Isolement, culture et induction adipogénique de préadipocytes dérivés de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux périaortique de souris

Résumé

Ici, nous décrivons l’isolement, la culture et l’induction adipogénique de préadipocytes dérivés de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux périaortique de souris, permettant l’étude de la fonction du tissu adipeux périvasculaire et de sa relation avec les cellules vasculaires.

Résumé

Le tissu adipeux périvasculaire (TVAP) est un dépôt de tissu adipeux qui entoure les vaisseaux sanguins et présente les phénotypes d’adipocytes blancs, beiges et bruns. Des découvertes récentes ont mis en lumière le rôle central de la PVAT dans la régulation de l’homéostasie vasculaire et la participation à la pathogenèse des maladies cardiovasculaires. Une compréhension globale des propriétés et de la réglementation de la PVAT est d’une grande importance pour le développement de thérapies futures. Les cultures primaires d’adipocytes périaortiques sont précieuses pour étudier la fonction PVAT et la diaphonie entre les adipocytes périaortiques et les cellules vasculaires. Cet article présente un protocole économique et réalisable pour l’isolement, la culture et l’induction adipogénique de préadipocytes dérivés de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux périaortique de souris, qui peut être utile pour la modélisation de l’adipogenèse ou de la lipogenèse in vitro. Le protocole décrit le traitement tissulaire et la différenciation cellulaire pour la culture des adipocytes périaortiques à partir de jeunes souris. Ce protocole constituera la pierre angulaire technologique de la paillasse pour l’étude de la fonction PVAT.

Introduction

On pense que le tissu adipeux périvasculaire (TVAP), une structure périvasculaire composée d’un mélange d’adipocytes matures et d’une fraction vasculaire stromale (SVF), interagit avec la paroi vasculaire adjacente via son sécrétome paracriné^. En tant que régulateur essentiel de l’homéostasie vasculaire, le dysfonctionnement de la PVAT est impliqué dans la pathogenèse des maladies cardiovasculaires ^2,3,4. La SVF du tissu adipocytaire est constituée de plusieurs populations cellulaires attendues, notamment des cellules endothéliales, des cellules immuni....

Protocole

Les protocoles pour animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’hôpital thoracique de Shanghai, affilié à la faculté de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai (numéro d’approbation : KS23010) et étaient conformes aux réglementations éthiques pertinentes. Les souris mâles et femelles C57BL/6 âgées de 4 à 8 semaines sont à privilégier pour cette expérience.

1. Préparation des outils chirurgicaux, des tampons et des milieux de culture

1. Autoclaver les outils chirurgicaux (p. ex., ciseaux chirurgicaux et pinces standard) à 121 °C pendant 30 min. Désinfecter l....

Résultats

À l’aide de ce protocole décrit ci-dessus, nous avons soigneusement isolé les PVAT entourant les aortes thoraciques de souris (Figure 1A-D). Après avoir lavé et haché les PVAT en petits morceaux à l’aide de ciseaux stériles (Figure 1E,F), des fragments de tissu ont été digérés dans une solution de digestion contenant de la collagénase de type 1 (1 mg/mL) et de la dispase II (4 mg/mL) et incubés à 37 °C sur un agitateur pendant 30 à 45 min (<.......

Discussion

Nous proposons une approche pratique et réalisable pour l’isolement et l’induction adipogénique de préadipocytes dérivés de SVF à partir de tissu adipeux périaortique de souris. Les avantages de ce protocole sont qu’il est simple et économique. Un nombre adéquat de souris est essentiel pour un isolement réussi, car un tissu insuffisant peut entraîner une faible densité de SVF et un mauvais état de croissance, affectant finalement l’efficacité lipogénique. De plus, l’âge de la souris est un facteur important à prendre en .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,2 &mu ; filtres à seringue m	PALL	4612
plaque 12 puits  ;	Labselect	11210
Tube à centrifuger de 15 mL	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL tube à centrifuger	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectine	Abcam	ab22554	1:1 000 concentration de travail
anti-COX IV	CST	4850	Concentration de travail 1:1 000
anti-FABP4	CST	2120	Concentration de travail 1:1 000
anti-PGC1&alpha ;	Abcam	ab191838	1:1 000 concentration de travail
anti-PPAR&gamma ;	Invitrogen	MA5-14889	1:1 000 concentration de travail
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1 000 concentration de travail
anti-&alpha ;-actinine	CST	6487	1:1 000 concentration de travail
BSA	Beyotime	ST023-200g	1 %
C57BL/6 souris âgées de 4 à 8 semaines des deux sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Filtre cellulaire 70 & micro ; m, nylon	Falcon	352350
Collagène de peau de veau	Sigma-Aldrich	C8919
Collagénase de type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexaméthasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 &mu ; M
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Sérum fœtal bovin  ;	Gibco	16000-044	10 %
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX  ;	Incubateur Sigma-Aldrich	I7018	0,5 mM
avec agitateur orbital	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co., Ltd.	LYZ-103B
Insuline (bovins)  ;	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 &mu ; M
isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer’s Solution	Pricella  ;	PB180347	protéger de la lumière  ;
Pince microchirurgicale	Beyotime	FS233
Ciseaux microchirurgicaux	Beyotime	FS217
Huile Rouge O  ;	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15140122
Peroxydase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch  ;	115-035-146	Concentration de travail 1:5 000
Peroxydase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch  ;	111-035-144	Concentration de travail 1:5 000
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 &mu ;
M Pince standard	Beyotime	FS225
Ciseaux chirurgicaux	Beyotime	FS001

à