante, un anticorps secondaire (1 :400) et un DAPI (1 :1000). - Après la coloration, déshydrater les organoïdes avec du méthanol (25 %, 50 %, 75 % et 100 % pendant 5 min chacun), puis imprégner d’alcool benzylique et de benzoate de benzyle (BABB, rapport 1 :2) (voir tableau des matériaux) pendant 5 min.
- Moudre les organoïdes dégagés sur une boîte à fond de verre (voir le tableau des matériaux) et les examiner par microscopie confocale.
REMARQUE : Lors de l’imagerie, choisissez la boîte de Pétri au fond de la boîte en verre et, lors de la perméation, placez le BABB directement dans la boîte de Pétri pour garder le fond de la boîte humide.
5. Dosage in vitro de l’absorption du dextran
- Le jour 25, incuber les organoïdes avec 100 μg/mL de dextran marqué par fluorescence (voir tableau des matériaux) pendant 4 h dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
- 4 heures plus tard, passez à un milieu neuf et capturez des images de culture de cellules vivantes à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ.
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Résultats
La production d’IM est obtenue en activant la signalisation WNT canonique à l’aide de l’inhibiteur GSK3 CHIR99021, suivi de FGF9/héparine. Du jour 0 au jour 4, les cellules iPS se dilatent rapidement et prennent des formes rhomboïdales ou triangulaires. La confluence atteint 90%-100% et s’accumule uniformément jusqu’au jour 7. Lors de la culture en suspension, les agrégats forment spontanément des structures néphroniques après s’être dissociés le jour 7. Les organoïdes rénaux créés par culture en suspension présentent de...
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Discussion
Un protocole détaillé a été décrit pour générer des organoïdes rénaux à partir de CSPi, impliquant des modifications mineures du milieu basal, de la densité cellulaire initiale et de la concentration de CHIR99021. Dans diverses expériences, les facteurs critiques pour une génération réussie d’organoïdes rénaux se sont avérés être la différenciation initiale du mésoderme intermédiaire (IM) et l’état cellulaire au jour 7. De plus, différentes lignées de CSPi présentaient des variations dans le potentiel de prolifération et...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont signalé aucun conflit d’intérêts potentiel.
Remerciements
Nous sommes extrêmement reconnaissants à tous les membres du Mao et du Hu Lab, passés et présents, pour les discussions intéressantes et les grandes contributions au projet. Nous remercions le Centre national de recherche clinique pour la santé de l’enfant pour son grand soutien. Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (U20A20351 à Jianhua Mao, 82200784 à Lidan Hu), la Fondation des sciences naturelles de la province chinoise du Zhejiang (No. LQ22C070004 à Lidan Hu) et la Fondation des sciences naturelles de la province du Jiangsu (subventions n° BK20210150 à Gang Wang).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plaque de culture cellulaire à 96 puits, fond plat | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Chat #07920 | |
| Anticorps | |||
| Alcool benzylique | Sigma-Aldrich | Chat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Chat #120-51-4 | |
| Enceinte de sécurité biologique | Haier | Cat #HR40 | |
| Biotine anti-humaine LTL (1:300) | Vector Laboratories | Chat #B-1325 | |
| Cellules mononucléées sanguines hiPS-B1 (iPSc, femelle) | N/A | N/A | |
| Agitateur de niveau de dioxyde | de carbone HAMANY | Chat #C0-06UC6 | |
| Produits chimiques, peptides et protéines | |||
| CHIR99021 (activateur de la voie Wnt) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Chat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Chat #G4610 | |
| Âne Anti-Mouton IgG H& L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (sans calcium, magnésium, rouge de phénol) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Chèvre Anti-Lapin IgG (1:400) | Earthox | Chat #E032220 | |
| Dylight 549-Chèvre Anti-Souris IgG (1:400) | Earthox | Chat #E032310 | |
| Dylight 549-Chèvre Anti-Lapin IgG (1:400) | Earthox | Chat #E032320 | |
| Dylight 649-Chèvre Anti-Lapin IgG (1:400) | Earthox Chat #E032620 | ||
| Modèles expérimentaux : Lignées cellulaires | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubateur | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Plats de culture à fond de verre | NEST | Cat #801002 | |
| Chèvre anti-humaine CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Solution d’héparine (supplément de culture cellulaire) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Humain Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Microscope inversé | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Microscope confocal | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro centrifugeuse | HENGNUO | Chat #2-4B | |
| Souris anti-humaine CD31 (1:300) | BD Biosciences | Chat #555444 | |
| Souris anti-ECAD humaine (1:300) | BD Biosciences | Chat #610182 | |
| Souris anti-humaine Integrine bêta 1 (1:300) | Abcam | Chat #ab30394 | |
| Souris anti-humaine MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Chat #39795 | |
| Mowiol 4-88 ( Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Autres | |||
| Lapin anti-humain GATA3 (1:300) | Technologie de signalisation cellulaire | Chat #5852S | |
| Lapin anti-humain LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Chat #NBP2-39033 | |
| Lapin anti-humain Synaptopodine (1:300) | Abcam | Chat #ab224491 | |
| Lapin anti-humain WT1 (1:300) | Abcam | Chat #ab89901 | |
| Lapin anti-souris PDGFR (1:300) | Abcam | Chat #ab32570 | |
| Albumine sérique humaine recombinante (rHSA) | YEASEN | Chat #20901ES03 | |
| Mouton anti-humain NPHS1 (1:300) | R& D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Références
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Réimpressions et autorisations
