Étude de la dynamique transcriptionnelle musculaire à l’échelle d’une seule molécule chez la drosophile

Summary

La drosophile est un modèle bien établi pour l’étude des molécules clés qui régulent la myogenèse. Cependant, les méthodes actuelles sont insuffisantes pour déterminer la dynamique transcriptionnelle de l’ARNm et la distribution spatiale au sein de la syncytia. Pour remédier à cette limitation, nous avons optimisé une méthode d’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN permettant la détection et la quantification des ARNm à l’échelle d’une seule molécule.

Abstract

Les muscles squelettiques sont de grandes syncytia composées de nombreuses myofibres groupées qui produisent des forces et permettent le mouvement du corps. La drosophile est un modèle classique pour étudier la biologie musculaire. La combinaison de la génétique de la drosophile et d’approches omiques avancées a conduit à l’identification de molécules clés conservées qui régulent la morphogenèse et la régénération musculaires. Cependant, la dynamique transcriptionnelle de ces molécules et la distribution spatiale de leur ARN messager au sein de la syncytia ne peuvent pas être évaluées par les méthodes conventionnelles. Ici, nous avons optimisé une méthode existante d’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN à molécule unique (smFISH) pour permettre la détection et la quantification de molécules d’ARNm individuelles dans les muscles de vol adultes et leurs cellules souches musculaires. En guise de preuve de concept, nous avons analysé l’expression et la distribution de l’ARNm de deux facteurs de transcription conservés au cours de l’évolution, Mef2 et Zfh1/. Nous montrons que cette méthode permet de détecter et de quantifier efficacement des molécules d’ARNm uniques pour les transcrits dans les cellules précurseurs musculaires, les muscles adultes et les cellules souches musculaires.

Introduction

Les muscles squelettiques adultes sont constitués de myofibres multinucléées différenciées dont les propriétés contractiles génèrent des mouvements. La croissance, l’entretien et la régénération musculaires reposent sur des progéniteurs musculaires et des cellules souches musculaires (MuSC) qui sont spécifiés au cours du développement embryonnaire¹. Le programme myogénique est finement contrôlé par un ensemble de facteurs de transcription myogéniques (TF) de base (par exemple, Pax3/7, MYOD, Mef2 et)^2,3,4. Décrypter les mécanismes moléculaires régulant la biologie musculaire est important pour élucider des questions fondamentales liées à la myologie et pour une éventuelle utilisation thérapeutique dans le traitement des maladies dégénératives musculaires.

La drosophile a une longue histoire en tant que modèle génétique pour étudier la myogenèse⁵. Il est récemment apparu comme un nouveau modèle pour étudier la régénération musculaire ^6,7,8. La structure musculaire et les programmes myogéniques de base sont hautement conservés entre les mouches et les mammifères. Par exemple, les TF Mef2 et Zfh1/ont une fonction conservée dans la régulation du développement et de la régénération musculaire 3,9,10,11. Les muscles de la drosophile adulte, tels que les muscles du vol indirect (IFM), sont formés à partir d’une population spécifique de MuSC, connue sous le nom de progéniteurs musculaires adultes (AMP)¹². Ces AMP sont spécifiées au cours de l’embryogenèse et s’associent à des structures épithéliales telles que les disques des ailes et des pattes. Tout au long des stades embryonnaire et larvaire, les AMP restent indifférenciées jusqu’à la métamorphose, lorsqu’elles s’engagent dans la différenciation et la fusion pour former les IFM^13,14. Le TF Spalt major (spalt, salm) s’exprime au cours du développement musculaire en vol et est nécessaire pour déterminer leur identité structurale¹⁵. Mef2 est un autre TF myogénique important qui est essentiel à la formation des muscles adultes^16,17. Elle est exprimée dans les SAP et maintenue dans les IFM adultes^10,18. Alors que la majorité des AMP se différencient en muscles fonctionnels, un sous-ensemble échappe à la différenciation et forme les MuSCs adultes¹¹. À l’instar des vertébrés, le TF Zfh1/est nécessaire pour prévenir la différenciation prématurée des MuSC adultes et pour maintenir leur tige ^9,10.

Il a été prouvé que la dynamique de l’expression génique régule divers processus biologiques musculaires^19,20. L’avènement des techniques de séquençage de l’ARN unicellulaire et mononoyau à haut débit a permis une exploration complète de ces dynamiques transcriptionnelles^21,22. Une limite notable de ces approches est leur incapacité à fournir la distribution spatiale des molécules d’ARNm dans les fibres musculaires multinucléées. Ces caractéristiques peuvent être étudiées par hybridation in situ par fluorescence à molécule unique (smFISH) qui révèle deux types de corps d’ARNm : 1. les molécules d’ARNm individuelles réparties dans le cytoplasme et représentant l’ARN mature et 2. Un maximum de deux foyers nucléaires brillants correspondent au transcrit naissant et révèlent les allèles transcriptionnellement actifs²³. Par conséquent, smFISH est une méthode de choix pour la quantification des molécules d’ARNm individuelles, en étudiant leur distribution spatiale et en fournissant des instantanés de la dynamique transcriptionnelle des gènes.

La méthode smFISH repose sur un ensemble de sondes oligonucléotidiques fluorescentes courtes spécifiquement conçues pour être complémentaires au transcrit cible. Lors du recuit, il génère des sources ponctuelles de haute intensité permettant la détection de l’ARNm à l’échelle d’une seule molécule à l’aide de la microscopie confocale²⁴. Cette méthode est de plus en plus appliquée à une grande variété de types de cellules, y compris les tissus musculaires des mammifères^19,20. Cependant, chez la drosophile comme chez d’autres modèles animaux, la plupart des connaissances sur l’expression des gènes musculaires adultes proviennent de tests moléculaires en vrac, qui manquent d’informations quantitatives sur la localisation spatiale des molécules d’ARNm. Ici, nous avons optimisé une méthode pour réaliser smFISH sur des cellules précurseurs musculaires et des muscles de drosophile adultes^23,25. Ce protocole comprend un pipeline d’analyse entièrement automatisé pour la segmentation des noyaux et le comptage et la localisation de l’ARNm.

Protocol

1. Dissection et préparation du disque alaire et du muscle adulte

REMARQUE : Nettoyez le banc de dissection et tous les instruments de dissection avec une solution d’inhibiteur de l’ARNase (tableau des matériaux). Des gants de laboratoire doivent être portés pendant toute la durée de l’expérience.

1. Disque d’aile
   1. Placer les larves stadifiées L3 dans une solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS) (figure 1A).
   2. Rincez les larves 3 fois avec 1 PBS et gardez-les dans cette solution pendant 5 min.
   3. À l’aide de deux paires de pinces tranchantes, tenez la larve de la partie antérieure et tirez et jetez le reste des tissus du corps (environ 2/3).
   4. Tenez à la fois le premier 1/3 de la larve avec une paire de pinces et les crochets buccaux avec l’autre paire. Rétractez les crochets buccaux à l’intérieur de la larve jusqu’à ce qu’elle soit complètement inversée.
      NOTA : Disséquer environ 30 larves par expérience afin de s’assurer que la taille de l’échantillon est adéquate pour l’analyse.
   5. Observez que les disques alaires sont étroitement associés aux deux branches primaires des trachées, qui longent chaque côté de la larve.
   6. Retirez tous les autres composants larvaires (disques des pattes et cerveau) pour obtenir une carcasse larvaire inversée propre avec une paire de disques alaires attachés à la trachée (figure 1B).
   7. Placez les échantillons dans un tube à centrifuger de 1 mL et fixez-les dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dilué dans 1x PBS pendant 45 min à température ambiante sous agitation.
      REMARQUE : L’agitation de l’échantillon est réalisée par un agitateur oscillant (tableau des matériaux).
   8. Lavez les échantillons 3 x 5 min avec de l’éthanol à 70 % (EtOH, dilué dans de l’eau sans RNAse) et conservez-les dans la même solution de lavage à 4 °C pendant au moins 2 jours et jusqu’à 1 semaine.
2. Muscles du vol indirect
   1. Anesthésiez les mouches adultes sur un coussin anti-mouches au CO₂ et retirez la tête, l’abdomen, les pattes et les ailes.
   2. Placez les thorax disséqués dans 1x PBS froid et continuez ainsi jusqu’à ce que tous les échantillons soient disséqués (Figure 1D).
   3. Préfixer les thoraxes dans du PFA à 4 % (1 % de Triton) pendant 20 min à température ambiante sous agitation.
   4. Rincez les échantillons 3 x 5 min avec 1 solution de lavage PBT (1 % de Triton dans 1 PBS).
   5. Positionnez les thoraxes sur un ruban adhésif double face (Table des matériaux) sur une lame de verre et coupez-les en deux avec une lame de microtome tranchante pour produire deux hémi-thoraces (Figure 1E,F).
   6. Fixer les échantillons dans du PFA à 4 % (1 % de Triton) pendant 45 min à température ambiante sous agitation.
   7. Laver 2 x 20 min avec 1x solution de lavage PBT (1% Triton, 1x PBS) à température ambiante sous agitation.
   8. Placez les hémi-thoraces dans un PBS 1x froid et utilisez la pince pour isoler doucement les IFM de l’hémi-thorace (Figure 1G).
      REMARQUE : Pour y parvenir, il est important d’enlever la cuticule aussi soigneusement que possible.
   9. Pour perméabiliser les échantillons, stocker les IFM isolés dans une solution d’EtOH à 70 % pendant au moins 2 jours et jusqu’à 1 semaine à 4 °C.
      REMARQUE : Isolez les IFM d’environ 10 thorax par expérience afin de vous assurer que la taille de l’échantillon est adéquate pour l’analyse.

2. Hybridation, immunomarquage et montage

NOTA : Une procédure d’hybridation similaire est appliquée pour les échantillons de disques d’ailes et d’IFM. Il est essentiel d’isoler les disques alaires des carcasses de larves et de les placer dans 200 μL de tampon A avant de commencer l’hybridation.

1. Remettre les sondes en suspension dans 400 μL de tampon TE (10 mM de Tris-HCl, 1 mM d’EDTA, pH 8,0) pour obtenir une solution mère finale de 12,5 μM.
2. Transférez les échantillons dans un tube à centrifuger de 0,5 ml contenant le tampon A (tableau des matériaux).
   REMARQUE : En diminuant le volume du récipient, il devient plus facile de visualiser les échantillons et d’éviter de les perdre pendant le processus de lavage.
3. Laver les échantillons 2 x 20 min avec le tampon A.
4. Aspirer le tampon A, le remplacer par 400 μL du tampon d’hybridation (Tableau des matériaux) et pré-hybrider les échantillons pendant 30 min à 37 °C dans un mélangeur thermique (Tableau des matériaux).
5. Diluer les sondes à une concentration finale de 125 nM pour les disques alaires et de 200 nM pour les muscles adultes, dans le tampon d’hybridation et ajouter l’anticorps primaire.
   REMARQUE : La dilution de l’anticorps varie en fonction de l’anticorps spécifique utilisé (tableau des matériaux). L’ajout d’anticorps est facultatif. Les utilisateurs peuvent choisir de renoncer à la coloration des protéines et d’utiliser à la place un protocole smFISH similaire qui n’inclut pas l’ajout d’anticorps.
6. Aspirer le tampon d’hybridation et le remplacer par 100 μL de tampon d’hybridation contenant la sonde et l’anticorps.
7. Incuber les échantillons dans l’obscurité à 37 °C pendant au moins 16 h sous une agitation de 300 tr/min dans un mélangeur thermique.
8. Réchauffer une aliquote de tampon A à 37 °C.
9. Laver les échantillons pendant 3 x 10 min dans le mélangeur thermique à 37 °C sous une agitation de 300 tr/min.
10. Lors du dernier lavage, diluer l’anticorps secondaire (1/200) et le DAPI (1/10 000) dans le tampon A et incuber les échantillons dans cette solution à 37 °C pendant au moins 1 h.
11. Lavez les échantillons pendant 3 x 20 min avec le tampon B (table des matériaux).
12. Transférez soigneusement les échantillons sur une lame de microscope, essuyez le tampon B résiduel et ajoutez 30 μL de milieu de montage et recouvrez d’une lamelle de 18 x 18 mm. Utilisez un vernis à ongles pour sceller la préparation.
13. Conservez les échantillons jusqu’à 1 semaine à 4 °C.
    REMARQUE : Cependant, il est recommandé d’effectuer l’imagerie dès que possible pour éviter la dégradation du signal de la sonde.

3. Imagerie

1. Acquérir des images avec un mode d’acquisition xyz à l’aide d’un microscope confocal équipé d’objectifs à immersion dans l’huile 40x et 63x (Table des matériaux). Le signal smFISH est détecté par le détecteur HyD via un mode de comptage de photons.
2. Localisez les échantillons à l’aide du signal DAPI et de la lampe UV.
3. Pour imager les progéniteurs musculaires et les IFM associés au disque alaire (Figure 2 et Figure 3), appliquez la configuration suivante pour les lignes laser et les filtres d’émission : sélectionnez DAPI (excitation (ex.) 405 nm, émission (em.) 450 nm), Alexa Fluor 488 (ex. 496 nm, em. 519 nm), et Quasar 670 pour les sondes smFISH (ex. 647 nm, em. 670 nm).
4. Pour imager les MuSC adultes (Figure 2D), appliquez la configuration suivante pour les lignes laser et les filtres d’émission : sélectionnez DAPI (ex. 405 nm, em. 450 nm), Alexa Fluor 488 (ex. 496 nm, em. 519 nm), Alexa Fluor 555 (ex. 555 nm, em. 565 nm), et Quasar 670 pour les sondes smFISH (ex. 647 nm, em. 670 nm).
   NOTE : Pour l’imagerie, les longueurs d’onde peuvent être adaptées en fonction des colorants associés aux anticorps secondaires et aux sondes.
5. Enregistrez les images confocales au format . fichiers TIFF.

4. Analyse post-imagerie

1. Pour commencer, lancez ImageJ et accédez au menu Plugins . À partir de là, sélectionnez Macros | Modifier pour ouvrir le code source des macros.
   REMARQUE : Cela permet d’ajuster les paramètres selon les besoins et, si nécessaire, de modifier le répertoire de dossier pour chaque canal dans le code source de la macro.
2. Pour suivre ce protocole et quantifier les taches Mef2 smFISH chez les larves, utilisez les paramètres suivants : Log_radius = 3,0 et Log_quality = 20,0. Noyaux positifs Mef2 avec flou = 2 ; nucleus_scale_parameter = 30 ; nucleus_threshold = -8,0 ; nucleus_size = 300.
3. Dans les fibres musculaires, utilisez les paramètres suivants : Log_radius = 2,5 ; Log_quality = 60,0 ; flou = 2 ; nucleus_scale_parameter = 100 ; nucleus_threshold = 0,0 ; nucleus_size = 300.
4. Pour lancer la macro, il suffit d’exécuter la commande run et d’attendre que la macro charge automatiquement toutes les images du dossier désigné et les quantifie de manière séquentielle.
   REMARQUE : Veuillez noter que la durée de ce processus peut varier de quelques secondes à plusieurs heures, selon le volume de données analysées.
5. Recherchez les résultats affichés dans deux nouveaux fichiers .csv : file_FISH_results et file_nuclei_results. La première indique le nombre de taches transcriptionnelles et leurs intensités moyennes et maximales. La seconde donne à la fois le nombre total de noyaux et le nombre de taches à l’intérieur de chaque noyau.

Results

Dans ce protocole, nous avons utilisé des sondes produites commercialement ciblant les ARNm Mef2 et zfh1. Nous avons conçu les sondes avec le concepteur de sondes FISH (Table of Materials) du fabricant. L’ensemble Mef2 cible les exons communs à toutes les isoformes de l’ARN Mef2 (de l’exon 3 à l’exon 10). L’ensemble zfh1 cible le troisième exon commun aux isoformes 10 de zfh1-RB et zfh1-RE. Les deux sondes sont conjuguées au colorant fluorescent Quasar 670.

Nous avons généré une macro en interne compatible avec le logiciel ImageJ pour analyser automatiquement les données brutes .tif. La macro permet la segmentation 3D des noyaux par Cellpose²⁶ avec le plugin Fiji BIOP et la quantification ponctuelle transcriptionnelle par un laplacien de Gaussienne telle qu’implémentée dans le plugin Trackmate²⁷. Le plugin MorpholibJ²⁸ est utilisé pour le post-traitement (Fichier supplémentaire 1).

Dans un premier temps, nous avons réalisé smFISH sur des disques imaginaux d’ailes, où Mef2 et zfh1 sont connus pour être exprimés dans les AMPs. Ces données montrent que les deux transcrits sont uniformément détectés dans la population d’AMPs co-colorés avec des anticorps Mef2 ou Zfh1 (Figure 2A,B). Les sites de transcription actifs (TS) peuvent être révélés et distingués de l’ARNm mature par smFISH car ils ont tendance à être plus grands et à avoir des signaux plus intenses que les transcrits cytoplasmiques individuels ou les transcrits nucléaires matures. De manière constante, des grossissements plus élevés des AMP font la distinction entre les foyers de TS et les ARNm matures dispersés dans le cytoplasme (Figure 2A',B'), validant la sensibilité de ce protocole smFISH. Il convient cependant de mentionner que nous avons observé un TS actif par noyau pour zfh1 et Mef2 (Figure 2A',B')). Ces données valident davantage la précision de la conception de la sonde puisque les modèles transcriptionnels Mef2 et zfh1 dans les AMP colocalisent avec la détection de leurs protéines respectives (Figure 2).

Dans un deuxième temps, nous avons examiné le site de transcription et la distribution des ARNm Mef2 et zfh1 dans les IFM adultes différenciés et les cellules souches associées (Figure 2C,D). Ces données illustrent clairement les TS de Mef2 dans les noyaux musculaires syncytiaux et la distribution de l’ARNm de Mef2 dans tout le cytoplasme (Figure 2C,C'). Zfh1 marque spécifiquement la population des MuSCs ^10,11. En utilisant ce protocole smFISH, nous avons détecté avec succès la transcription de zfh1 dans les MuSCs marqués par l’expression de Zfh1-Gal4 > GFP. Un grossissement plus élevé illustre la détection à la fois des ARNm zfh1 TS et des ARNm simples cytoplasmiques (Figure 2D').

Enfin, nous avons utilisé notre macro ImageJ construite en interne pour analyser quantitativement la dynamique transcriptionnelle et la distribution spatiale de Mef2. Le pipeline de calcul peut détecter et segmenter efficacement les taches Mef2 et les noyaux musculaires (Figure 3A-C). Cependant, en raison de problèmes de rapport signal/bruit, certains points peuvent ne pas être détectés dans certains cas (Figure 3A',B'). Nous avons utilisé cette méthode automatisée pour étudier si l’abondance de l’ARNm Mef2 varie entre les cellules précurseurs musculaires (AMP) et les IFM adultes différenciés. Notre analyse montre que le nombre d’ARNm Mef2 par noyau dans les IFM adultes et les AMP n’est pas significativement différent (Figure 3D).

Pour mieux comprendre la distribution spatiale des transcrits de Mef2 dans les muscles adultes de l’IFM, nous avons quantifié la fraction des taches d’ARNm Mef2 cytoplasmiques par rapport aux taches nucléaires de Mef2 (Figure 3E,F). À l’aide de notre programme, nous avons compté à la fois le nombre total de taches d’ARNm Mef2 et le nombre de taches d’ARNm Mef2 se chevauchant avec la coloration des noyaux (Mef2). En soustrayant l’ARNm associé aux noyaux du nombre total d’ARNm, on obtient le nombre de taches d’ARNm cytoplasmiques. Nos résultats révèlent qu’environ 92 % de l’ARNm Mef2 est présent dans le cytoplasme, tandis que les 8 % restants sont associés aux noyaux musculaires, comme le montrent les figures 3E, F.

Figure 1 : Procédure de dissection et de préparation des disques alaires et des échantillons d’IFM pour smFISH. (A) Larves stadifiées L3. (B) Extrémité antérieure de la larve disséquée et inversée. Les flèches indiquent les disques alaires. (C) Disque alaire isolé. (D) Thorax adulte disséqué. (E) Thorax adulte orienté sur un ruban adhésif double face avant la bisection (ligne pointillée). (F) Hémithorax adulte. g) Mécanismes de gestion des données isolés. (H) Flux de travail du protocole smFISH. Abréviations : IFM = muscles de vol indirects ; smFISH = hybridation in situ par fluorescence d’ARN à molécule unique ; EtOH = éthanol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Images représentatives des smFISH Mef2 et zfh1 dans les disques alaires et les IFM adultes. (A,B) Les ARNm Mef2 et zfh1 (violet) sont détectés uniformément dans les AMP et co-localisent avec les protéines (A,A') Mef2 et (B,B') Zfh1 (vert), respectivement. (A'',B'') Grossissement plus élevé des AMP. (C) Les ARNm Mef2 et la protéine Mef2 sont détectés dans les IFM adultes. (C') Grossissement plus élevé de la région encadrée en C. (D) L’expression Zfh1-Gal4 >UAS-mCD8GFP (vert) marque les MuSC adultes. ZFH1 L’ARN est détecté dans les MuSC adultes. (D') Grossissement plus élevé de la région encadrée en D. Les sites de départ de la transcription Zfh1 et les ARNm simples sont indiqués par des flèches et des pointes de flèche, respectivement. Coloration DAPI (bleu). Barres d’échelle = 50 μm (A,B,A',B'), 10 μm (A »,B »,C,D), 5 μm (C',D'). Abréviations : IFM = muscles de vol indirects ; smFISH = hybridation in situ par fluorescence d’ARN à molécule unique ; AMP = progéniteurs musculaires adultes ; MuSC = cellules souches musculaires ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; GFP = protéine fluorescente verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Quantification de la transcription de Mef2 et de l’accumulation d’ARNm cytoplasmique par smFISH. (A) Distribution des transcrits Mef2 (violet) et de la protéine Mef2 (vert) dans les IFM adultes de type sauvage. (A') Grossissement plus élevé de la région encadrée dans A. Les sites de départ de la transcription et les ARNm individuels sont indiqués par des flèches et des pointes de flèche, respectivement. (B,C) Recherche automatique de repères Mef2 et segmentation nucléaire. Les ARNm Mef2 cytoplasmique et nucléaire sont indiqués en vert et en magenta, respectivement. (B',C') Grossissements plus élevés des régions encadrées en B et C. Les astérisques indiquent les points qui ne sont pas comptés par la macro. (D) Exemple de quantification ponctuelle de Mef2 dans les AMP et les IFM adultes, par rapport au nombre total de noyaux. (p = 0,0785, test t de Student, disques alaires (n = 4), IFM (n = 11)). (E) Exemple de quantification de la distribution ponctuelle de Mef2 dans les IFM adultes. (*** p< 0,0007, test t de l’étudiant, n = 5). (F) Pourcentage de taches d’ARNm Mef2 détectées à l’intérieur et à l’extérieur des noyaux (n = 5). Barres d’échelle = 10 μm (A,A'). Abréviations : IFM = muscles de vol indirects ; smFISH = hybridation in situ par fluorescence d’ARN à molécule unique ; AMPs = progéniteurs musculaires adultes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Macro utilisée pour le post-traitement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’application de la méthode smFISH a gagné en popularité ces derniers temps, son utilisation s’étendant à divers types de cellules et d’organismes modèles. Cependant, dans le cas de la drosophile, la majorité des connaissances sur l’expression des gènes musculaires adultes proviennent de tests moléculaires en vrac, qui ne fournissent pas d’informations quantitatives sur l’emplacement spatial précis des molécules d’ARNm. Pour combler cette lacune, nous avons optimisé une méthode permettant d’effectuer des smFISH sur des cellules précurseurs musculaires et des muscles de drosophile adultes. Cette approche a été adaptée à partir d’un protocole précédemment publié²³ et optimisée pour les tissus musculaires de la drosophile .

L’obstacle majeur à l’obtention d’images smFISH de haute qualité est l’épaisseur des muscles adultes, qui entrave la pénétration optimale des sondes. Par conséquent, il est crucial de séparer les muscles adultes des autres tissus de l’animal et d’effectuer le processus d’hybridation avec une légère agitation. Cette étape particulière assure une perméabilisation efficace des tissus.

Un autre aspect critique est que le rapport signal/bruit peut entraîner l’échec du pipeline de calcul dans la détection de certaines taches d’ARNm. Nous avons constaté que l’augmentation du rapport signal/bruit peut être obtenue en trouvant la concentration optimale des sondes. La dilution optimale peut différer en fonction de la composition de chaque ensemble de sondes, y compris la composition du colorant conjugué et des oligonucléotides. Nous vous recommandons d’essayer différentes dilutions ; une dilution finale de 200 nM a donné le meilleur rapport signal/bruit pour les tissus adultes dans ces expériences.

Avec la méthode smFISH, il est possible de quantifier le nombre d’ARN nouvellement synthétisés au niveau des foyers TS. Lorsqu’un gène est activement transcrit, plusieurs ARN naissants sont produits simultanément au niveau du TS. En conséquence, l’intensité du TS dépassera celle de l’ARN cytoplasmique mature, et cette caractéristique, combinée à sa localisation nucléaire, peut différencier le TS des ARN cytoplasmiques individuels. Dans le contexte de la biologie musculaire, la détection et la quantification des TS sont particulièrement importantes pour déterminer la synchronisation de la transcription d’un gène spécifique entre les noyaux musculaires au sein d’un même syncytium. Cependant, ce pipeline de calcul n’est pas conçu pour différencier les signaux d’ARNm cytoplasmique et de TS. Comme alternative, nous suggérons de combiner cette méthode smFISH avec d’autres outils d’analyse smFISH bien établis, tels que BayFISH ou FISH-quant ^29,30. Il a été prouvé que ces outils facilitent la segmentation automatisée et les calculs d’intensité de fluorescence des agrégats d’ARN avec une précision remarquable.

Enfin, si smFISH détecte des molécules d’ARNm avec une haute résolution spatiale, il se limite à analyser un petit nombre d’ARNm en même temps. Des méthodes multi-échelles telles que merFISH (hybridation in situ par fluorescence multiplexée résistante à l’erreur) permettent l’analyse simultanée d’un grand nombre d’ARNm³¹ différents. En combinant des sondes oligonucléotidiques et des codes correcteurs d’erreurs, cette méthode facilite la détection de centaines d’espèces d’ARN dans des cellules individuelles.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope confocal SP8	Leica	SP8 DMI 6000
DAPI	ThermoFisher	62248
Ruban adhésif double face  ;	tesa  ;	57910-00000
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Formaldéhyde 16 %	Euromedex	EM-15710
Mef2	anticorps DHSB	NA
PBS 10x	Euromedex	ET330
RNaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020
Sondes Stellaris	LGC	NA
Tampon d’hybridation FISH STELLARIS, RNA FISH	LGC SMC,	SMC-HB1-10
Tampon de lavage STELLARIS RNA FISH, A	LGC	SMF-WA1-60
Tampon de lavage STELLARIS RNA FISH, B	LGC	SMF-WB1-20
Swann-Morton Blades	, Fisher scientific	0210
ThermoMixer	Eppendorf	5382000015
Triton X-100	Euromedex	2000
UAS-mCD8 ::GFP line	Bloomington	RRID :BDSC_5137
Eau ultrapure	Sigma-Aldrich	95284
Montre Verre, Carré, 1 5/8 in  ;	Carolina	742300
Anticorps Zfh1	Offert par Ruth Leahman
Zfh1-Gal4	Bloomington	BDSC : 49924, FLYB : FBtp0059625