Comparaison de deux méthodes représentatives pour la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules stromales mésenchymateuses

Summary

Ce protocole décrit et compare deux méthodes représentatives pour différencier les hiPSCs en cellules stromales mésenchymateuses (CSM). La méthode monocouche se caractérise par un coût inférieur, un fonctionnement plus simple et une différenciation ostéogénique plus facile. La méthode des corps embryoïdes (EBs) se caractérise par une consommation de temps plus faible.

Abstract

Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules souches pluripotentes adultes qui ont été largement utilisées en médecine régénérative. Étant donné que les CSM dérivées de tissus somatiques sont limitées par des dons limités, des variations de qualité et la biosécurité, les 10 dernières années ont vu une forte augmentation des efforts visant à générer des CSM à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPhi). Les efforts passés et récents visant à différencier les hiPSC en CSM ont été centrés sur deux méthodologies de culture : (1) la formation de corps embryoïdes (EB) et (2) l’utilisation de la culture monocouche. Ce protocole décrit ces deux méthodes représentatives pour dériver les CSM à partir des hiPSC. Chaque méthode présente ses avantages et ses inconvénients, notamment le temps, le coût, la capacité de prolifération cellulaire, l’expression des marqueurs MSC et leur capacité de différenciation in vitro. Ce protocole démontre que les deux méthodes peuvent dériver des CSM matures et fonctionnelles à partir de CSPhi. La méthode monocouche se caractérise par un coût inférieur, un fonctionnement plus simple et une différenciation ostéogénique plus facile, tandis que la méthode EB se caractérise par une consommation de temps plus faible.

Introduction

Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules souches pluripotentes adultes dérivées du mésoderme¹. Les CSM sont présentes dans presque tous les tissus conjonctifs². Depuis que les CSM ont été découvertes pour la première fois dans les années 1970 et isolées avec succès de la moelle osseuse en 1987 par Friedenstein et al.3,4,5, une variété de tissus somatiques humains (y compris le fœtus et l’adulte) ont été utilisés pour isoler les CSM telles que les os, le cartilage, les tendons, les muscles, le tissu adipeux et le stroma de soutien hématopoïétique^<....

Protocol

1. Maintenance des hiPSC

1. Décongélation de hiPSC
   1. Retirez les cellules de l’azote liquide et décongelez-les rapidement dans un bain-marie à 37 °C. Transférer les cellules de décongélation dans un tube de 15 mL préparé avec 3 mL de milieu d’entretien iPSC (Tableau des matériaux). Mélangez délicatement le médium.
   2. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre délicatement les cellules en suspension dans 1 mL de milieu d’entretien iPSC avec 10 μM Y-27632 (pipeter les cellules de haut en bas 2 à 3 fois).
   3. Transférer la suspension cellulaire dans une plaque de culture tis....

Results

Suivant le protocole (Figure 1A), les hiPSC ont été différenciées en CSM par les méthodes de formation d’EB et de culture monocouche. Au cours de la différenciation, les cellules ont montré différentes morphologies représentatives (Figure 1B,C).

Comme le montre la figure 1B, les colonies de hiPSCs présentent une morphologie compacte typique avant la différenciation avec une bordure claire.......

Discussion

Dans ce protocole, deux méthodes représentatives de différenciation des hiPSC en CSM ont été examinées 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Les deux méthodes étaient capables de dériver des CSM.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de coloration rouge d’alizarine	Beyotime  ; Biotechnologie	C0148S
Anti-humain-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-human-CD34 (FITC)	Biolegend	343503
Anti-human-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-human-CD73( APC)	Biolegend	344006
Anti-human-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Acide ascorbique	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
Agitateur de niveau de dioxyde de carbone	Crystal	CO-06UC6
Perles de compensation	BioLegend	424601
CryoStor CS10	STEMCELL Technology	07959
Dexaméthasone	Beyotime  ; Biotechnologie	ST1254
DMEM/F12  ; moyen	Servicebio	G4610
Sérum fœtal bovin	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Cellule souche	78003.1
Gélatine	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
contrôle des isotypes IgG1 humains APC	BioLegend	403505
contrôle des isotypes IgG1 humains FITC	BioLegend	403507
contrôle des isotypes IgG1 humains PE	BioLegend	403503
TGF-&beta humain ; 1	cellule souche	78067
Human TruStain FcX  ;	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime  ; Biotechnologie	ST1398
Indométacine	Solarbio	SI9020
Insuline	Beyotime  ; Biotechnologie	P3376
iPSC support de maintenance	STEMCELL Technology	85850
ITS Media Supplement	Beyotime  ; Biotechnologie	C0341-10mL
Matrigel, facteur de croissance réduit	BD Corning	354230
Oli Red O kit de coloration	Beyotime  ; Biotechnologie	C0158S
Proline	Solarbio	P0011
Pyruvate de sodium	ThermoFisher	11360-070
TGF&beta ; 3	Novoprotein	CJ44
Kit de coloration au bleu de toluidine	Solarbio	G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)  ;	Gibco	12604013
Accessoire ultra-bas Plaque à 6 puits	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Cellule souche	72304
&alpha ;-MEM	Hyclone	SH30265
&beta ;-glycérophosphate	Solarbio	G8100