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Article de méthode

Identification du type de fibre du muscle squelettique humain

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DOI :

10.3791/65750

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22 septembre 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Chemistry, La Trobe Institute for Molecular Science, School of Agriculture, Biomedicine and Environment, La Trobe University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole démontre l’isolement d’une seule fibre à partir de muscles squelettiques humains lyophilisés et la classification du type de fibre selon l’isoforme de la chaîne lourde de myosine (CMH) à l’aide de la technique de transfert de points. Les échantillons de fibres CMH I et II identifiés peuvent ensuite être analysés plus en détail pour détecter les différences spécifiques au type de fibre dans l’expression des protéines à l’aide du transfert Western.

Résumé

La technique décrite ici peut être utilisée pour identifier des isoformes spécifiques de la chaîne lourde de myosine (CMH) dans des segments de fibres musculaires individuelles à l’aide du transfert de points, ci-après dénommé détection de la chaîne lourde de l’osine par lotting Dot Bpour l’identificationdu type defibre musculaire (MyDoBID). Ce protocole décrit le processus de lyophilisation des muscles squelettiques humains et l’isolement de segments de fibres musculaires individuelles. À l’aide de MyDoBID, les fibres de type I et II sont classées avec des anticorps spécifiques de l’ICM et de l’IIa, respectivement. Les fibres classées sont ensuite combinées dans des échantillons spécifiques au type de fibre pour chaque biopsie.

La protéine totale dans chaque échantillon est déterminée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) et par la technologie de gel activé par les UV. Le type de fibre des échantillons est validé à l’aide du Western Blot. L’importance d’effectuer la normalisation de la charge protéique pour améliorer la détection des protéines cibles sur plusieurs Western blots est également décrite. Les avantages de la consolidation des fibres classées dans des échantillons spécifiques au type de fibre par rapport aux Western Blots à fibre unique comprennent la polyvalence des échantillons, l’augmentation du débit des échantillons, la réduction de l’investissement en temps et les mesures d’économie, tout en conservant des informations précieuses spécifiques au type de fibre qui sont souvent négligées à l’aide d’échantillons musculaires homogénéisés. L’objectif du protocole est d’obtenir une identification précise et efficace des fibres de type I et de type II isolées à partir d’échantillons de muscles squelettiques humains lyophilisés.

Ces fibres individuelles sont ensuite combinées pour créer des échantillons spécifiques au type de fibre de type I et de type II. De plus, le protocole est étendu pour inclure l’identification des fibres de type IIx, en utilisant l’actine comme marqueur pour les fibres qui étaient négatives pour MHCI et MHCIIa, qui sont confirmées comme des fibres IIx par western blot. Chaque échantillon spécifique au type de fibre est ensuite utilisé pour quantifier l’expression de diverses protéines cibles à l’aide de techniques de transfert Western.

Introduction

Le muscle squelettique est un tissu hétérogène, avec des propriétés métaboliques et contractiles cellulaires distinctes qui dépendent du fait que la cellule (fibre) soit à contraction lente (type I) ou à contraction rapide (type II). Le type de fibre peut être identifié en examinant les isoformes de la chaîne lourde de myosine (CMH), qui diffèrent les unes des autres de plusieurs façons, notamment par le temps de contraction, la vitesse de raccourcissement et la résistance à la fatigue1. Les principales isoformes du CMH comprennent le type I, le type IIa, le type IIb et le type IIx et leurs profils métaboliques sont soit oxydatifs (type I et IIa), soit glycolytiques (IIx, IIb)1. La proportion de ces types de fibres varie selon le type de muscle et d’une espèce à l’autre. Le type IIb est largement présent dans les muscles des rongeurs. Les muscles humains ne contiennent pas de fibres de type IIb et sont principalement constitués de fibres isoformes du CMH de type I et IIa, avec une faible proportion de fibres IIx2. Les profils d’expression des protéines varient selon les différents types de fibres et peuvent être modifiés avec l’âge3, l’exercice 4,5 et la maladie6.

La mesure des réponses cellulaires dans différents types de fibres musculaires squelettiques est souvent négligée ou impossible en raison de l’examen des homogénats musculaires (un mélange de tous les types de fibres). Le western blot à fibre unique permet d’étudier plusieurs protéines dans les fibres musculaires individuelles7. Cette méthodologie a déjà été utilisée pour produire des caractéristiques nouvelles et informatives d’une seule fibre qu’il n’était pas possible d’obtenir en utilisant des préparations homogénatées. Cependant, la méthodologie originale de transfert Western à fibre unique présente certaines limites, notamment la nature chronophage, l’incapacité de générer des répétitions d’échantillons et l’utilisation de réactifs de chimiluminescence améliorée (ECL) coûteux et sensibles. Si des tissus frais sont utilisés, cette méthode est encore plus limitée en raison des contraintes de temps liées à la nécessité d’isoler les fibres individuelles dans un délai limité (c’est-à-dire 1 à 2 h). Heureusement, cette contrainte est atténuée en isolant les segments de fibres simples des tissus lyophilisés8. Cependant, la collecte de fibres à partir d’échantillons lyophilisés est limitée par la taille et la qualité du tissu biopsié.

L’identification du type de fibre à l’aide de la méthode de transfert de points9 a été considérablement élaborée et étendue dans ce protocole complet. Auparavant, il a été démontré qu’aussi peu que ~2-10 mg de tissu musculaire de poids humide est suffisant pour la lyophilisation et l’analyse de la protéine isoforme du CMH à fibre unique9. Christensen et al.9 ont utilisé 30 % d’un segment de fibre de ~1 mm pour détecter l’isoforme du CMH présente par transfert de points, ce qui a été confirmé par transfert Western. Ce travail a montré qu’en remplaçant le western blot par le transfert de points, les coûts globaux étaient réduits de ~40 fois (pour 50 segments de fibres). Les fibres ont ensuite été « regroupées » en échantillons de type I et de type II, ce qui a permis une réplication expérimentale9. Néanmoins, une limite était que seuls deux échantillons spécifiques au type de fibre ont été obtenus : le type I (MHCI positif) et le type II (fibres MHCII positives), les échantillons de type II contenant un mélange de MHCIIa et de MHCIIx 6,10. Notamment, le protocole actuel montre comment les fibres pures de type IIx peuvent être identifiées et fournit un flux de travail très détaillé (résumé dans la figure 1), y compris des stratégies de dépannage pour les problèmes de protocole courants.

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Protocole

Des échantillons de muscles humains ont été prélevés dans le vaste latéral de n = 3 (2 hommes, 1 femme), âgés de 70 à 74 ans dans des conditions stériles sous anesthésie locale (xylocaïne) et une aiguille de Bergstrom modifiée pour une aspiration manuelle11,12. Les échantillons étaient un sous-ensemble d’une étude antérieure approuvée par le Comité d’éthique de la recherche humaine de l’Université Victoria (HRETH11/221) et menée conformément à la Déclaration d’Helsinki13. Les participants ont donné leur consentement écrit et éclairé pour participer à cette étude. Tous les détails de tous les matériaux requis pour ce protocole sont indiqués dans le tableau des matériaux. En outre, une liste de stratégies de dépannage traitant des problèmes de protocole courants est fournie dans le tableau 1.

1. Lyophilisation

  1. Tout en gardant les échantillons de muscles biopsiés congelés sur de la glace sèche, pesez et tarez un tube congelé vide sur la balance.
  2. Peser rapidement un minimum de 10 mg de tissu congelé de poids humide. Enregistrez le poids à une décimale près.
  3. Déposez le tissu dans le tube de microcentrifugation prérefroidi qui a eu 3-4 trous percés dans le couvercle et placez-le dans un petit bécher avec 2-3 granulés de glace carbonique.
  4. Suivez le mode d’emploi du fabricant du lyophilisateur.
  5. Assurez-vous que toutes les vannes du lyophilisateur sont fermées et allumez le lyophilisateur.
  6. Utilisez le panneau de commande pour vérifier que le point de consigne du vide est programmé pour des conditions optimales de lyophilisation des tissus humains, soit 0,12 millibar (mBar) (Figure 2).
  7. Appuyez sur le manuel du lyophilisateur et attendez que la chambre ait refroidi à −40 °C.
  8. Une fois que la chambre a atteint cette température, retirez le couvercle, puis la chambre en verre, et placez le bécher (avec l’échantillon de muscle) sur la platine métallique.
  9. Remettez en place la chambre en verre et le couvercle. Fermez la soupape de décharge du vide sur le couvercle et attendez que le voyant de la balance à vide devienne vert pour vous assurer que la sécheuse est scellée sous vide.
  10. Lyophiliser les échantillons musculaires pendant 48 h. Une fois la lyophilisation terminée, éteignez la pompe à vide en appuyant sur le bouton d’aspiration et ouvrez la soupape de décharge de vide sur le couvercle.
  11. Retirez le couvercle de la chambre et prélevez l’échantillon lyophilisé. Pesez le tissu et notez le poids à une décimale.
  12. Calculer le pourcentage de perte de poids ; Une diminution de ~75 % du poids indique que le tissu est lyophilisé avec succès (dans ce travail, moyenne ±écart-type, 76 ± 9 %, n = 11 échantillons musculaires).
  13. Appuyez sur AUTO pour éteindre la pompe à vide et le congélateur. Laissez l’appareil atteindre la température ambiante.
  14. Nettoyez les serpentins de refroidissement conformément aux instructions du fabricant et vidangez le liquide accumulé du collecteur.
    REMARQUE : La collecte des fibres peut commencer immédiatement. Lorsque le tissu n’est pas utilisé pour l’isolation des fibres, conservez l’échantillon lyophilisé à -80 °C dans un récipient hermétique avec des billes de dessiccateur.  ATTENTION : La glace carbonique est dangereuse (classe 9) ; Reportez-vous à la fiche signalétique pour connaître les manipulations sécuritaires recommandées.

2. Collecte des fibres

  1. Préparation de la collecte des fibres
    1. Étiqueter un minimum de 50 tubes microfuges (fibres 1 à 50) et pipeter 10 μL de tampon dénaturant sur chaque tube.
    2. Préparez la zone de prélèvement à l’aide de deux paires de pinces à disséquer les tissus fins, de tissus non pelucheux, d’une lampe de paillasse, d’un stéréomicroscope (avec la platine noire vers le haut), d’un vortex et d’une centrifugeuse de paillasse.
    3. Placez l’échantillon de muscle lyophilisé sur le couvercle d’une boîte de Pétri. Placez le couvercle sur la platine du microscope à dissection.
    4. Regardez la vidéo de la dissection à fibre unique. Pratiquez le protocole complet, de la collecte des fibres à l’identification du type de fibre unique, au moins deux fois avant de commencer une étude.
    5. Avant le prélèvement des fibres, calculez le volume total requis pour un échantillon de type fibre de chaque biopsie comme suit. Par exemple, si le volume de départ de 1 fibre = 10 μL et le volume restant après MyDoBID est de (1 fibre × 10 μL) - 1 μL utilisé pour le transfert de points = 9 μL (volume d’échantillon), calculez le volume total d’échantillon requis en multipliant le volume d’échantillon (μL) par le nombre total de Western Blots qui seront exécutés et doublez ce nombre pour tenir compte de la redondance : (9 μL × 4 Western blots) × 2 = 72 μL. Calculer le nombre de fibres requis par échantillon typé en divisant le volume d’échantillon final requis (μL) par le volume d’échantillon par échantillon spécifique au type de fibre (p. ex., 72 μL ÷ 9 μL = 8 fibres par échantillon spécifique au type de fibre). Pour ce faire, collectez un total de 50 fibres.
      REMARQUE : Le volume d’échantillon requis est la concentration minimale de protéines requise pour effectuer à la fois MyDoBID et le Western Blot si la quantité de protéines chargée est équivalente à une fibre de ~3 mm (~12 μg de poids humide) pour chaque échantillon (voir le fichier supplémentaire 1 pour plus de détails). Cependant, ce volume ne tient pas compte de la nécessité de gels répétés pour une protéine donnée.  ATTENTION : Les pinces sont tranchantes ; Manipulez-les avec précaution pour éviter tout risque de perforation de la peau.
  2. Isolation à fibre unique
    1. Sur une petite feuille de papier de 5 cm x 1 cm, tracez une ligne de 1 cm à l’aide d’une règle. Marquez tous les 1 mm sur cette ligne.
    2. Insérez-le sous le couvercle de la boîte de Pétri comme guide pour estimer la longueur des fibres collectées.
    3. Placez l’échantillon de muscle lyophilisé sous le stéréomicroscope à faible grossissement (x 7,5). Utilisez une paire de pinces à disséquer les tissus fins pour maintenir le muscle lyophilisé en place et avec l’autre commencez à séparer de petits faisceaux de fibres (comme on le voit dans la vidéo).
    4. Isolez un faisceau de fibres et continuez à les séparer jusqu’à ce que des segments de fibres uniques soient isolés du faisceau.
    5. Collectez un minimum de 50 fibres d’au moins ~1 mm de longueur.
    6. Déplacez la fibre dans un espace vide de la boîte de Pétri. Inspectez les segments à fibre unique sous un grossissement plus élevé (x 50). Assurez-vous qu’il s’agit d’une seule fibre en séparant davantage la fibre à la fin. Si la fibre se brise au lieu de se séparer, il s’agit d’une seule fibre.
  3. Dénaturation des fibres
    1. À l’aide d’une pince, collectez délicatement la fibre et placez-la directement dans le tampon dénaturant aliquote (ne laissez pas la pince rencontrer le tampon).
    2. Vérifiez la pince au microscope pour vous assurer que la fibre a été retirée avec succès. Fermez le tube et tapotez fermement le fond du tube sur le banc trois fois pour vous assurer que la fibre se déplace dans le tampon.
    3. Essuyez la pince à l’aide d’un mouchoir non pelucheux avant de passer à la fibre suivante. Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les fibres soient collectées.
    4. Vortex les échantillons de fibres et centrifugation brève pendant 5 s à 2 500 × g pour aspirer l’échantillon au fond du tube.
      REMARQUE : La durée de centrifugation (5 s) est chronométrée à partir du début (0 × g) jusqu’à ce que la vitesse atteigne ~2 500 × g.
    5. Laisser les échantillons à température ambiante pendant 1 h. Conserver à -80 °C pour une utilisation future. Congelez puis décongelez les échantillons avant utilisation.

3. Transfert de points

  1. Préparation et activation de la membrane
    1. Mesurez, étiquetez et découpez une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) (taille des pores de 0,2 μm) pour qu’elle s’adapte à 50 échantillons (~10,5 cm x 5,5 cm).
    2. Marquez numériquement la bordure gauche de haut en bas (1 à 10) et la bordure supérieure par ordre alphabétique de gauche à droite (A à E) espacées de 1 cm.
    3. Préparez quatre feuilles de papier filtre de 12,5 cm x 7,5 cm.
    4. Empilez deux feuilles ensemble pour former une pile. Faites tremper la pile de papier filtre dans 1x tampon de transfert.
    5. Placez la membrane dans un récipient. Versez 95 % d’éthanol sur la membrane, avec suffisamment de volume pour immerger complètement la membrane (10-15 ml). Agitez sur la bascule pendant 1 min.
    6. Récupérez l’éthanol, plongez la membrane dans 1x tampon de transfert (~15 mL) et balancez pendant 2 minutes supplémentaires.
      REMARQUE : L’éthanol et le tampon de transfert peuvent être réutilisés pour de futures expériences de transfert de points jusqu’à ce que la sédimentation se forme (changement après six utilisations).
    7. Posez la pile de papier filtre imbibée de tampon de transfert sur une surface mobile plane telle qu’un grand couvercle et aplatissez-la avec le rouleau. Positionnez la membrane PVDF sur la pile à l’aide d’un dépresseur de gel ou d’une pince à épiler.
    8. Placez une seule feuille de papier filtre sec sur le dessus de la membrane et déplacez le rouleau sur le papier filtre pour absorber tout excès de tampon sur la surface de la membrane. Retirez le papier filtre supérieur sans frotter la membrane.
      ATTENTION : Le méthanol (classe 3, sous-risque 6.1) et l’éthanol (classe 3) sont dangereux. Reportez-vous à la fiche signalétique (FDS) pour obtenir des recommandations de manipulation en toute sécurité.
  2. Absorption de l’échantillon par la membrane
    1. Décongelez les échantillons de fibres, effectuez une brève centrifugation (5 s) à température ambiante comme à l’étape 2.3.4 et mélangez soigneusement l’échantillon.
    2. Sans toucher la membrane avec la pointe de la pipette, déposez lentement une goutte de ~1 μL de chaque échantillon sur la membrane dans la zone désignée. Les dimensions de la zone désignée par échantillon de fibre sont de ~1 cm x 1 cm. Essayez de repérer l’échantillon au centre de cette zone.
    3. Laissez les gouttelettes de l’échantillon pénétrer à travers la membrane pendant au moins 15 minutes. Assurez-vous qu’il ne reste pas de tampon d’échantillon et qu’il est complètement absorbé.
    4. À l’aide d’une pince à épiler en plastique, soulevez délicatement la membrane de la pile de papier filtre humide, placez-la sur une seule feuille de papier filtre sèche et déshydratez la membrane pendant au moins 5 minutes.
    5. Une fois que les taches d’échantillon deviennent complètement blanches, réactivez la membrane.
  3. Réactivation et blocage de la membrane
    1. Réactivez la membrane en répétant les étapes 3.1.5 et 3.1.6.
    2. Placez la membrane dans le tampon de lavage et rincez pendant 5 min à bascule. Jetez le tampon de lavage.
    3. Incuber la membrane dans un tampon bloquant pendant 30 min tout en se balançant à bascule.
    4. Rincez la membrane 3 fois avec un tampon de lavage jusqu’à ce que le tampon ne soit plus trouble.
    5. Laissez la membrane au lavage final sur la bascule.

4. Immunomarquage

  1. Détection de MHCIIa
    1. Diluer l’anticorps primaire MHCIIa à raison de 1 sur 200 dans 10 mL de tampon d’albumine sérique bovine (BSA).
    2. Jetez le tampon de lavage de la membrane, puis versez l’anticorps MHCIIa dilué sur la membrane.
    3. Placez le récipient (avec la membrane en MHCIIa) sur la bascule à température ambiante pendant 2 h ou à 4 °C pendant la nuit.
    4. Prélevez l’anticorps MHCIIa et conservez-le à 4 °C. Lavez la membrane avec un tampon de blocage pendant 2 min sur la bascule.
      REMARQUE : Tous les anticorps primaires peuvent être réutilisés jusqu’à cinq fois tant que le tampon reste clair.
    5. Rincez deux fois de plus ; 5 min à chaque fois ; Trois lavages au total.
    6. Diluer l’anticorps secondaire de l’immunoglobuline G peroxydase de raifort (IgG-HRP) de souris à raison de 1 sur 20 000 dans 10 mL de tampon bloquant et l’ajouter à la membrane.
    7. Jeter le tampon de lavage et incuber la membrane dans les IgG-HRP secondaires de souris avec balancement pendant 1 h.
    8. Jeter le secondaire et laver la membrane dans un tampon de lavage (2, 5, 5 min).
    9. Laissez tremper la membrane dans le lavage final jusqu’à ce qu’elle soit prête pour l’imagerie.
    10. Mettez l’imageur de gel sous tension, attendez 15 minutes qu’il atteigne la température de fonctionnement requise, puis ouvrez le logiciel d’imagerie (voir Tableau des matériaux).
    11. Dans la fenêtre du logiciel, cliquez sur New Single Channel Protocol (Nouveau protocole à canal unique ) (Figure 3A). Pour obtenir une image en lumière blanche de la membrane, sous Applications | Taches | cliquez sur Colorimetric (Colorimétrique) (Figure 3B).
    12. Cliquez sur la zone de gel ; Chaque option est programmée pour des dimensions spécifiques afin de s’adapter à la taille des différents types de gel. Sélectionnez l’option appropriée pour s’adapter au mieux aux dimensions de la membrane (Figure 3C).
    13. Préparez la LCE en combinant des réactifs de luminol et de peroxydase dans un rapport de 1 :1. Faire un volume suffisant de mélange ECL pour couvrir toute la membrane, généralement un volume total de 800 à 1 000 μL est nécessaire.
    14. Placez la membrane sur un grand plateau en plastique transparent et dispersez le mélange ECL sur la membrane.
    15. Placez la membrane sur la plaque d’imagerie.
    16. Cliquez sur Position Gel (bouton jaune) pour une vue de la caméra en direct. Cliquez longuement et faites glisser le bouton de zoom pour maximiser la zone d’imagerie de la membrane. À ce stade, redressez la position de la membrane si nécessaire.
    17. Cliquez sur Run Protocol (Exécuter le protocole ) (bouton vert) et attendez qu’une image colorimétrique de la membrane soit produite. Enregistrez cette image pour vous aider à faire correspondre les points à l’échantillon de fibre correspondant.
    18. Sans déplacer la membrane, changez d’application sur le logiciel en cliquant sur l’option d’un binning 2 x 2 (Chemi High Resolution) (Figure 3D).
    19. Sous Exposition de l’image et logiciel, optimisez le temps d’exposition, cliquez sur Bandes pâles (Figure 3E) | Mode d’accumulation du signal.
    20. Sous Configuration, saisissez 1 s pour la première image, 30 s pour la dernière image et 30 images au total (Figure 3F).
    21. Cliquez sur Exécuter le protocole.
    22. Enregistrez une image aux étapes suivantes : avant la saturation du signal (tous les points visibles sont noirs), la saturation initiale du signal (certains points commencent à saturer ) et les taches sursaturées (tous les points avec un signal fort détecté sont saturés).
    23. Enregistrez toutes les images requises avant de mettre fin à l’accumulation du signal. Retirez la membrane de l’imageur.
    24. À l’aide du détacheur de gel, remettez la membrane dans le récipient avec le tampon de lavage.
  2. Détection de l’ICM
    1. Videz le tampon de lavage et traitez la membrane avec un tampon de décapage pendant 30 min à 37 °C (assurez-vous que la membrane est complètement immergée).
    2. Récupérez le tampon de décapage et rincez la membrane dans le tampon de lavage pendant 5 min avec bascule.
      REMARQUE : Le tampon de décapage peut être réutilisé 10 fois avant d’être jeté.
    3. Videz le tampon de lavage et appliquez cette fois l’anticorps primaire MHCI dilué à une concentration initiale de 1 sur 200 (intervalle : 1 sur 200 à 1 sur 500). Basculez la membrane à température ambiante pendant 1 h.
    4. Après l’incubation dans l’anticorps primaire MHCI, prélever l’anticorps et laver la membrane comme aux étapes 4.1.4 et 4.1.5.
    5. Diluer l’anticorps secondaire IgM HRP de souris dans le tampon bloquant à 1 sur 20 000. Videz le tampon bloquant de la membrane et incubez dans les IgM secondaires de souris comme à l’étape 4.1.7.
    6. Le lavage et la capture d’image ont détecté MHCI comme dans les étapes 4.1.8 à 4.1.24.
      ATTENTION : Le tampon de décapage contient de l’organophosphine 3 à 5 % (classe 8). Reportez-vous à la fiche signalétique pour obtenir des recommandations de manipulation sécuritaire.
  3. Détection de MHCIIx potentiel à l’aide de l’actine
    1. Dénudez à nouveau la membrane (étapes 4.2.1 et 4.2.2).
    2. Répétez la section 4.1, cette fois en appliquant l’anticorps primaire d’actine dilué à 1 sur 500 dans le tampon BSA, puis l’anticorps secondaire HRP de lapin dilué à 1 sur 20 000 dans le tampon bloquant.

5. Identification du type de fibre

  1. Analyse des signaux MHCI, MHCIIa et actine
    1. Familiarisez-vous avec le panneau d’intensité du signal (Figure 4A). Prenez note des étapes 5.1.2 à 5.1.4.
    2. Une intensité de signal saturée indique qualitativement que la détection de la protéine est forte.
    3. Un modéré indique que la protéine cible est présente à un niveau moyen.
    4. Un faible signal indique que peu de protéines cibles sont présentes.
    5. Utilisez le panneau d’intensité du signal pour classer les fibres dont l’intensité du signal est « saturée », « modérée » ou « faible » (Figure 4A).
    6. Effectuez l’identification du type de fibre en comparant d’abord les résultats MHCIIa et MHCI (Figure 4B, taches gauche et centrale).
    7. Enregistrez les fibres avec une intensité de signal saturée ou modérée d’une seule isoforme du CMH.
    8. Si le signal isoforme du CMH est « faible », laissez la fibre non marquée (voir Figure 4B).
    9. Enfin, lorsque l’actine est observée (intensité de signal modérée ou saturée) dans les fibres sans MHCI ou IIa détecté, enregistrez-la comme une fibre potentielle de type IIx (Figure 4B, transfert à droite).
    10. Enregistrer les fibres avec un faible signal isoforme du CMH, mais l’actine détectée (intensité modérée ou saturée) n’est pas identifiée.
    11. Éliminer les échantillons dont la détection est faible ou inexistante (aucune fibre n’a été collectée) pour les trois protéines cibles (figure 4C).
    12. Enregistrez n’importe quelle fibre où les signaux MHCI et MHCII sont détectés avec un signal « saturé » ou modéré. Ces échantillons ne sont pas destinés à être utilisés dans une préparation spécifique au type de fibre.
  2. Préparation d’échantillons spécifiques à un type de fibre
    1. Préparez un échantillon de type I et de type II distinct pour chaque biopsie. Dans le cas d’un échantillon de type II, combiner le nombre minimal requis de fibres (calculé à l’étape 2.1.5) dans lequel la MHCIIa est détectée à des niveaux saturés ou modérés.
    2. Dans un tube séparé étiqueté comme étant de type I, répétez ce processus pour les fibres dans lesquelles l’ICM est détecté (Figure 4D).
    3. Utilisez des fibres avec une intensité de signal modérée s’il n’y a pas assez de fibres avec des signaux saturés.
    4. Combinez toutes les fibres IIx potentielles.
    5. Utilisez immédiatement des échantillons spécifiques au type de fibre pour le transfert Western ou stockez-les à -80 °C pour une utilisation ultérieure.

6. Confirmation du type de fibre Western blot

  1. Utilisez 10 μL de chaque échantillon spécifique au type de fibre (le volume d’échantillon minimum requis, voir l’étape 2.1.5).
  2. Séparez les échantillons à l’aide du gel préfabriqué spécifié via SDS-PAGE selon le protocole du fabricant.
  3. Utilisez un imageur de gel pour détecter la protéine dans le gel selon le protocole du fabricant.
  4. Placez le gel dans un tampon de transfert froid 1x pendant 10 min.
  5. Transfert humide des protéines sur une membrane de nitrocellulose de 0,45 μm (9,5 cm x 13,5 cm) selon le protocole du fabricant.
  6. Après le transfert, rincez brièvement la membrane avec de l’ultrapur H2O dans un récipient. Versez l’eau ultra-pure.
  7. Ajouter 10 mL de solution d’amplificateur de signal d’anticorps à la membrane et laisser reposer à température ambiante pendant 10 minutes.
  8. Récupérez la solution d’amplificateur de signal d’anticorps et lavez 5 fois (5 s par lavage) avec de l’ultra-pur H2O.
    REMARQUE : La solution d’amplificateur de signal d’anticorps peut être utilisée 5 fois avant d’être jetée.
  9. Versez le dernier lavage, ajoutez la solution de blocage et basculez à température ambiante pendant 1 h.
  10. Utilisez une lame de scalpel propre ou des ciseaux pour couper horizontalement à travers la membrane à un poids moléculaire qui garantit que les protéines de 180 kDa et plus se trouvent sur la partie supérieure de la membrane.
  11. Utilisez cette section supérieure pour une confirmation supplémentaire du type de fibre.
  12. Utilisez la portion inférieure à 180 kDa pour détecter différentes protéines cibles.
  13. Sur la partie supérieure de la membrane, suivre la section 4.1 avec l’anticorps primaire MHCIIx et l’anticorps secondaire HRP d’immunoglobuline M (IgM) de souris.
  14. Décaper la membrane (comme décrit dans les rubriques 4.2.1 et 4.2.2) avant de répéter le processus avec l’anticorps primaire IgG MHCIIa et l’anticorps secondaire IgG HRP de souris.
  15. Déshabillez une fois de plus et appliquez enfin l’anticorps primaire IgM MHCI et l’anticorps secondaire IgM HRP de souris.
    REMARQUE : Cette étape est qualitative et donc toute perte de protéines due au décapage de la membrane n’est pas un problème.
  16. Comparez le signal détecté à travers les différentes isoformes du CMH (comme le montre la figure 5B). Lorsque l’intensité du signal est détectée à des niveaux modérés à saturés dans l’échantillon attendu (MHCI - type I, MHCIIa - type II et MHCIIx - type IIx), les échantillons spécifiques au type de fibre seront enregistrés comme fiables pour une utilisation dans de futures études.
  17. Enregistrez l’échantillon comme non fiable lorsque plus d’une isoforme de CMH est également détectée dans un échantillon.
    ATTENTION : La solution d’activateur d’anticorps contient de l’hydroxyde de sodium à 50 %. Reportez-vous à la fiche signalétique pour obtenir des recommandations de manipulation sécuritaire.

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Résultats

Identification des fibres musculaires MHCI, MHCIIa et MHCIIx individuelles à l’aide du transfert de points
L’une des caractéristiques de MyDoBID est la catégorisation de l’intensité variable du signal MHC et de l’actine dans une fibre donnée (Figure 4A). Le type de fibre a été identifié par la présence ou l’absence d’isoformes MHCI et IIa (Figure 4B). Six fibres n’ont montré aucune détection de CMH ou d’actine, ce qui indique qu’aucune fibre ...

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Discussion

Collecte de fibres
Sur la base de plusieurs années d’expérience, la plupart des chercheurs peuvent maîtriser cette technique ; Cependant, la pratique permet une collecte plus rapide et plus efficace des fibres pour les analyses en aval. Pour pouvoir isoler 30 segments de fibres simples d’une qualité pour la mise en commun, il est recommandé de prélever 50 segments de fibres par échantillon. Il est recommandé d’étudier attentivement la vidéo de collecte de fibres et après avoir effectué deux séances d’...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Les anticorps contre le CMH I (A4.840) et le MHCIIa (A4.74) utilisés dans cette étude ont été développés par le Dr H. M. Blau et l’anticorps contre MHCIIx (6H1) a été développé par le Dr C. A. Lucas et obtenu auprès de la Banque d’études sur les hybridomes du développement (DSHB), grâce aux auspices de l’Institut national de la santé de l’enfant et du développement humain et maintenu par l’Université de l’Iowa. Département des sciences biologiques (Iowa City, IA). Nous remercions Victoria L. Wyckelsma d’avoir fourni les échantillons de muscles humains pour cette étude. La majorité des images de la figure 1 proviennent de BioRender.com.

Financement:
Cette étude n’a reçu aucun financement externe.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x Tampon dénaturantFabriquer selon la recetteLes constituants peuvent provenir de Sigma-Aldrich ou d’autres sociétés de distribution de produits chimiques  ; 1x tampon de dénaturation est fabriqué en diluant 3x tampon de dénaturation 1 en 3 v/v avec 1X Tris-HCl (pH 6,8). Conserver à -20 ° ;C.
3x tampon dénaturantFabriquer selon la recetteLes constituants peuvent provenir de Sigma-Aldrich ou d’autres distributeurs de produits chimiques3x tampon dénaturant contient : 0,125M Tris-HCI, 10 % de glycérol, 4 % SDS, 4 M d’urée, 10 % de 2-mercaptoéthanol et 0,001 % de bleu de bromophénol, pH 6,8. Conserver à -20 ° ;C.
95 % d’éthanolN/A100 % d’éthanol peut provenir de n’importe quelle entrepriseDilué à 95 % avec du H2O ultra-pur.
Anticorps polyclonal d’actine de lapinSigma-Aldrich  ; A2066Diluer 1 sur 1 000 avec tampon BSA.
Balances analytiquesMettler ToledoNuméro de modèle : MSZ042101
Amplificateur d’anticorpsThermo Fischer Scientific32110Le nom du produit est Miser Extender d’anticorps Solution NC.
Bécher (100 mL)N/AN/A
Centrifugeuse de paillasseEppendorf5452Nom du modèle : Mini Spin.
Tampon de blocage : 5 % de lait écrémé dans le tampon de lavage.Tamponacheté par
: 1 % BSA/PBST, 0,02 % NaN3BSA : Sigma-Aldrich  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; PBS : Laboratoires Bio-Rad. NaN3  : Sigma-Aldrich  ;BSA : A6003-25G  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 10x PBS : 1610780   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; NaN3 : S2002Albumine sérique bovine (BSA), solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et azoture de sodium (NaN3). Conserver à 4 °C.
Levier d’ouverture de la cassetteBio-Rad Laboratories4560000Utilisé pour ouvrir les cassettes de gel préfabriqué.
Chemidoc MP Imager  ;Bio-Rad LaboratoriesNuméro de modèle : Capot universel IIITout système d’imagerie doté de capacités d’imagerie en gel sans taches.
Buvard CriterionBio-Rad Laboratories1704070Comprend un sac de glace, un plateau de transfert, un rouleau, 2 porte-cassettes, du papier filtre, des tampons en mousse et un couvercle avec câbles.
Cellule Critère (Bio-Rad)Bio-Rad Laboratories1656001
ECL (chimiluminescence améliorée)Bio-Rad Laboratories1705062Nom du produit : Substrat Clarity Max Western ECL.
Tampon d’électrophorèse 1x Tris Glycine SDS (TGS)Bio-Rad Laboratories1610772Diluer 10x TGS 1 sur 10 avec du H2O ultra-pur.
Papier filtre, 0,34 mm d’épaisseurWhatmann3030917En vrac 3 MM, paquet de 100 feuilles, 315 x 335 mm.
Pince à disséquer les tissus finsDumontF6521-1EABijouterie S Forceps n° 5.
Barquette/couvercle plat en plastique  ;   ;N/AN/AAssez grand pour y placer la membrane. Assurez-vous que la surface est complètement plane.
Système de lyophilisationLabconco7750030Freezone 4,5 L avec étage d’échantillonnage en chambre en verre.
Congélateur -80 oC  ;N/AN/ATout congélateur avec une température constante de -80 ° ; C convient.
Libérateurs de gel1653320Bio-RadGlissez-vous sous la membrane pour rassembler ou déplacer la membrane.
Crayon mine grisN/A N/A
&NBSP ; Logiciel de laboratoire d’imagerie  ;Bio-Rad LaboratoriesN/AFigures fait référence à la version 5.2.1 du logiciel mais d’autres versions peuvent être utilisées.
IncubateurBio-Rad Laboratories1660521Tout incubateur pouvant être réglé sur 37 ° ; C suffirait.
LampeN/AN/A
Agitateur magnétique avec puceN/AN/A
Rouleau à membrane  ;Bio-Rad Laboratories1651279peut être acheté dans le pack Transfert. Cependant, si ce produit n’est pas disponible, n’importe quel tube cylindrique à surface lisse suffisamment long pour rouler sur la membrane suffirait.
Tubes de microcentrifugation  ; (0,6 ml)N/AN/A
IgG de souris HRP secondaireThermo Fisher Scientific31430IgG anti-souris de chèvre (H+L), RRID AB_228341. Diluer à 1 sur 20 000 dans un tampon de blocage.
Souris IgM HRP secondaireAbcamab97230Chèvre Anti-souris IgM mu chaîne. Utiliser à la même dilution que les IgG de souris.
Anticorps primaire de la myosine à chaîne lourde I (MHCI)DSHBA4.840  ;Plage de dilution : 1 sur 200 à 1 sur 500 en tampon BSA.
Anticorps primaire de la myosine à chaîne lourde IIa (MHCIIa)DSHBA4.74  ;Plage de dilution : 1 sur 200 à 1 sur 500 en tampon BSA.
Anticorps primaire de la myosine à chaîne lourde IIx (MHCIIx)DSHB6H1Plage de dilution : 1 sur 200 à 1 sur 500 dans le tampon BSA.
Membrane nitrocellulosique 0,45 & micro ; m  ;Bio-Rad Laboratories1620115pour le western blot.
Couvercle de boîte de PétriN/AN/A
Pince à épiler en plastiqueN/AN/A
Bloc d’alimentation  ;Bio-Rad Laboratories164-5050 Nom duproduit : Alimentation de base.
Échelle protéiqueThermo Fisher Scientific26616PageRuler Échelle protéique précolorée, 10 à 180 kDa.
Membrane PVDF 0.2 µ ; mBio-Rad Laboratories1620177
Rabbit HRP secondaireThermo Fisher Scientific31460Chèvre anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution identique à celle des anticorps secondaires de souris.
RockerN/AN/A
RègleN/AN/A
ScisseauxN/AN/A N/A
StereomicroscopeMoticSMZ-168
Tampon de décapageThermo Fisher Scientific21059Nom du produit : Restore Western Blot Stripping Buffer.
Mouchoir en papier (non pelucheux)Kimberly-Clark professional34120Nom du produit : Kimwipe.
Tampon de transfert (1x tampon Tris Glycine (TG), 20 % Méthanol)TG : Bio-Rad Laboratories  ;   ; Méthanol : Tampon MerckTG : 1610771   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; Méthanol : 1,06018diluer 10x TG tampon avec H2O ultra-pur à 1x. Ajouter 100 % de méthanol à une concentration finale de 20 % de méthanol. Conserver à 4 °C.
Plateau de transfertBio-Rad Laboratories1704089
  ; Gel préfabriqué à activation UVBio-Rad Laboratories5678085Type de gel : 4&ndash ; 15 % Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 puits, 15 & micro ;L.
VortexN/AN/A
Tampon de lavage (1x TBST)10x TBS : Astral Scientific  ; Préadolescent 20 : Sigma  ; BIOA0027-4L1x recette TBST : 10x solution saline tamponnée au Tris (TBS) est diluée à 1x avec du H2O ultra-pur, Tween 20 est ajouté à une concentration finale de 0,1 %. Stockez la mémoire tampon à 4 ° ;C.
N’importequel récipient tupperware, adapté aux dimensions approximatives de la membrane, suffirait.
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Références

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