Technique de poly-transfection inverse optimisée à base de cellules souches embryonnaires de souris pour l’exploration rapide des ratios d’acides nucléiques

Summary

Le présent protocole décrit une méthode de poly-transfection inverse de cellules souches embryonnaires de souris pendant la culture avec des milieux 2i et LIF. Cette méthode offre une viabilité et une efficacité supérieures à celles des protocoles de transfection directe traditionnels, tout en permettant une optimisation des rapports plasmidiques en un seul pot.

Abstract

En raison de sa relative simplicité et de sa facilité d’utilisation, la transfection transitoire de lignées cellulaires de mammifères avec des acides nucléiques est devenue un pilier de la recherche biomédicale. Bien que la plupart des lignées cellulaires largement utilisées aient des protocoles robustes pour la transfection en culture bidimensionnelle adhérente, ces protocoles ne se traduisent souvent pas bien pour les lignées moins étudiées ou celles dont la morphologie est atypique et difficile à transfecter. En utilisant des cellules souches pluripotentes de souris cultivées dans un milieu 2i/LIF, un modèle de culture largement utilisé pour la médecine régénérative, cette méthode décrit un protocole de transfection inverse optimisé et rapide capable d’atteindre une plus grande efficacité de transfection. En s’appuyant sur ce protocole, une poly-transfection à trois plasmides est effectuée, tirant parti de l’efficacité supérieure à la normale dans l’administration des plasmides pour étudier une gamme élargie de stœchiométrie plasmidique. Ce protocole de poly-transfection inverse permet une méthode expérimentale en un seul pot, permettant aux utilisateurs d’optimiser les rapports plasmidiques dans un seul puits, plutôt que sur plusieurs co-transfections. En facilitant l’exploration rapide de l’effet de la stœchiométrie de l’ADN sur la fonction globale des circuits génétiques délivrés, ce protocole minimise le temps et le coût de la transfection de cellules souches embryonnaires.

Introduction

L’administration d’ADN et d’ARN dans les cellules de mammifères constitue un pilier central de la recherche biomédicale¹. Une méthode courante pour introduire des acides nucléiques exogènes (NA) dans les cellules de mammifères est la transfection transitoire ^2,3. Cette technique repose sur le mélange de NA avec des réactifs de transfection disponibles dans le commerce capables de les délivrer dans les cellules réceptrices. En règle générale, l’AN est délivré par transfection directe, où les cellules adhérant à une surface bidimensionnelle reçoivent le complexe de t....

Protocol

1. Préparation des réactifs pour la culture mPSC

1. Préparez le supplément de N2.
   1. Dans des conditions non stériles, préparer les solutions mères suivantes (étape 1.1.1.1) dans une hotte de sécurité chimique. Ajouter la poudre solide de chaque produit chimique dans un tube conique prépesé de 50 ml. Pesez chaque tube après avoir ajouté la poudre et ajoutez une quantité appropriée de solvant pour atteindre les concentrations ci-dessous. Pour un lot de médias, préparez la quantité minimale indiquée.
      REMARQUE : Les réactifs suivants sont dangereux et doivent être manipulés conformément aux directives locales de sécurité chimique. Assurez-v....

Results

Les transfections directes et inverses reposent sur l’interaction entre la membrane cellulaire et les complexes réactif de transfection entrants-ADN, permettant l’administration de NA aux cellules réceptrices. Là où ces techniques diffèrent, c’est l’état de la cellule lors de l’administration - alors que l’ADN est généralement délivré à des monocouches cellulaires adhérentes dans la transfection directe traditionnelle, la transfection inverse repose plutôt sur la rencontre du complexe réactif-ADN avec les cellules dans u.......

Discussion

L’une des principales raisons de l’adoption généralisée des protocoles de transfection est leur reproductibilité et leur accessibilité ; cependant, ces protocoles nécessitent une optimisation dans des contextes expérimentaux. Les tests standard requis lors de la première tentative de transfectation d’une nouvelle lignée cellulaire ne sont pas mentionnés ci-dessus. Tout d’abord, le choix du réactif de transfection est essentiel, car les réactifs disponibles dans le commerce ne sont pas universels et l’efficacité de la via.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase  ;	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrine  ;	Supplément MilliporeSigma	T1147-500MG
B27	ThermoFisher Scientific  ;
Bêta-mercaptoéthanol	ThermoFisher Scientific  ;
BSA fraction V (7,5 %)	Gibco	15260-037
CHIR99021  ;	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Billes de standardisation par cytométrie en flux	Spherotech	URCP-38-2K
Gélatine  ;	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplément  ;	ThermoFisher Scientific  ;
Insuline  ;	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000  ;	Invitrogen	11668-019	Réactif de transfection
Milieu neurobasal	ThermoFisher Scientific  ;
OptiMEM  ;	Invitrogen	31985-070
PD0325901  ;	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progestérone	MilliporeSigma	P8783	Risque chimique - consultez les directives de sécurité locales, assurez-vous qu’un EPI approprié est porté et travaillez avec la forme de poudre solide uniquement dans une hotte
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Risque chimique - consultez les directives de sécurité locales, assurez-vous qu’un EPI approprié est porté et travaillez avec la forme de poudre solide uniquement dans une hotte chimique
mLIFm recombinant  ;	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sélénite de sodium  ;	MilliporeSigma	S5261-25G	Risque chimique - consultez les directives de sécurité locales, assurez-vous qu’un EPI approprié est porté et travaillez avec la forme de poudre solide uniquement dans une hotte chimique
Trypsine-EDTA	ThermoFisher Scientific  ;