Évaluation de la consommation d’oxygène mitochondriale à l’aide d’un test fluorescent basé sur un lecteur de plaque

Summary

L’évaluation de la consommation d’oxygène fournit des informations intégrales sur la fonction mitochondriale. À l’aide d’une sonde phosphorescente équipée d’un lecteur de plaques fluorescentes, il est possible d’obtenir facilement des données précises et reproductibles sans équipement spécialisé. Ce test permet à n’importe quel laboratoire de mesurer la consommation d’oxygène de mitochondries isolées et de calculer les rapports de contrôle respiratoire.

Abstract

Les mitochondries remplissent de nombreuses fonctions importantes, notamment la respiration cellulaire, la production d’ATP, le contrôle de l’apoptose et le rôle de plaque tournante des voies métaboliques. Par conséquent, l’évaluation expérimentale de la fonctionnalité mitochondriale peut donner un aperçu des variations entre différentes populations ou états pathologiques. De plus, il est utile d’évaluer si les mitochondries isolées sont suffisamment saines pour procéder à des expériences. Une caractéristique souvent utilisée pour comparer la fonction mitochondriale dans différents échantillons est le taux de consommation d’oxygène. La consommation d’oxygène et le calcul ultérieur du rapport de contrôle respiratoire dans des cellules intactes ou des mitochondries isolées des tissus peuvent servir à ces trois fins. En utilisant des mitochondries isolées du foie de lézards des broussailles en conjonction avec une sonde phosphorescente sensible aux fluctuations de la concentration en oxygène d’une solution, nous avons mesuré la consommation d’oxygène à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes. Cette méthode est non seulement rapide et efficace, mais peut également être menée avec une petite quantité de mitochondries et sans avoir besoin d’équipement spécialisé. Le protocole étape par étape décrit ici augmente l’accessibilité de l’évaluation fonctionnelle mitochondriale pour les chercheurs.

Introduction

Les mitochondries sont des organites, de la taille d’une bactérie, que l’on trouve dans les cellules eucaryotes. Ce sont des organites uniques car ils contiennent de l’ADN et ont deux membranes, une externe et une intérieure. Les membranes externe et interne des mitochondries sont séparées par un espace intermembranaire, et la membrane interne se replie en structures appelées crêtes autour du compartiment le plus interne, appelé matrice. Ces crêtes augmentent la surface de la membrane interne, de sorte que plusieurs processus qui utilisent les crêtes peuvent se produire simultanément. Bien que les mitochondries soient impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires telles que le contrôle de l’apoptose et l’hébergement de plusieurs voies métaboliques, leur rôle vital dans la production d’ATP est essentiel à la survie cellulaire. En fait, 90 % de l’énergie d’une cellule provient des mitochondries¹. La production d’ATP implique la génération d’une différence électrochimique entre les membranes externe et interne, appelée potentiel de membrane mitochondriale (Δψ), qui se produit lorsque les ions H⁺ sont pompés de la matrice dans l’espace intermembranaire. La production d’ATP est finalement exploitée lors de l’oxydation des équivalents réducteurs via le mouvement des électrons à travers la chaîne respiratoire mitochondriale (CTE). L’accepteur final d’électrons est l’oxygène moléculaire (O₂). Au fur et à mesure que l’oxygène est consommé, le différentiel de concentration H⁺ s’accumule jusqu’à son maximum, auquel cas les ions H⁺ descendent leur gradient de concentration de l’espace intermembranaire vers la matrice en passant à travers le complexe ATP synthase. Le mouvement des ions H⁺ provoque un changement de conformation de l’ATP synthase, et l’ADP est rapproché du phosphate inorganique pour réagir et générer de l’ATP. Enfin, l’ATP est transloqué hors de la matrice mitochondriale dans le cytosol et peut être stocké ou utilisé pour faciliter les réactions en raison de la grande quantité d’énergie libre libérée lors de l’hydrolyse de ses phosphates. L’ensemble de ce processus est appelé phosphorylation oxydative, et comme l’oxygène est consommé, on dit que les mitochondries respirent².

L’accumulation et la force de Δψ, la quantité d’O₂ réduite (appelée consommation d’oxygène), ainsi que la génération d’ATP peuvent toutes être utilisées comme indications de la santé cellulaire. Les études fonctionnelles mitochondriales, telles que la mesure de Δψ, la teneur et la production totales d’ATP et la consommation d’oxygène, peuvent être quantifiées soit par des méthodes biochimiques traditionnelles, soit par fluorescence et luminescence dans des tests sur plaque. Par exemple, le potentiel de la membrane mitochondriale peut être comparé entre différents échantillons à l’aide de colorants fluorescents tels que l’ester éthylique de tétraméthylrhodamine, qui se lie spécifiquement aux mitochondries. La génération d’ATP peut être surveillée en ajoutant une protéine luminescente à une réaction dont les modifications sont corrélées à la concentration d’ATP. La quantification des taux de consommation d’oxygène, ou taux absolus de respiration, pendant l’OXPHOS, peut aider à élucider les causes des disparités dans la fonction mitochondriale et le métabolisme énergétique. L’évaluation de la consommation d’oxygène peut être utilisée pour calculer les rapports de contrôle respiratoire (RCR). Les valeurs RCR décrivent la capacité des mitochondries à produire de l’ATP en réponse à l’afflux d’ADP, qui est la fonction principale des mitochondries. Les valeurs RCR signifient l’état général des mitochondries isolées et permettent de comparer les réponses à différents traitements expérimentaux. Les différences dans les valeurs RCR peuvent représenter un dysfonctionnement mitochondrial ou indiquer une différence biologique entre différentes mitochondries isolées de deux sources ou plus. Une autre mesure importante de la fonction dans les mitochondries isolées est l’efficacité mitochondriale définie comme les moles d’ATP synthétisées par mole de O₂, ou le rapport P/O³.

Compte tenu de la quantité d’informations qui peuvent être recueillies à partir de la mesure des paramètres mitochondriaux et des divers cas dans lesquels ces informations peuvent être utilisées, la capacité de recueillir efficacement des données fonctionnelles peut être utile dans de nombreux domaines de recherche différents. Les mesures de la consommation d’oxygène mitochondriale sont effectuées depuis des décennies à l’aide d’instruments très spécifiques – à l’aide d’une électrode Clark, qui peut être limitée par la taille de l’échantillon nécessaire pour effectuer des mesures, et plus récemment, d’instruments sophistiqués qui peuvent mesurer la respiration mitochondriale et de multiples autres paramètres, mais dont le coût peut être prohibitif. Ce protocole est une approche alternative adaptée utilisant une sonde phosphorescente sensible à l’oxygène (MitoXpress)^4,5. Le signal de la sonde est détecté à l’aide d’un lecteur de plaques en mode de fluorescence résolue dans le temps pour des mesures continues dans le temps. La phosphorescence présente une plus grande différence d’énergie entre le photon absorbé et le photon émis par rapport à la fluorescence et, par conséquent, est mieux adaptée à la surveillance continue des changements de signal. Cela permet à presque tous les laboratoires d’effectuer ces mesures, pas seulement ceux qui se concentrent sur le métabolisme mitochondrial ou qui peuvent se permettre un équipement hautement spécialisé. Le système modèle que nous utilisons est constitué de mitochondries isolées de trois lézards arboricoles, de deux espèces parentales et d’une espèce introgressée (contenant de l’ADN nucléaire d’une espèce parentale et des mitochondries de l’autre – des hybrides). Ces lézards ont été choisis parce que nous avons émis l’hypothèse qu’il y a des conséquences métaboliques et énergétiques pour les hybrides ayant des sources d’ADN nucléaire et mitochondrial différentes. Nous avons utilisé un kit de test disponible dans le commerce avec un lecteur de plaques multimode qui peut augmenter l’accès à ce type de test à un plus grand nombre de chercheurs et de domaines de recherche.

Protocol

Les lézards ont été euthanasiés par asphyxie au CO₂ suivie d’une décapitation immédiate, conformément aux politiques définies par le Bureau du bien-être des laboratoires animaliers et les directives du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux d’Elon.

1. Isolement des mitochondries⁶

REMARQUE : Conservez toutes les solutions froides (tableau 1) et les échantillons sur de la glace tout au long de ces étapes.

1. Retirez le foie, pesez-le, puis rincez-le avec ~3 mL de solution saline glacée tamponnée au phosphate (1x, -/-).
2. Hachez le foie dans 1 mL de L-MIB à l’aide d’une lame de rasoir fraîche.
3. Amenez le volume total de tissu plus le L-MIB à 2 mL et perturbez mécaniquement les cellules hépatiques pendant quatre passages avec un homogénéisateur Dounce.
4. Essorer l’homogénat à 300 × g (37 °C, 10 min).
5. Transférez le surnageant dans un tube frais et placez-le sur de la glace.
6. Remettre la pastille en suspension dans 2 mL de L-MIB, réhomogénéiser et essorer à nouveau à 300 × g (37 °C, 10 minutes).
7. Mélanger les surnageants des deux centrifugations et centrifuger à 10 000 × g (37 °C, 10 min).
8. Remettre la pastille en suspension dans ~0,350 mL de L-MIB.
9. Déterminer la quantité de protéines totales (mg de mitochondries/mL de L-MIB) à utiliser comme approximation du contenu mitochondrial ^4,5,6.

2. Consommation d’oxygène

1. Préchauffez toutes les solutions utilisées (tableau 1) dans les étapes suivantes à 30 °C dans un bain-marie.
2. Diluer les mitochondries dans la LEB à 6 mg/mL en fonction des résultats du test de concentration en protéines à l’étape 1.9.
3. Installer le test dans une plaque inférieure stérile à paroi noire et transparente de 96 puits (tableau 2).
   1. Ajouter 50 μL de l’échantillon (tampon L-EB ou échantillon de mitochondries) dans les puits appropriés.
   2. Ajouter 50 μL de traitement (L-EB, Glutamate/Malate ou Glutamate/Malate avec ADP).
   3. Diluez la sonde à l’ordre de 1:10 dans L-EB, puis ajoutez 100 μL de la sonde fluorescente dans chaque puits.
   4. Ajoutez doucement 50 μL d’huile minérale lourde dans chaque puits pour exclure l’oxygène ambiant.
4. Lire les mesures fluorescentes depuis le bas de la plaque à 380/650 nm d’excitation/émission toutes les 1,5 min pendant 45 min. Utilisez le mode cinétique avec une temporisation de 30 000 μs et une fenêtre de mesure de 100 μs.

3. Analyse des données

1. Exportez le fichier de données brutes à partir de l’ordinateur du lecteur de plaques sous forme de fichier .xls.
2. Ouvrez le fichier, puis copiez et collez les données brutes dans un nouvel onglet et étiquetez les lignes et les colonnes de manière appropriée.
3. Tracez le tampon L-EB uniquement sur l’échantillon de contrôle et L-EB + G/M en unités fluorescentes relatives (RFU) en fonction du temps.
   REMARQUE : Ces lignes doivent être relativement plates car il n’y a pas de mitochondries présentes, et par conséquent, aucun changement dans la concentration d’oxygène ne doit être détecté.
4. Tracez les valeurs de l’échantillon L-EB + G/M en fonction du temps.
5. Déterminez où les lectures deviennent plus cohérentes et aplatissent pour les commandes.
   REMARQUE : C’est là que l’analyse des données pour les échantillons expérimentaux doit commencer (indiquée par des flèches à la figure 1A). Les réactions peuvent prendre 10 à 15 minutes pour s’aplatir et atteindre leur maximum.
6. Faites un nouveau graphique contenant uniquement les données après le point temporel établi à l’étape 3.5 (appelées données « tronquées ») et ajoutez la ligne la mieux ajustée pour visualiser les données brutes à analyser.
7. Calculez la valeur RFU moyenne des données de tampon de contrôle tronquées uniquement (surlignées en jaune). Cette valeur est utilisée comme valeur minimale RFU comme référence dans le calcul de l’oxygène ci-dessous.
8. Calcul du taux de consommation d’oxygène (μM O₂/min)
   1. Copiez et collez la région linéaire des données brutes de l’étape 3.6 (c’est-à-dire les données tronquées) pour déterminer la concentration d’oxygène dans les échantillons mitochondriaux en traitement G/M + ADP à chaque point temporel 7,8,9,10.
   2. Utilisez l’équation (1)⁵ pour déterminer la concentration d’oxygène à chaque point temporel. [O₂]_a est la concentration en oxygène dans un tampon saturé en air (235 mM à 30 °C). I(t), Ia et Io sont le signal fluorescent de l’échantillon + de la sonde au temps t (par exemple, échantillon + G/M + ADP), le signal moyen de la sonde dans un tampon saturé d’air calculé à l’étape 3.7 et le signal maximal dans un tampon désoxygéné (réglé au signal maximum réalisable), respectivement.
      (1)
   3. Tracez les valeurs [O₂]_t calculées à l’étape 3.8.2 en fonction du temps et ajoutez une ligne de tendance linéaire avec l’équation de la droite la mieux ajustée.
      REMARQUE : Utilisez la pente de chaque ligne comme taux de consommation d’oxygène. Les doublons ou les triplés de n’importe quel échantillon peuvent être agrégés et utilisés pour la comparaison du taux de consommation.
9. Calculez le RCR en divisant la respiration mitochondriale avec et sans ADP, qui représentent respectivement les états 3 et 2.

Results

Le taux de consommation d’oxygène et le RCR mitochondrial ont été déterminés à partir des mitochondries de trois lézards différents à l’aide d’un kit de dosage avec une sonde phosphorescente de détection d’oxygène et un lecteur de plaque de fluorescence standard. Des recherches antérieures ont établi que la sonde de ce kit est directement corrélée à la consommation d’oxygène, où la phosphorescence est éteinte par l’oxygène moléculaire et le signal fluorescent augmente à mesure que les niveaux d’oxygène diminuent en raison de la respiration mitochondriale ^7,11. Les valeurs RFU sont enregistrées au fil du temps pour les échantillons de contrôle et expérimentaux, puis analysées. Les lectures RFU pour les puits de contrôle (tampon uniquement, tampon traité au glutamate/malate et tampon traité au glutamate/malate + ADP) ont été tracées en fonction du temps pour établir que tout changement de fluorescence dans les puits d’échantillon expérimentaux est dû à la présence de mitochondries. De plus, le contrôle glutamate/malate + ADP permet d’obtenir la quantité de base d’oxygène lors de la collecte des données. Des échantillons expérimentaux contenant des mitochondries isolées ont également été tracés sur le même graphique que les témoins.

La figure 1A montre que les RFU augmentent au fil du temps à partir d’un échantillon de mitochondries isolées, par opposition aux valeurs RFU relativement stables des témoins. Étant donné que les réactions prennent du temps à s’équilibrer, les 10 premières lectures environ, jusqu’à ce que les lectures de l’échantillon témoin ne soient pas aussi bruyantes et se stabilisent, sont retirées de l’ensemble de données (tableau supplémentaire S1 et figure supplémentaire S1). Ensuite, les valeurs restantes de l’échantillon de mitochondries traité avec du glutamate/malate + ADP sont transformées en concentration d’oxygène à chaque point temporel à l’aide de l’équation (1) (voir l’étape 3.2 du protocole), puis tracées en fonction du temps. La figure 1B montre le résultat de l’échantillon expérimental vu dans la figure 1A (croix) où la valeur de R² est très proche de 1 et la pente de la droite peut être calculée. La pente de la ligne est négative car à mesure que l’oxygène est consommé, la concentration totale d’oxygène dans cet échantillon diminue. Ce même processus est répété pour les mêmes échantillons mitochondriaux traités avec du glutamate/malate sans ADP afin d’obtenir des taux de consommation d’oxygène (tableau supplémentaire S2 et figure supplémentaire S2). Ensuite, la respiration mitochondriale avec et sans ADP, qui représentent respectivement les états 3 et 2, peut être utilisée pour calculer le RCR pour chaque type d’échantillon (figure supplémentaire S2). Lorsqu’on le compare côte à côte, le RCR moyen parmi les trois différents types de lézards arboricoles indique que le RCR de l’hybride avec des mitochondries introgressées est significativement inférieur à celui de l’un ou l’autre type parental (figure 1C). Les mitochondries de lézard hybride avaient des taux de consommation d’oxygène intermédiaires à ceux des deux types parentaux (figure 2).

Figure 1 : Exemple de résultats d’essai de consommation d’oxygène. (A) Données brutes provenant de réactions de contrôle utilisant un tampon uniquement et de réactions comprenant des mitochondries isolées qui ont été traitées avec du glutamate et du malate (G/M), avec ou sans ajout d’ADP. La fluorescence a été surveillée au fil du temps. Au fur et à mesure que l’oxygène est consommé, la fluorescence augmente. Les réactions tampons uniquement (G/M, indiquées par des cercles, et G/M + ADP, indiquées par des triangles) et les mitochondries avec traitement G/M (indiquées par des carrés) n’ont montré aucun changement. Les mitochondries traitées avec G/M + ADP (indiquées par des signes plus) ont consommé de l’oxygène. (B) Variations de la concentration d’oxygène au fil du temps calculées à partir des données brutes pour les mitochondries traitées avec G/M + ADP présentées en A. (C) Valeurs RCR pour les mitochondries de trois types différents de lézards mesurées à température ambiante. Cette figure est reproduite d’après Haenel et Del Gaizo Moore¹². L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’ANOVA dans R. Abréviations : G = glutamate ; M = malate ; RCR = rapport de contrôle respiratoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Taux de consommation d’oxygène des mitochondries de trois types de lézards. Les boîtes à moustaches montrent les taux médians de consommation d’oxygène sous forme de barres et les moyennes sous forme de point. Les types parentaux, Urosaurus graciosus et Urosaurus ornatus, étaient significativement différents les uns des autres. La forme introgressée (hybride) était intermédiaire aux types parentaux et ne différait pas significativement de l’un ou l’autre. Cette figure est reproduite d’après Haenel et Del Gaizo Moore¹². Abréviations : Ug = Urosaurus graciosus ; Uo = Urosaurus ornatus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition des solutions utilisées dans le protocole Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Carte de la plaque pour le dosage de la consommation d’oxygène. Pour chaque échantillon, réserver au moins 6 puits (3 puits témoins : L-EB uniquement, L-EB avec traitement G/M, L-EB avec traitement G/M + ADP ; 3 puits/échantillon expérimentaux : mitochondries avec traitement L-EB, L-EB + G/M et traitement L-EB G/M + ADP). Dans la mesure du possible, analysez chaque échantillon expérimental en double ou en triple. Abréviations : G = glutamate ; M = malate ; L-EB = tampon expérimental spécifique au lézard. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure supplémentaire S1 : Graphiques de données. (A) Graphique de toutes les données brutes pour la comparaison des échantillons et des témoins. (B) Graphique des données brutes bordées à partir des colonnes mises en évidence dans le tableau supplémentaire S1, démontrant que seuls les puits contenant des échantillons de mitochondries présentaient une augmentation appréciable des UFR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Consommation d’oxygène et rapports de contrôle respiratoire. (A) Graphique des données de consommation d’oxygène du tableau supplémentaire S1 pour déterminer les valeurs de l’état 2 et de l’état 3 en trouvant les équations des droites les mieux ajustées. (B) Calcul du ratio RCR à l’aide des pentes des droites en (A), qui représentent l’état 2 et l’état 3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S1 : Exemple représentatif de données brutes. Les colonnes en surbrillance sont des données utilisées pour les figures et les calculs (c’est-à-dire les données tronquées). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S2 : Exemple représentatif de données tronquées et de calculs ultérieurs de la consommation d’oxygène. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La mesure de la fonction mitochondriale est utile pour comparer différents échantillons, tels que des états pathologiques ou non pathologiques, différents types de tissus provenant d’un même animal ou entre différents types d’échantillons. Nous avons utilisé cette dernière comparaison pour tester notre hypothèse selon laquelle il existe une conséquence métabolique aux lézards arboricoles hybrides qui ont des mitochondries introgressées. Il existe diverses façons de déterminer expérimentalement la fonction des mitochondries, notamment la quantification de Δψ, de la teneur totale en ATP, de la production d’ATP, du contrôle respiratoire et du taux de consommation d’oxygène. Les mesures de la consommation d’oxygène des mitochondries isolées peuvent être effectuées à l’aide d’équipements spécialisés tels qu’une électrode Clark ou les Seahorse XF plus sophistiqués. Cependant, ces méthodes peuvent être soit limitées par la taille de l’échantillon nécessaire pour effectuer des mesures, soit prohibitives. Les lecteurs de plaques multimodes capables de lire la fluorescence sont devenus un équipement standard dans les laboratoires de biologie cellulaire et de biochimie. Ainsi, une autre approche pour analyser quantitativement la consommation d’oxygène mitochondriale consiste à utiliser un kit disponible dans le commerce avec un lecteur de plaques fluorescentes. Ce protocole étape par étape décrit comment mesurer la consommation d’oxygène ainsi qu’effectuer les calculs. et économiquement dans les mitochondries isolées. Mesurer avec précision la capacité des mitochondries à produire de l’ATP lorsqu’elles sont alimentées en ADP, appelée respiration d’état 3, permet une comparaison directe d’OXPHOS entre les échantillons et les différences peuvent signifier des disparités fonctionnelles. De plus, l’état 3 de la respiration indique également la qualité des mitochondries qui ont été isolées, ce qui peut déterminer si une procédure d’isolement a fonctionné et/ou si l’échantillon est suffisamment bon pour être utilisé dans d’autres essais. Les valeurs RCR, qui sont calculées à l’aide de l’état 2 (glutamate et malate uniquement, pour construire Δψ) et des valeurs de l’état 3 (glutamate et malate plus ADP, pour permettre l’utilisation de Δψ pour la production d’ATP), fournissent encore une autre information pour la comparaison et sur la santé des mitochondries isolées. Les données présentées démontrent que la méthode proposée dans cet article peut aider à déchiffrer les variations entre différents types d’échantillons et à mesurer les taux de consommation d’oxygène et les valeurs RCR sans avoir besoin d’un équipement hautement spécialisé, rendant ainsi ces types de mesure plus accessibles.

Dans ce protocole, nous avons fraîchement isolé les mitochondries des lézards, et la consommation d’oxygène a été déterminée à l’aide d’un test MitoXpress Xtra Hs suivant le protocole du fabricant et modifiée selon Hynes et ^al.4 et Will et ^al.5 Les lézards variaient de 3,3 g à 5,1 g de masse corporelle totale avec une moyenne de 0,170 g de tissu hépatique/lézard, ce qui a donné ~0,350 mL de mitochondries concentrées et brutes. Les mitochondries isolées ont été utilisées dans le test de consommation d’oxygène à 6 mg/mL de protéines. Si la concentration en protéines mitochondriales, telle que déterminée à l’étape 1.7 du protocole, est faible, l’échantillon peut être retourné à 10 000 × g et la pastille remise en suspension dans un plus petit volume de L-MIB. Il convient également de noter que nous avons utilisé avec succès aussi peu que 4 mg/mL pour de petits échantillons de foie ou lorsque la totalité du foie n’était pas disponible.

Pour assurer l’équilibre gazeux et thermique des échantillons au début de l’essai, toutes les solutions utilisées dans la section 2 du protocole doivent être préchauffées à 30 °C dans un bain-marie. Dans la section 3 du protocole, les taux de variation de l’oxygène dissous (mM/min) sont extrapolés à partir des pentes initiales des profils de concentration d’oxygène décroissants pour chaque échantillon (étape 3.3 du protocole ; Tableau supplémentaire S1 et figure supplémentaire S1). L’échantillon + les taux de traitement G/M représentent la respiration mitochondriale de l’état 2, tandis que l’échantillon avec les taux de traitement G/M + ADP représentent la respiration mitochondriale de l’état 3. Ainsi, les RCR sont calculés pour chaque échantillon en divisant les valeurs de l’état 3 par les valeurs de l’état 2 pour chaque échantillon (tableau supplémentaire S2).

La consommation d’oxygène peut être comparée soit entre des échantillons uniques, comme démontré ici, soit entre différents traitements dans un seul échantillon. Dans ce dernier cas, des contrôles supplémentaires peuvent être nécessaires, tels que le contrôle du véhicule seul avec et sans mitochondries, afin d’exclure la possibilité que le traitement chimique lui-même n’interagisse pas avec la sonde phosphorescente. De plus, les données de consommation d’oxygène et de RCR recueillies peuvent être utilisées conjointement avec les données recueillies à partir des mêmes échantillons avec d’autres tests. Une fois que les mitochondries sont isolées, elles peuvent être utilisées dans plusieurs tests pour fournir une image plus complète de leur fonction¹². La mesure de Δψ, de la teneur totale en ATP et du taux de renouvellement de l’ATP sont quelques-uns des tests qui ont été combinés. De plus, l’utilisation d’inhibiteurs de l’ETC, de l’OXPHOS et de l’ATP synthase avec les tests permet une compréhension encore plus complète des différents types d’échantillons mitochondriaux, renforçant ainsi les conclusions tirées des données générées.

Un autre paramètre qui peut être mesuré dans les mitochondries isolées est l’efficacité mitochondriale, qui est définie comme le rapport P/O des moles d’ATP synthétisées par mole de O₂³. Les rapports P/O pourraient être calculés dans une extension de ce protocole en permettant aux mitochondries de l’état 3 d’épuiser l’ADP fourni dans la réaction, puis en ajoutant une aliquote de substrat ADP suivie d’une inhibition de l’ATP synthase par l’ajout d’oligomycine. Ces étapes supplémentaires permettent de calculer l’état 4, qui se produit lorsque les mitochondries continuent à consommer de l’oxygène et maintiennent un fort Δψ pour produire l’ATP maximal, fournit des informations sur la fuite des mitochondries (si les ions H⁺ repassent dans la matrice sans l’utilisation de l’ATP synthase et dissipent donc Δψ), indiquant finalement un dysfonctionnement des mitochondries. De plus, les mesures de l’état 4 peuvent également révéler si le translocateur ADP/ATP, qui déplace l’ATP nouvellement formé de la matrice tout en apportant en même temps le substrat ADP, est fonctionnel et s’il y a une fuite d’ADP et d’ATP à travers les membranes. L’ajout d’oligomycine, qui inhibe l’ATP synthase, est un contrôle pour déterminer si les mitochondries fuient en raison d’un dysfonctionnement réel. Bien que la mesure de l’état 4 afin de pouvoir calculer le rapport P/O dépassait la portée des informations que nous recherchions pour la comparaison entre les trois types d’échantillons mitochondriaux, il s’agit d’un autre élément de données sur la fonction mitochondriale et pourrait être effectué en tant qu’extension de ce protocole. Enfin, il convient de noter que les mitochondries peuvent être isolées à partir de cellules en culture et de différents tissus d’une souris ou d’un rat (par exemple, le foie, le cœur, la moelle épinière), entre autres. Des ajustements aux formulations MIB et EB ainsi qu’aux protocoles d’isolement peuvent être nécessaires 4,13,14,15,16. De plus, selon les instructions du fabricant, ce test pourrait être effectué avec des cellules entières et intactes. Par conséquent, la méthode présentée n’est pas limitée aux lézards ou aux mitochondries du foie, ce qui lui permet de convenir à un large éventail de modèles expérimentaux dans de nombreuses sous-disciplines scientifiques différentes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaques de fond noires/optiques à 96 puits	Thermo Fisher	265301	Plaques à paroi noire non traitées avec fond transparent.
ADP	Sigma	A2754	Dilué 100 & micro ; M stock avec EB immédiatement avant utilisation.
BSA	Thermo Fisher	BP1600-100	Préparez 2 mg/mL de stock dans de l’eau pour le dosage des protéines.
Dulbeccos 1x PBS (-/-)	Sigma	D8537	Assurez-vous que le PBS est exempt d’ions Mg2+ ou Ca2+.
EGTA	Sigma	E3889
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
Acide L-glutamique	Sigma	G1251
Acide L-glutamique sel de potassium	Sigma	S372226
Acide L-malique	Sigma	M8304
Sel monopotassique d’acide L-malique	Sigma	49601
Le kit de consommation d’oxygène MitoXpress	Le kit Agilent	MX-200-4	contient du stock de sonde et de l’huile minérale HS.
MOPS	Sigma	M3183
Colorant de dosage des protéines (5x)	BioRad	500-0006	N’importe quel dosage de protéines peut se substituer.
R version 3.3  ;	R Core Development Team 2016
Lecteur de microplaques Thermomax EnSpire Lecteur de plaques multimode et logiciel	PerkinElmer		Lecteur de plaques fluorescentes standard
Base Trisma	Sigma	T6066	N’importe quelle version de la base Tris peut être utilisée.