Isolement, expansion in vitro et caractérisation de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu adipeux épididymaire de souris

Résumé

Le tissu adipeux est une excellente source de cellules souches mésenchymateuses. Ici, nous apportons étape par étape l’extraction, la culture et la caractérisation de cellules souches dérivées du tissu adipeux adipeux (ADSC) à partir de tissu adipeux épididymaire de souris suisses.

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été largement étudiées en tant que nouvelle approche thérapeutique, principalement pour arrêter l’inflammation exacerbée en raison de leur potentiel à moduler la réponse immunitaire. Les CSM sont des cellules immunitairement privilégiées capables de survivre chez des receveurs de greffes allogéniques immunologiquement incompatibles en raison d’une faible expression de molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I et de l’utilisation de la thérapie cellulaire pour l’allogreffe. Ces cellules peuvent être isolées de plusieurs tissus, les plus couramment utilisés étant la moelle osseuse et les tissus adipeux. Nous fournissons un protocole simple pour isoler, cultiver et caractériser les CSM à partir du tissu adipeux épididymaire de souris. Le tissu adipeux épididymaire est excisé chirurgicalement, physiquement fragmenté et digéré avec une solution de collagénase de type II à 0,15 %. Ensuite, des cellules souches primaires dérivées du tissu adipeux (ADSC) sont cultivées et développées in vitro, et la caractérisation phénotypique est effectuée par cytométrie en flux. Nous fournissons également les étapes pour différencier les ADSC en cellules ostéogéniques, adipogènes et chondrogéniques, suivies d’une caractérisation fonctionnelle de chaque lignée cellulaire. Le protocole fourni ici peut être utilisé pour des expériences in vivo et ex vivo , et comme alternative, les cellules souches dérivées du tissu adipeux peuvent être utilisées pour générer des cellules immortalisées de type MSC.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont des cellules multipotentielles adultes qui se différencient en cellules telles que l’ostéoblaste, le chondroblaste et l’adipocyte ^1,2. Ces cellules résident dans plusieurs organes, et pour cette raison, elles peuvent être extraites de tissus adultes tels que la moelle osseuse, les muscles, la graisse, le follicule pileux, la racine dentaire, le placenta, le derme, le périchondre, le cordon ombilical, les poumons, le foie et la rate ^3,4.

Les effets des CSM sur la physiologie et le système immunitaire ont été rapportés ^5,6. Ces cellules ont été prometteuses pour le traitement de plusieurs maladies, tant en médecine humaine que vétérinaire. Les CSM peuvent contrôler l’inflammation et favoriser l’angiogenèse et l’homéostasie tissulaire par différents mécanismes, tels que le contact cellule-cellule, les facteurs solubles et les petites vésicules extracellulaires 7,8,9,10. De plus, les CSM sont des cellules immunitairement privilégiées capables de survivre chez les receveurs de greffes allogéniques immunologiquement incompatibles, car ces cellules présentent une faible expression des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I et sont utilisées dans la thérapie cellulaire pour la greffe allogénique^11,12. La faible immunogénicité combinée au potentiel de régénération fait des CSM des candidates idéales pour la thérapie cellulaire, telles que la maladie du greffon contre l’hôte (GvHD)¹³, le lupus érythémateux disséminé (LED)¹⁴ et la sclérose en plaques¹⁵, entre^autres16,17.

Malgré le fait que les CSM résident dans plusieurs tissus adultes, le tissu adipeux offre des avantages par rapport à d’autres sources, tels que l’accessibilité pour le prélèvement, avec une intervention chirurgicale minimale ; grand nombre de cellules disponibles avec un taux d’expansion élevé ; et une expansion in vitro facile à l’aide d’un protocole facile à réaliser sans avoir besoin d’équipement spécifique et de matériaux à faible coût 18,19,20. Une fois extraites, les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC) doivent être caractérisées comme établi par la Société internationale de thérapie cellulaire (ISCT)²¹. Ainsi, les CSM doivent présenter une morphologie semblable à celle des fibroblastes, une adhérence à la culture plastique, exprimant un pourcentage élevé (≥95%) de marqueurs mésenchymateux tels que l’endogline (CD105), l’ecto-5'-nucléotidase (CD73) et Thy-1 (CD90), et un faible pourcentage (≤2%) de marqueurs hématopoïétiques tels que l’antigène commun leucocytaire (CD45), la phosphoglycoprotéine transmembranaire (CD34), la glycoprotéine membranaire ancrée glycolipidique (CD14), l’intégrine alpha M (CD11b), la chaîne alpha de la protéine associée au complexe récepteur antigénique des cellules B (CD79α) ou l’antigène de surface des lymphocytes B B4 (CD19) et l’antigène leucocytaire humain de classe II (HLA-II). De plus, une caractérisation fonctionnelle est nécessaire et les cellules doivent être capables de se différencier en cellules ostéoblastes, chondroblastes ou adipoblastes²¹.

Ici, nous montrons comment obtenir les CSM à partir du tissu adipeux épididymaire en utilisant la dissociation mécanique et la digestion enzymatique pour les études in vitro et la caractérisation morphologique préconçue par l’ISCT.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux directives internationales en matière d’éthique animale et ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d’utilisation de l’Université d’État de Santa Cruz sous le numéro de protocole 021/22. Des souris mâles suisses (6-8 semaines) ont été acquises du laboratoire de recherche animale de l’Université d’État de Santa Cruz (LaBIO-UESC), maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes, recevant de l’eau et de la nourriture à volonté avec des cycles lumière/obscurité de 12 heures.

REMARQUE : D’autres lignées de souris peuvent être utilisées ; Nous recommandons l’utilisation de souris adultes (6-8 semaines) car elles ont un tissu adipeux plus développé et des cellules à forte activité proliférative.

1. Préparation

REMARQUE : Avant de continuer, préparez les réactifs suivants décrits ci-dessous. Consultez la Table des matériaux pour obtenir des informations sur les réactifs et les fournisseurs de matériaux. Des équipements de protection individuelle tels que des masques, des casquettes, des blouses de laboratoire et des gants doivent être portés dans toutes les procédures pratiques.

1. Extraction du tissu adipeux épididymaire
   1. Réservez le matériel chirurgical : trois jeux de pinces et de ciseaux stériles, cinq aiguilles et un bécher contenant 200 ml d’éthanol à 70 %.
   2. Préparez un anesthésique terminal, en mélangeant de la kétamine (100 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg).
2. La culture des ADSC
   1. Milieu de base : Préparez le milieu à haute teneur en glucose Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 50 μg/mL de gentamicine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B, 100 U/mL de pénicilline et 100 mg/mL de streptomycine.
   2. Solution de digestion : Préparez 0,15 % de collagénase de type II dans du PBS stérilisé dans un filtre de 0,25 μm.
      REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’utiliser les quatre antibiotiques décrits dans le milieu basal. Cela dépendra des conditions de culture cellulaire du laboratoire où cela est effectué.
3. Caractérisation phénotypique des ADSC
   1. Préparez de l’albumine sérique bovine à 1 % (BSA) dans du PBS.
   2. Diluez les anticorps anti-souris comme mentionné dans le tableau 1.
   3. Préparez du formaldéhyde à 2 % dans du PBS.
4. ADSC différenciation ostéogénique
   1. Milieu de différenciation ostéogénique : Préparez du DMEM complété par de l’acide ascorbique 5,67 M, de la dexaméthasone 10 nM, de l’β-glycérophosphate 0,02 M, du FBS à 10 % et de la pénicilline/streptomycine à 1 %.
   2. Pour la coloration de Von Kossa, préparez les solutions suivantes : 70 % d’éthanol dans l’eau, 5 % de nitrate d’argent dans l’eau, de l’eau distillée, 5 % de thiosulfate de sodium dans l’eau et 1 % d’éosine B dans l’eau.
5. Différenciation adipogénique :
   1. Milieu de différenciation adipogénique : Préparez du DMEM complété par 0,5 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine, 200 μM d’indométacine, 1 μM de dexaméthasone, 10 μM d’insuline, 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine.
   2. Pour la coloration rouge huile, préparez les solutions suivantes : 10 % de formol dans de l’eau désionisée, 60 % d’isopropanol dans de l’eau désionisée, du lysochrome (colorant liposoluble), un colorant diazo (solution Oil-Red O) dans de l’isopropanol à 60 % et 1 % d’hématoxyline dans de l’eau désionisée.
6. Différenciation chondrogénique :
   1. Milieu de différenciation chondrogénique : Préparez un milieu chondrogénique complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine.
   2. Préparez du formaldéhyde à 10 % dans du PBS.
   3. Pour la coloration des protéoglycanes et des glycosaminoglycanes, préparez les solutions suivantes : coloration aux hétéroglycanes (bleu d’alcian 1 %) dans l’acide acétique, pH 2,5, paraffine, hématoxyline, dilution de la série éthanol dans l’eau (100 %, 96 %, 80 % et 70 %).

Anticorps/fluorophore	Dilution	Clone	Concentration finale (μg/mL)	Fonction et cellule dans laquelle il s’exprime
CD34- PE	1:100	RAM34	2	Facteur d’adhésion cellulaire. Cellules souches hématopoïétiques.
CD45- APC	1:100	30-F11	2	Aide à l’activation des leucocytes. Exprimé en leucocytes.
CD71- FITC	1:100	C2	5	Contrôle l’absorption du fer pendant la prolifération cellulaire. Cellules proliférantes, réticulocytes et cellules précurseurs.
CD29- FITC	1:100	Ha2/5	5	L’adhésion et l’activation, l’embryogenèse, les leucocytes, les cellules dendritiques, les plaquettes, les mastocytes, les fibroblastes et les cellules endothéliales.
CD90- PerCP	1:100	OX-7	2	Signalisation, adhérence. Lymphocytes T, NK, monocytes, cellules souches hétopoïétiques, neurone et fibroblaste.

Tableau 1 : Anticorps utilisés pour la caractérisation phénotypique des ADSC par cytomètre en flux. Liste des anticorps avec leurs fluorochromes respectifs, leurs dilutions, leur clone et leur concentration finale ainsi que leur fonction dans la cellule qui est exprimée.

2. Méthodes

REMARQUE : Le tissu adipeux est réparti dans tout le corps dans des zones sous-cutanées ou intra-abdominales. Chez la souris, les tissus adipeux les plus couramment utilisés pour les expériences comprennent l’épididyme sous-cutané, le mésentérique et le rétropéritonéal²². Ici, les étapes d’obtention du tissu adipeux épididymaire sont illustrées (Figure 1).

Figure 1 : Plan d’expérience pour obtenir des cellules souches dérivées du tissu adipeux de souris suisses. (A) À l’aide d’aiguilles, placer l’animal sur le panneau de liège ou de polystyrène ; (B) Soulevez la peau à l’aide d’une pince à épiler, faites une incision au centre de la région abdominale et détachez la peau du péritoine ; (C) identifier le tissu adipeux blanc au-dessus de l’épididyme ; (D) transférer le tissu dans un milieu DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques, laver soigneusement le tissu adipeux épididymaire avec du PBS et transférer le tissu dans la solution de digestion ; (E), fragmenter le tissu et (F) incuber à 37 °C pendant 1 h en secouant vigoureusement toutes les 10 min ; (G) après avoir compté les cellules, mettre en plaques à 6 puits et observer la morphologie cellulaire au microscope inversé. (F) La morphologie cellulaire passera de ronde à fibroblastique. Barre d’échelle = 22,22 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Extraction du tissu adipeux épididymaire
   REMARQUE : Sachez que toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une armoire à flux laminaire afin d’assurer une culture cellulaire pure et sans contamination.
   1. Euthanasier les animaux à l’aide d’une solution de kétamine et de xylazine (100 et 10 mg/kg, comme décrit à l’étape 1.1.2) par voie intrapéritonéale.
      REMARQUE : D’autres méthodes d’euthanasie peuvent être utilisées²³. Assurez-vous que l’animal est mort en confirmant l’absence de battement de cœur.
   2. Placez l’animal, la face ventrale vers le haut, sur une planche de liège ou de polystyrène recouverte de papier d’aluminium et fixez-le à l’aide d’aiguilles stériles (figure 1A).
      REMARQUE : Pour éviter la contamination, vaporisez de l’alcool à 70% dans la région abdominale. Vous pouvez également raser les cheveux avec un scalpel.
   3. Soulevez la peau à l’aide d’une pince à épiler au centre de la région abdominale et faites une incision avec des ciseaux stériles.
      REMARQUE : Deux jeux de pinces à épiler et de ciseaux stériles sont nécessaires pour éviter la contamination. Le premier est utilisé pour ouvrir l’animal, coupant la peau et la couche péritonéale ; Le second est utilisé pour prélever le tissu adipeux épididymal. De plus, réservez 150 ml d’alcool à 70 % dans un bécher pour nettoyer les ciseaux et la pince à épiler entre les étapes.
   4. Insérez les ciseaux sous la peau de l’animal et ouvrez-le pour le détacher du péritoine (figure 1B). Soulevez la couche péritonéale à l’aide d’une pince à épiler et coupez-la avec des ciseaux stériles.
   5. Utilisez une autre pince à épiler et des ciseaux stériles et identifiez l’épididyme au-dessus des testicules et le tissu adipeux blanc au-dessus de l’épididyme. Tirez tout le tissu adipeux de l’épididyme à l’aide d’une pince à épiler stérile d’environ 2 cm et coupez-la très près de l’épididyme (figure 1C).
   6. Mettez la graisse dans un tube conique stérile de 50 ml contenant du milieu basal et placez-la sur de la glace (figure 1D). Dans le capot, passez aux étapes suivantes décrites ci-dessous.
2. Isolement de cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC)
   REMARQUE : Traitez les échantillons dans une hotte à flux laminaire biologique de classe II, et le personnel doit porter une blouse de laboratoire, des gants et un masque chirurgical.
   1. Lavez soigneusement le tissu adipeux épididymaire avec du PBS.
      REMARQUE : Cette étape est essentielle pour retirer le sang et les autres particules de l’échantillon. Le sang peut inhiber l’enzyme collagénase de type II et compromettre l’expérience.
   2. À l’aide d’une pince à épiler stérile, transvaser le tissu adipeux épididymaire dans un tube de 50 mL contenant 15 à 20 mL de solution de digestion, préparé à l’étape 1.2.2. Fragmenter le tissu à l’aide de ciseaux stériles et incuber le tissu à 37 °C pendant 1 h (figures 1E, F).
      REMARQUE : Un bain-marie ou un incubateur à 37 °C peut être utilisé dans cette étape. Toutes les 10 min, la suspension doit être vigoureusement agitée pour faciliter la digestion. Ne prolongez pas la durée d’incubation de 1h.
   3. Inactiver la collagénase en diluant l’échantillon 1:1 dans un milieu basal et centrifuger la suspension à 250 x g pendant 10 min à 4 °C pour obtenir la fraction vasculaire du stroma. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu basal.
   4. Vérifiez la viabilité et comptez les cellules par la méthode d’exclusion du colorant bleu de trypan dans une chambre Neubauer en utilisant une dilution de 1:10 ou 1:100.
      REMARQUE : Le rendement attendu est d’environ 0,5 à 1 million de cellules/g de tissu adipeux traité et une viabilité de 80%.
   5. Plaquez les cellules isolées (0,3 à 0,5 million) dans 3 mL de milieu basal dans un puits d’une plaque à 6 puits. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   6. Le lendemain : Retirez le milieu du puits et lavez les cellules avec du PBS. Ajouter 3 mL de milieu de base. Répétez ce processus tous les 2 jours jusqu’à ce que les cellules deviennent confluentes à 90%.
      REMARQUE : Observez toujours la morphologie des cellules au microscope inversé, passant de ronde à fibroblastique (Figure 1H).
3. Expansion des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC)
   REMARQUE : Une fois que les cellules se développent ~90% confluentes, passez à la sous-culture comme décrit ci-dessous.
   1. Retirez le milieu du puits et lavez les cellules avec du PBS. Ajouter 0,5 mL/puits de trypsine/EDTA (0,05 % de trypsine ; 200 mg/L d’EDTA) et incuber la plaque pendant 3 à 5 minutes à 37 °C pour détacher les cellules.
      REMARQUE : Ne pas dépasser 5 min dans trypsine/EDTA. Le détachement complet des cellules doit être vérifié au microscope inversé. Le processus peut être accéléré en pipetant soigneusement de haut en bas ou en tapotant le côté de la plaque.
   2. Inactiver l’enzyme en diluant l’échantillon 1:1 dans du DMEM complété par 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) et 1 % d’antibiotiques.
   3. Divisez la suspension cellulaire en 2 puits et ajoutez 3 mL de milieu basal (DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques). Incuber une nuit à 37 °C avec 5% de CO₂.
   4. Changer de milieu le lendemain, puis tous les 2 jours jusqu’à 90% de confluence.
   5. Répétez le processus jusqu’au troisième passage et passez à la caractérisation phénotypique et fonctionnelle.
      REMARQUE : Observez toujours la morphologie des cellules au microscope inversé, passant de rondes à fibroblastes.
4. Caractérisation des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC)
   1. Caractérisation phénotypique par cytométrie en flux
      1. Détachez les cellules à l’aide de trypsine/EDTA, comme décrit aux étapes 2.3.1 à 2.3.2.
      2. Recueillir les cellules dans un tube conique (50 mL) et centrifuger à 250 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PBS.
      3. Compter les cellules comme décrit à l’étape 2.2.4 et ensemencer 0,5-1 x 10⁶ cellules dans 100 μL de PBS dans une plaque à 96 puits.
         REMARQUE : Le nombre de puits dépendra de la couleur du conjugué fluorochrome et des filtres/lasers du cytomètre.
      4. Ajouter des anticorps (tableau 1) dilués dans 1 % de BSA dans du PBS.
         REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’utiliser le bloc Fc pour éviter la liaison non spécifique car nous utilisons déjà le BSA pour diluer les anticorps. Réservez un échantillon de cellules sans recevoir d’anticorps qui seront utilisés comme contrôle de la coloration. Les anticorps peuvent être combinés dans le même puits selon le colorant fluorochrome et le cytomètre disponibles en laboratoire. Tous les anticorps décrits dans le tableau 1 peuvent être ajoutés dans le même puits, à l’exception du CD71 FITC et du CD29 FITC, qui doivent se trouver dans des puits différents en raison du même fluorochrome.
      5. Incuber la plaque pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité.
      6. Laver les cellules, puis compléter le volume à 200 μL à l’aide de PBS, centrifuger la plaque à 252 x g pendant 10 min à 4 °C et jeter le surnageant. Répétez cette étape une fois de plus.
      7. Fixez les cellules en ajoutant 200 μL par puits de formaldéhyde à 2 % dans du PBS. Conservez les cellules dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à l’analyse dans le cytomètre en flux.
         REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, acquérez les cellules sur le cytomètre en flux dès que possible. La luminosité de fluorescence des marqueurs diminue considérablement après 48 h pour la plupart des fluorochromes. Ainsi, ne dépassez pas 48 h pour lire la planche. L’acquisition de 30 000 événements est recommandée.
      8. Utilisez la stratégie de contrôle présentée à la figure 2B pour sélectionner la population ASC.
   2. Caractérisation fonctionnelle : Différenciation ostéogénique
      1. Détachez les cellules à l’aide de la trypsine/EDTA (comme décrit aux étapes 2.3.1 à 2.3.2), prélevez et centrifugez les cellules (comme décrit aux étapes 2.4.1.2 et 2.4.1.2) et comptez-les (comme décrit aux étapes 2.2.4).
      2. Plaque, en trois exemplaires, 2 x 10⁵ cellules par puits en plaques de 6 puits en médiale basale (DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques) ; incuber à 37 °C dans 5% de CO₂.
         REMARQUE : Deux plaques à 6 puits seront nécessaires, une pour chaque temps de différenciation (14 et 21 jours).
      3. Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu ostéogénique (étape 1.4.1).
         REMARQUE : réserver 3 puits en étant cultivé uniquement avec le milieu basal, qui sera le contrôle de la différenciation.
      4. Cellules de culture pendant 14 et 21 jours dans un milieu ostéogénique et les cellules témoins, en changeant de milieu tous les 3 jours. Procéder à la coloration de Von Kossa (étape 1.4.2) pour évaluer les nodules minéralisés à la fin de chaque période de culture.
      5. Aspirez le milieu de chaque puits et lavez les cellules deux fois avec du PBS. Fixez les cellules avec 2 ml d’éthanol à 70 % pendant la nuit à température ambiante (RT). Lavez soigneusement les cellules à l’eau courante.
      6. Ajouter 2 mL de solution de nitrate d’argent à 5 % et incuber la plaque à la lumière ultraviolette pendant 1 h. Lavez les cellules avec de l’eau distillée. Ajouter 2 ml de thiosulfate de sodium à 5 % et laisser incuber pendant 5 min. Laver à l’eau distillée.
      7. Contre-coloration avec 2 mL d’éosine pendant 40 s. Lavez à l’eau distillée jusqu’à ce que la solution de coloration soit éliminée et visualisez la coloration à l’aide d’un microscope optique.
   3. Caractérisation fonctionnelle : Différenciation adipogénique
      1. Détachez les cellules à l’aide de la trypsine/EDTA (comme décrit aux étapes 2.3.1 à 2.3.2), prélevez et centrifugez les cellules (comme décrit aux étapes 2.4.1.2 et 2.4.1.2) et comptez-les (comme décrit aux étapes 2.2.4).
      2. Plaque 2 x 10⁵ cellules par puits dans des plaques de 6 puits en médiale basale (DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques) ; incuber à 37 °C dans 5% de CO₂.
         REMARQUE : Deux plaques à 6 puits seront nécessaires, une pour chaque temps de différenciation (14 et 21 jours).
      3. Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu adipogène (étape 2.5.1).
         REMARQUE : Réservez 3 puits en cultivant uniquement avec le milieu basal comme témoin.
      4. Cellules de culture pendant 14 et 21 jours en milieu adipogénique, en changeant de milieu tous les 3 jours. À la fin de chaque période de culture, procéder à la coloration Ole-Red O (étapes 2.4.3.5-2.4.3.7), un indicateur de l’accumulation de lipides intracellulaires.
      5. Aspirer le média de chaque puits. Lavez les cellules deux fois avec du PBS. Fixer les cellules dans 2 mL de formol à 10 % pendant 1 h. Lavez une fois avec du PBS, puis une fois avec de l’eau.
      6. Colorer avec 2 mL de solution d’Oil-Red O dans de l’isopropanol à 60 % pendant 5 min. Lavez une fois à l’eau distillée.
      7. Contre-coloration avec 2 mL d’hématoxyline à 1 % diluée 1:2 dans de l’eau distillée pendant 1 min. Laver à l’eau distillée jusqu’à ce que la solution colorante soit éliminée et visualiser les échantillons colorés à l’aide d’un microscope optique.
   4. Caractérisation fonctionnelle : Différenciation chondrogénique
      1. Détachez les cellules à l’aide de la trypsine/EDTA (comme décrit aux étapes 2.3.1 à 2.3.2), prélevez et centrifugez les cellules (comme décrit aux étapes 2.4.1.2 et 2.4.1.2) et comptez-les (comme décrit aux étapes 2.2.4).
      2. Placez 5 x 10⁵ ADSC dans quatre tubes coniques en polypropylène et centrifugez à 450 x g pendant 5 min pour former une pastille. Jetez le surnageant.
      3. Cultiver les pastilles dans un tube conique dans un milieu chondrogène (étape 1.6.1) ou uniquement dans un milieu basal (contrôle de la différenciation) pendant 14 et 21 jours à 37 °C dans 5% de CO₂. Changez de milieu tous les 3 jours et évitez de retirer les granulés.
         REMARQUE : Chaque pastille cellulaire fait référence à chaque temps de culture, ainsi qu’à leurs témoins respectifs cultivés uniquement avec un milieu basal.
      4. À la fin de chaque point de temps de culture, prélevez les granulés à l’aide d’une pince à épiler à pointe fine et placez-les dans une plaque à 24 puits. Procéder à la coupe histologique et à la coloration des protéoglycanes et des glycosaminoglycanes (étapes 2.4.4.5.-2.4.4.9).
         REMARQUE : Chaque granulé est traité dans un puits séparé.
      5. Fixer les pastilles dans 2 mL de formaldéhyde tamponné à 10 % pendant 30 min. Jeter la solution de formaldéhyde et ajouter 2 ml d’éthanol à 70 %. Retirez la pastille du tube conique à l’aide d’une pointe et encastrez-la dans de la paraffine.
      6. À l’aide d’un microtome rotatif à paraffine, faire des coupes histologiques de 5 μm. Incuber les sections pendant 15 min à 60 °C et les plonger deux fois dans du xylène (pendant 5 et 15 min).
      7. Réhydrater les échantillons en immergeant les coupes histologiques dans des bains d’alcool à des concentrations décroissantes (100 %, 96 %, 80 % et 70 %) pendant 2 min chacun, puis rincer à l’eau déminéralisée pendant 5 min.
      8. Procéder à la coloration des échantillons avec du bleu d’Alcian 1% dans de l’acide acétique, pH 2,5, pendant 30 min.
      9. Contre-colorez avec de l’hématoxyline pendant 1 min et lavez à l’eau distillée. Montez avec DPX (monteur pour l’histologie) ou une autre solution de monture et visualisez les échantillons à l’aide d’un microscope optique.

Résultats

Les cellules extraites du tissu adipeux selon le protocole présenté ici ont montré une morphologie correspondant aux critères minimaux pour les CSM proposés par l’ISCT. La figure 1 présente une vue d’ensemble du protocole. Phénotypiquement, les ADSC ont montré une adhérence à la morphologie plastique et fibroblastique dans les premiers jours de la culture cellulaire (Figure 2A). De plus, ils se sont développés de manière homogène et ont formé des colonies. De plus, les ADSC ont montré une faible expression de CD34 (2,12 %) et CD45 (1,81 %), deux marqueurs hématopoïétiques, et une expression élevée de CD71 (42,6 %), CD29 (74,2 %) et CD90 (55,1 %), tous des marqueurs de cellules mésenchymateuses (figure 2B).

Figure 2 : Caractérisation phénotypique des cellules dérivées du tissu adipeux. (A) La morphologie des ADSC passe de ronde à fibroblastique aux jours 2, 4 et 8 de la culture ; barre d’échelle = 22,22 μm. (B) Histogrammes des marqueurs exprimés (CD71, CD29 et CD90) ou non (CD34 et CD45) par ASC. Cette figure a été reproduite avec la permission de Miranda et ^al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Sur le plan fonctionnel, les ADSC ont montré une multipuissance pour se différencier en ostéoblastes, adipoblastes et chondroblastes lorsqu’ils sont cultivés dans des milieux conditionnés pour chaque lignée pendant 14 ou 21 jours (Figure 3). La coloration de Von Kossa a révélé des nodules minéralisés dans la matrice extracellulaire, caractéristiques du processus d’ostéogenèse (Figure 3). La coloration au rouge huile O a mis en évidence la présence de vacuoles lipidiques dans le cytoplasme des ADSC, et la coloration au bleu d’Alcian a confirmé la présence de glycosaminoglycane dans la matrice extracellulaire (Figure 3). Ensemble, les caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles ont confirmé la population de cellules extraites du tissu adipeux épididymaire en tant que CSM.

Figure 3 : Caractérisation fonctionnelle des cellules dérivées du tissu adipeux. Potentiel de multilignage ostéogénique, adipogène et chondrogénique de l’ADSC après 14 et 21 jours de culture. Barre d’échelle = 50 μm (panneau supérieur), 100 μm (panneaux central et inférieur). Cette figure a été reproduite avec la permission de Miranda et ^al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les CSM peuvent être extraites de différents tissus. Bien que la moelle osseuse représente une source commune de CSM chez les souris et les humains^25,26, nous avons choisi de travailler avec le tissu adipeux dans cette étude en raison de sa richesse en CSM, de sa distribution dans le corps et de sa facilité d’accès. Comme alternative, les cellules souches dérivées du tissu adipeux peuvent être utilisées pour générer des cellules immortalisées de type MSCs²⁷.

Certains points de l’extraction méritent une attention particulière pour la réussite des protocoles partagés ici. Tout d’abord, nous soulignons le soin à prélever les tissus qui doit être fait dans des conditions aseptiques. Assurez-vous donc que les souris sont correctement désinfectées avec de l’alcool à 70 % avant de commencer la chirurgie. Un autre point important est de ne pas utiliser le même ensemble de pinces à épiler et de ciseaux pour prélever le tissu adipeux épididymaire, évitant ainsi toute source de contamination.

Une deuxième préoccupation est le traitement des tissus. Les fragments du tube conique doivent être correctement et vigoureusement agités pendant 10 min d’incubation à 37 °C. Il est très important de changer de milieu le lendemain puis tous les 2-3 jours. Il est recommandé d’observer la culture quotidiennement, en vérifiant la couleur du milieu, la forme des cellules et toute interférence dans l’environnement de la culture.

Une troisième préoccupation concerne le meilleur moment/passage pour la caractérisation des CSM. Ici, nous vous recommandons de le faire au troisième passage des cellules, mais ce n’est pas obligatoire. Cela dépend de l’objectif de l’étude. Dans le troisième passage, nous avons environ 80% des cellules caractérisées comme des CSM, ce qui est suffisant pour les objectifs de cette étude par exemple. La caractérisation phénotypique est réalisée en analysant l’expression de marqueurs hématopoïétiques (CD34 et CD45, par exemple) et mésenchymateux (CD29, CD73, CD90 et CD105, par exemple). De plus, l’International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT)²¹ souligne que les ADSC doivent avoir une morphologie semblable à celle des fibroblastes et adhérer à la plastique de la plateforme de culture. La morphologie peut être observée au microscope pendant la culture en croissance. La caractérisation fonctionnelle est réalisée en analysant le potentiel des ADSC à se différencier en cellules ostéoblastiques, adipoblastiques et chondroblastes. Dans la caractérisation phénotypique, le pourcentage de marqueurs mésenchymateux et hématopoïétiques peut varier selon l’espèce animale et la source cellulaire, ne répondant pas entièrement aux nombres recommandés par l’ISCT. Par exemple, l’ISCT recommande pour les CSM humaines ≥95 % des CD105, CD73, CD90 et ≤2 % des CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a ou CD19, antigène leucocytaire humain - isotype DR (HLA-DR)²¹. De plus, il est important de faire la caractérisation fonctionnelle et de confirmer la multipotence des cellules se différenciant en ostéoblastes, chondrocytes et lignées adipocytaires. Au moins deux de ces lignées sont recommandées pour prouver la multipotence.

En plus de ces points mis en évidence, certains tests suggérés ici peuvent être substitués, par exemple, le rouge d’alizarine S au lieu de la coloration de Von Kossa, le shiff acide périodique au lieu du bleu d’Alcian et la réaction en chaîne par polymérase (PCR) au lieu de la cytométrie en flux.

Parmi les trois types de tissu adipeux décrits chez l’homme (blanc, brun et beige), le tissu adipeux blanc a la source la plus élevée de CSM²⁸. Ce tissu peut être obtenu à partir de régions sous-cutanées, abdominales et inguinales, telles que la graisse au-dessus de l’épididyme rapportée ici. La fragmentation physique et la digestion enzymatique par la collagénase utilisées dans le protocole partagé ici dérivent la fraction vasculaire stromale (SVF) composée de nombreux types de cellules, à l’exception des adipocytes, qui s’appauvrissent au cours du traitement.

En conclusion, les principaux avantages de l’utilisation du tissu adipeux comme source de CSM comprennent leur abondance et la facilité des méthodes d’isolement cellulaire, associées au potentiel thérapeutique des CSM en tant que propriétés anti-inflammatoires et régénératrices.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
140 ° ; C Stérilisation à haute température CO2 Incubateur	RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, Chine	C180
3-Isobutyl-1-méthylxanthine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	I7018
Acide acétique glacial	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	PHR1748
Bleu alcien 8GX	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	A9186	BioReagent, adapté à la détection des glycoprotéines. 1 % dans l’acide acétique, pH 2,5
Alcool 70 %	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	65350-M	70 % dans l’eau
Amphotéricine B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1662
Anticorps anti-souris anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	555005	Fonctions dans la cellule : Adhésion et activation, embryogenèse, Leucocytes, DC, plaquettes, mastocytes, fibroblastes et cellules endothéliales
Anticorps anti-souris anti-CD34 PE (Clone RAM34)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	551387	Fonctions dans la cellule : Facteur d’adhésion cellulaire. Cellules souches hématopoïétiques
Anticorps anti-souris anti-CD45 APC (Clone 30-F11)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	559864	Fonctions dans la cellule : Aide à l’activation des leucocytes
Anticorps anti-souris anti-CD71 FITC (Clone C2)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	553266	Fonctions dans la cellule : Contrôle l’absorption du fer pendant la prolifération cellulaire. Cellules proliférantes, réticulocytes et précurseurs
Anticorps anti-souris anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	557266	Fonctions dans la cellule : Signalisation, adhésion. Lymphocyte T, NK, monocyte, HSC, neurone, fibroblaste
Acide ascorbique	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	PHR1008
Pipettes automatiques	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	4700850N	Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
Beaker	Sans objet		1 unité
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A7906
Plaques de culture cellulaire (6 puits)	Merck, Darmstadt, Allemagne	Z707759	07 unités stériles. Plaques de culture tissulaire TPP
Plaques de culture cellulaire (96 puits. Fond rond ou en V)	Merck, Darmstadt, Allemagne	CLS353077	01 unité stérile. Puits, 96, surface traitée par culture tissulaire (TC), puits transparents à fond rond,
milieu chondrogénique	Stem Pro Chondrogenesis Differentiation&ndash ; Technologies de la vie	A1007101	TGF-&beta ; 2, TGF-&beta ; 3, dexaméthasone, insuline, transferrine, ITS, sodium-l--ascorbate, pyruvate de sodium, ascorbate-2-phosphate
Collagénase de type II	Life Technologies, Californie, États-Unis	17101015
panneau de liou ou de polystyrène recouvert d’aluminium	Sans objet		1 unité
de coton	Sans objet		50 g
Dexaméthasone	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	D4902
Ciseaux de dissection	Sans objet		03 unités stériles
DPX Mountant pour l’histologie	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	6522
Dulbecco' Eagle modifié' s milieu (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	D5523	Avec 1000 mg/L de glucose et de L-glutamine, sans bicarbonate de sodium, poudre, adapté à la culture cellulaire
Éosine B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	861006
Sérum fœtal bovin (FBS)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	F4135
Formaldéhyde	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	47608
Formalin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	HT501128
Gentamicin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	G1397
Hématoxyline	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	H3136
Aiguille hypodermique (0,3 mm x 13 mm)	Sans objet		5 unités
Indométhacine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	I0200000
Insuline	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	I3536
Isopropanol	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	563935	70 % dans une
solution de chlorhydrate de kétamine-D4	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	K-006	1,0 mg/mL dans du méthanol (sous forme de base libre), matériau de référence certifié, Cerilliant
Chambre Neubauer	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	Chambre	de comptage BR718620 marque BLAUBRAND Neubauer. Avec clips,
pointes de pipette Nichiryo à double lignage (0,1 &ndash ; 10 &mu ; L)	Merck, Darmstadt, Allemagne	Z645540	Plage de volume 0,1&ndash ; 10 &mu ; L, allongé, emballage en vrac. Pointes de
pipette stériles Nichiryo (1&ndash ; 10 mL)	Merck, Darmstadt, Allemagne	Z717401	Plage de volume 1&ndash ; 10 ml, universel, emballage en vrac. Pointes de
pipette stériles Nichiryo (200 &mu ; L)	Merck, Darmstadt, Allemagne	Z645516	Volume maximum 200 &mu ; L, gradué, ministack. Solution stérile
d’huile-rouge O	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	O1391	0,5 % dans l’isopropanol
Paraffine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	107.151	46&ndash ; 48, sous forme de bloc
Pénicilline/Streptomycine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	P4333	Solution stabilisée, avec 10 000 unités de pénicilline et 10 mg de streptomycine/mL, 0,1 &mu ; m filtré, BioReagent, adapté à la culture cellulaire
Solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS).	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	P3813	Poudre, pH 7,4, pour la préparation de solutions de 1 L. Tubes coniques équilibrés et stériles
en polypropylène (15 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-959-53A	stériles
en polypropylène (50 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-432-22	2 unités
de scalpel stérile (facultatif)	Sans objet		1 unité
Nitrate	d’argent Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	85228
Thiosulfate de sodium	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	72049
Pince à épiler chirurgicale (15 cm)	Sans objet		3 unités de souris mâles suisses
stériles (6&ndash ; 8 semaines)	Bioterium, Santa Cruz State University	Seringue 021/22
(1 mL)	Sans objet		1 unité
Trypan Blue	Dye Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T8154	0,4 %, liquide, stérile-filtré, adapté à la culture cellulaire
Trypsine/EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T3924
Xylazine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	PHR3263
&beta ;-glycérophosphate disodique sel hydraté	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, États-Unis	G9422	BioUltra, adapté à la culture cellulaire, adapté à la culture cellulaire végétale, &ge ; 99 % (titrage)